حيث قمت بقص المسائل: تشريح وتحليل دليل للتوجه المكاني للشبكية الماوس من معالم بصري

Summary

يوفر هذا البروتوكول دليل تشريح وتحليل شامل لاستخدام معالم العين العميقة، إيمونوهيستوتشيميستري s-أوبسين، ريتيستروكت، والتعليمات البرمجية المخصصة بدقة وموثوقية توجيه الشبكية الماوس معزولة في الفضاء التشريحية.

Abstract

دقة وموثوقية تحديد التوجه المكاني الشبكية الماوس معزولة مهم للعديد من الدراسات في علم الأعصاب البصرية، بما في ذلك تحليل كثافة وحجم التدرجات من أنواع الخلايا الشبكية، ضبط الاتجاه للاتجاه الانتقائي خلايا العقدة، ودراسة أنماط طبوغرافية الانحطاط في بعض أمراض الشبكية. ومع ذلك، هناك العديد من الأساليب المختلفة من تشريح العين ذكرت في الأدبيات التي يتم استخدامها لتحديد وتسمية التوجه الشبكية في الشبكية الماوس. بينما يتم تجاهله غالباً أسلوب التوجيه المستخدمة في هذه الدراسات، يتحدد التوجه الشبكية كيفية تقديم التقارير لا يمكن أن يسبب اختلافات في الأدب والارتباك عند محاولة لمقارنة البيانات بين الدراسات. معالم العين سطحية مثل حروق القرنية شائعة الاستخدام ولكن ثبت مؤخرا أن تكون أقل موثوقية من معالم أعمق مثل العضلات المستقيمة أو شرخ choroid التدرج s-أوبسين. هنا، نحن نقدم دليل شامل لاستخدام معالم العين العميقة بدقة تشريح وتوثيق التوجه المكاني للشبكية الماوس معزولة. لدينا أيضا مقارنة فعالية الأجسام المضادة s-أوبسين اثنين وتشمل بروتوكول إيمونوهيستوتشيميستري s-أوبسين. لأنه يتطلب التوجه الشبكية وفقا للتدرج s-opsin التعمير الشبكية مع برامج ريتيستروكت والتناوب مع تعليمات برمجية مخصصة، وقد قدمنا الخطوات الهامة اللازمة لاستخدام كل من هذه البرامج. عموما، والهدف من هذا البروتوكول هو توفير مجموعة موثوقة وقابلة للتكرار لأساليب دقيقة التوجيه الشبكية التي قابلة للتكيف للبروتوكولات التجريبية الأكثر. هدف الأسمى من هذا العمل توحيد أساليب التوجيه الشبكية للدراسات المستقبلية.

Introduction

أحد جوانب الهامة وفي بعض الأحيان يغفل علم الأعصاب الشبكية هو التوجه السليم والتحليل الشبكية الجامع-جبل معزولة، سواء كان ذلك التوجه للشبكية في دائرة تسجيل للكهربية أو على شريحة نسيجية. وهذا أهمية خاصة بالنسبة للدراسات التي تنطوي على الشبكية الماوس، الذي هو حاليا النموذج الأكثر استخداماً للتحقيقات المتعلقة بالنظام المرئي الثدييات. الاكتشافات الأخيرة تكشف عن أن الشبكية الماوس ليست موحدة مكانياً ولكن حجم وكثافة التدرجات من أنواع الخلايا الشبكية متميزة وظيفيا، مثل خلايا العقدة ميلانوبسين وخلايا العقدة OFF-ألفا عابرة ومخروط أوبسينس^{1،2 3، ،،}من⁴⁵. ونتيجة لذلك، الطريقة المستخدمة لتحديد اتجاه الشبكية قد يؤثر على النتائج التجريبية التي تنطوي على الخلية نوع أو opsin توزيعات^2،،من³⁶، ضبط الاتجاه للاتجاه الانتقائي العقدة الخلايا^7،،من⁸⁹، وأنماط طبوغرافية تنكس الشبكية^10،11،،من^1213،14 . في الواقع، يقال التوجه كيف شبكية العين الإبلاغ لا يمكن أن يسبب اختلافات في الأدب والارتباك عند محاولة لمقارنة البيانات بين الدراسات. ولذلك من المهم أن الباحثين تقرير طريقة لتحديد اتجاه الشبكية لكي يمكن تفسير نتائج هذه الدراسات بدقة.

عادة يتم تعريف التوجه الشبكية بالتهديف القرنية الظهرية والبطني والأنف أو الزمنية قبل انوكلييشن العين^1،3،،من^{1215،16،17 ،،}من¹⁸¹⁹ أو بقطع أو تلطيخ معالم العين تشريحية عميقة مثل^6،extraocular العضلات⁷، الشق المشيمية²¹من^20،، أو التدرج^2،أوبسين s³. يمكن استخدام العضلات المستقيمة لتحديد الآنف الظهرية، البطني، والزمانية الشبكية بجعل قطع تخفيف العميقة التي تقسم المرفق أما المستقيمة متفوقة، أو المستقيمة أقل شأنا أو المستقيمة الآنسي، أو العضلات المستقيمة الجانبية، على التوالي. لمعظم التجارب، باستخدام العضلات المستقيمة واحدة غير كافية لتوجيه الشبكية²². يمكن اعتبار الشق شرويد، الذي من بقايا التنمية العين، خط أفقي باهتة في الجزء الخلفي العين. كل نهاية هذا السطر ينتهي الآنف أو القطب الزماني ل العالم²³. وأخيراً، s-أوبسين التعبير دون تناسق توزع على الشبكية البطني في الفئران، و s-أوبسين الأجسام المضادة يمكن أن تكشف عن الشبكية البطني في تجارب المناعي¹.

الأعمال الأخيرة التي Stabio, et al. ²² أظهرت أن معالم العين سطحية مثل حروق القرنية طريقة أقل موثوقية لتوجيه الشبكية في الفضاء التشريحية، الأكثر احتمالاً بسبب خطأ بشري وتقلبه في جعل حرق القرنية عند استخدام الزمانية والانسي كانثي كنقاط مرجعية. على النقيض من ذلك، أظهرت معالم العميق، مثل العضلات المستقيمة متفوقة، والشق شرويد، والتدرج s-أوبسين، لتكون معالم أكثر موثوقة ودقيقة لتوجيه الشبكية²². ومع ذلك، يتطلب تحديد هذه المعالم التشريحية خطوات تشريح فريدة غير الموضحة بالتفصيل في الأدب. وهكذا، والهدف من هذا البروتوكول توفير برنامج تعليمي شامل عن كيفية استخدام العضلات المستقيمة متفوقة والشق شرويد، والتدرج s opsin لتحديد دقة التوجه المكاني الشبكية الماوس. وباﻹضافة إلى ذلك، أدرجنا مقارنة فعالية اثنين s-أوبسين الأجسام المضادة، فضلا عن بروتوكول ل immunohistochemistry s-أوبسين.

واحد تحديا إضافيا للدراسات التي تعتمد على دقة التوجه الشبكية هو التخفيضات التصريف الكبيرة المطلوبة لشد شبكية العين ووليماونت في دائرة التسجيل، طبق، أو شريحة. وهذا يمكن أن يعرض التحديات لتحليل ما هو بطبيعة الحال هيكل ثلاثي الأبعاد عند فإنه يتم تصويرها كبنية مسطحة ثنائية الأبعاد. يمكن استخدام برنامج يسمى ريتيستروكت²⁴ العودة شبكية ووليماونت مسطحة إلى هيكل ثلاثي الأبعاد قبل أن يتم تحليل البيانات التي جمعت من ذلك. وهكذا، قسم من هذا البروتوكول مكرس لتسليط الضوء على الخطوات اللازمة لاستخدام برنامج ريتيستروكت لإعادة إعمار أوبسين s إيمونوستاينيد الماوس شبكية العين. كما أدرجنا قسم من بروتوكول لاستخدام موقعنا MATLAB برنامج نصي مخصص، الذي تم تطويره لتدوير بدقة وتوجيه الماوس شبكية العين الملون مع s-أوبسين.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "جامعة أكرون".

1-استخدام المعلم العضلات المستقيمة متفوقة لتحديد اتجاه الشبكية

ملاحظة: العضلات المستقيمة متفوقة معلما للشبكية الظهرية (الجدول 1). إذا كانت التجربة لا تشترط وسم الشبكية الظهرية، تخطي الخطوة 1 وانتقل إلى الخطوة 2.

1. تتبع الخاص بك بروتوكول لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية المعتمدة للقتل الرحيم الماوس.
2. لتحديد الاتجاه العام للعالم، تجعل حرق علامة على القرنية الظهرية مباشرة بين كانتي الآنف والزمانية قرب الحدود الصلبة القرنية مباشرة بعد القتل الرحيم (الشكل 1أ). جعل الحرق وضع علامة بتسخين قلم الكي لمدة عشر ثوان ثم لمس طرف القلم للقرنية الظهرية لأقل من ثانية.
   ملاحظة: إجراء القلم الكي للقرنية لفترة طويلة جداً سوف تتسبب في الكرة الأرضية ثقب.
   ملاحظة: في حين بعض الأقلام الكي ينبعث الضوء، القلم الكي المدرجة في الجدول للمواد لا تنبعث منها أي ضوء عند تسخينها، يجعلها خياراً أمنا للتجارب داركادابتيد.
3. انوكلياتيون، استخدام الملقط منحنى لدفع العين من مأخذ التوصيل لطف وقبضة الكرة الأرضية من تحت. لا تقطع العصب البصري لإزالة الكرة الأرضية؛ بدلاً من ذلك، ببطء رفع الكرة الأرضية من مأخذ، بينما في نفس الوقت نقله بلطف من اليسار إلى اليمين حتى يتم تحرير العالم من مأخذ التوصيل.
   ملاحظة: هذا الاقتراح سيسمح العضلات المستقيمة للا تزال تعلق العالم عند العالم أخيرا إزالة تماما من مأخذ التوصيل. وسيظل العصب البصري أيضا في كثير من الأحيان المرفقة إلى أنحاء العالم.
4. نقل الكرة الأرضية مع العضلات المستقيمة المرفقة في طبق بتري يحتوي على تشريح المتوسطة. تأكد من أن تتبع فيها العين هي العين اليسرى والعين اليمنى.
   ملاحظة: يجب استخدام ديسيكتور وسيلة مناسبة تشريح محاذاة مع انتهاء البروتوكول التجريبي.
5. تحت نطاق التشريح، بصريا موقع حرق القرنية الظهرية وتحديد العضلات المستقيمة متفوقة مع الذي المرتبطة (الشكل 1أ).
6. استخدام مقص تشريح أو 20 ز (0.9 مم × 25 مم) إبرة (انظر الجدول للمواد)، ثقب القرنية عند علامة حرق. تقديم عميق تخفيف قطع في أنحاء العالم نحو العصب البصري تقسم العضلات متفوقة. ويرد شبكية معزولة وأعيد بناؤها مع هذا الخفض في الأرقام 1 باء و جيم 1.
7. -البدء في عزل الشبكية باستخدام مجموعتين من الملقط (انظر الجدول للمواد) المسيل للدموع حفرة بالثقب في الخطوة 1، 6 حتى يتم كشف جزء من شبكية العين برفق.
   ملاحظة: من المهم أن يتم ذلك بلطف، كتمزق أيضا قوة يمكن أن يسبب قطع تخفيف المسيل للدموع المزيد.
8. استخدام الملقط لندف أربا الشبكية من الصلبة العينية حتى الصلبة العينية قد أزيلت تماما. إزالة القزحية والعدسة والجسم الزجاجي وأي الهياكل المتبقية مع الملقط حتى الشبكية معزولة تماما.
   ملاحظة: قد يكون مؤقتاً في البروتوكول هنا. إذا كان النسيج لتكون ثابتة ل immunohistochemistry s opsin، تابع إلى الخطوة 3.5.

2-استخدام المعلم الشق شرويد لتحديد اتجاه الشبكية

ملاحظة: شرخ شرويد موجودة على الصلبة العينية في الجزء الخلفي العين، ويمتد من القطب الزمانية إلى القطب الآنف (الأرقام 2 2 ج؛ الجدول 1).

1. متابعة بروتوكول لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية المعتمدة للقتل الرحيم الماوس.
2. لتحديد الاتجاه العام للعالم، تجعل حرق علامة على القرنية الظهرية مباشرة بين كانثي الآنف والزمانية قرب الحدود الصلبة القرنية مباشرة بعد القتل الرحيم (الشكل 2أ). جعل الحرق وضع علامة بتسخين قلم الكي لمدة عشر ثوان ثم لمس طرف القلم للقرنية الظهرية لأقل من ثانية.
   ملاحظة: إجراء القلم الكي للقرنية لفترة طويلة جداً سوف تتسبب في الكرة الأرضية ثقب.
3. انوكليتي العين ونقل في العالم في طبق بتري يحتوي على تشريح المتوسطة. تأكد من أن تتبع فيها العين هي العين اليسرى والعين اليمنى.
   ملاحظة: يجب استخدام ديسيكتور وسيلة مناسبة تشريح محاذاة مع انتهاء البروتوكول التجريبي.
4. بصريا اكتشاف وتحديد الشق شرويد في الجزء الخلفي العين (الشكل 2ب، ج 2).
   ملاحظة: شرخ choroid مرئياً أيضا داخل فنجان العين تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء²⁰.
5. توجيه الكرة الأرضية في طبق بتري حيث أن الحرق الظهرية يقع في القطب متفوقة، كما أنه إذا كانت العين لا تزال في الماوس.
   ملاحظة: الوجود من الظهرية حرق يسمح للتعرف على الجانب الأنفي والزمانية من أنحاء العالم، وما دام هو هل عين اليمنى أو اليسرى وقد تم توثيق: إذا كان عين اليمنى، والشق شرويد الآنف سيكون حق الحرق وفي فاليز سيكون الشق شرويد l إلى اليسار للحرق. إذا كان على عين اليسرى، سيكون الشق choroid الزمنية بحق الحرق وسيكون الشق choroid الآنف إلى اليسار للحرق.
   باستخدام مقص تشريح أو 20 إبرة ز (0.9 × 25 مم) (انظر الجدول للمواد)، جعل ثقب واحد في العالم حيث يقع حرق الظهرية.
6. تجعل من تخفيف الضحلة قطع نحو العصب البصري حيث يقع حرق القرنية الظهرية. وسوف يكون هذا الخفض عمودي على الشق شرويد، مما يسمح لتحديد الهوية الشبكية الظهرية بعد عزلة (الشكل 2د).
7. إجراء تخفيضات عميقة تخفيف اثنين التالية نحو العصب البصري: واحدة ببطانة ريش التشريح المقص حتى مع الخط الزمني الشق choroid في الجزء الخلفي العين، وواحدة ببطانة ريش التشريح المقص حتى مع المشيمية الآنف خط شرخ في الجزء الخلفي العين. وترد هذه التخفيضات على شبكية معزولة وأعيد بناؤها في الشكل 2د و 2E.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، يمكن إجراء خفض عميق في الشق شرويد الزمنية ويمكن إجراء قطع ضحلة في الشق شرويد الآنف، مما يجعل حرق القرنية الظهرية قص لا لزوم لها. وهذا يسمح للتوجه دقيقة الشبكية مع التخفيضات التخفيف أقل.
8. -البدء في عزل الشبكية باستخدام مجموعتين من الملقط (انظر الجدول للمواد) المسيل للدموع حفرة بالثقب في خطوات 2.7 و 2.8 حتى يتم كشف جزء من شبكية العين برفق.
   ملاحظة: من المهم أن يتم ذلك بلطف، كتمزق أيضا قوة يمكن أن يسبب cut(s) تخفيف المسيل للدموع المزيد.
9. استخدام الملقط لندف أربا الشبكية من الصلبة العينية حتى الصلبة العينية قد أزيلت تماما. إزالة القزحية والعدسة والجسم الزجاجي وأي الهياكل المتبقية مع الملقط حتى الشبكية معزولة تماما.
   ملاحظة: قد يكون مؤقتاً في البروتوكول هنا. إذا كان النسيج لتكون ثابتة ل immunohistochemistry s opsin، تابع إلى الخطوة 3.5.

3. وصف التدرج S-أوبسين في الشبكية الماوس

ملاحظة: التعبير فوتوبيجمينت أوبسين s دون تناسق توزع إلى الشبكية البطني¹، يجعلها علامة ممتازة للنصف البطني الشبكية. هذا الأسلوب مفيد فقط لإصلاحها والأنسجة إيمونوستينيد (الجدول 1). يمكن تطبيق الخطوات التالية لشبكية العين التي قد تم تشريح باستخدام أي من الأساليب المذكورة أعلاه.

1. متابعة بروتوكول لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية المعتمدة للقتل الرحيم الماوس.
2. مباشرة بعد القتل الرحيم، انوكليتي العين ووضع العالم في طبق بتري مع تشريح المتوسطة. تأكد من أن تتبع فيها العين هي العين اليسرى والتي هي العين اليمنى بغية تحديد اتجاه الشبكية بعد أن يتم تشريح الشبكية.
   ملاحظة: يجب استخدام ديسيكتور وسيلة مناسبة تشريح محاذاة مع انتهاء البروتوكول التجريبي.
3. -البدء في عزل الشبكية باستخدام مجموعتين من الملقط (جدول المواد) المسيل للدموع ثقب في القرنية برفق حتى يتم كشف جزء من الشبكية.
   ملاحظة: من المهم أن يتم ذلك بلطف، كتمزق أيضا قوة يمكن أن يسبب الشبكية المسيل للدموع.
4. استخدام الملقط لندف أربا الشبكية من الصلبة العينية حتى الصلبة العينية قد أزيلت تماما. إزالة القزحية والعدسة والجسم الزجاجي وأي الهياكل المتبقية مع الملقط حتى الشبكية معزولة تماما.
   ملاحظة: قد يكون مؤقتاً في البروتوكول هنا. في حالة استخدام الشبكية السابقين فيفو التجربة، إجراء التجربة قبل تنفيذ الخطوات التالية.
5. باستخدام مقص التشريح، إجراء تخفيضات تخفيف أربعة في الشبكية حيث أن أنها ستقع شقة. جبل العقدة الخلية الشبكية-الجانب حتى على غشاء النيتروسليلوز (جدول المواد) عن طريق الضغط بلطف كل زاوية من الشبكية على الغشاء بالملقط.
   ملاحظة: موقع التخفيضات التخفيف يمكن أن يكون تعسفياً عند استخدام التدرج s-opsin للتوجه الشبكية.
6. استخدام الملقط، نقل الشبكية المحملة إلى البئر الأولى في لوحة 24-جيدا (جدول المواد) مليئة 1 مل بارافورمالدهيد 4% (جدول المواد) للتثبيت. ضع لوحة 24-جيدا على شاكر مداري في درجة حرارة الغرفة (جدول المواد) وإصلاح الشبكية لمدة 40 دقيقة بالضبط.
   ملاحظة: جميع الخطوات التالية الغسيل والحضانة ينبغي الانتهاء مع لوحة 24-جيدا على شاكر مداري.
7. أغسل شبكية العين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل نقلها إلى الثانية شغلها جيدا مع 1 مل من 0.1 م برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة مرتين بشكل تسلسلي نقل الشبكية إلى 0.1 مملوءة "برنامج تلفزيوني م" الثالثة والرابعة الآبار.
8. نقل الشبكية المحملة إلى الخامسة تتضمن أيضا 1 مل من عرقلة الحل (1.7 في المائة تريتون X-100 و 5.2 في المائة حمار عادي المصل في برنامج تلفزيوني م 0.1؛ انظر الجدول للمواد)، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
9. إضافة الأجسام المضادة الأساسي مكافحة--s-opsin أرنب (انظر الجدول للمواد) إلى الحل الذي حظر بتركيز 1: 500 واحتضان لمدة ثلاثة أيام في 4 درجات مئوية.
10. أغسل جسم الأولية الزائدة من الشبكية ست مرات بشكل متتالي وضعه في ستة آبار مليئة 1 مل من 0.1 م برنامج تلفزيوني لمدة كل 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
11. وضع الشبكية في بئر مع حل حظر الطازجة (1.7 في المائة تريتون X-100 و 5.2 في المائة حمار عادي المصل في برنامج تلفزيوني 0.1 M) وإضافة حمار أرنب المضادة أليكسا-594 جسم الثانوية (انظر الجدول للمواد). احتضان الشبكية مع الجسم المضاد الثانوي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
12. أغسل جسم الثانوية الزائدة من الشبكية ست مرات بشكل متتالي وضعه في ستة آبار مليئة 1 مل من برنامج تلفزيوني م 0.1 الطازجة لمدة كل 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
13. باستخدام الملقط، نقل الشبكية المحملة إلى طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني م 0.1. الإصدار الشبكية من الغشاء النيتروسليلوز عن طريق إدراج نصائح الملقط بين شبكية العين والغشاء بلطف حتى لم يعد يتم إرفاق الشبكية.
14. جبل الشبكية على شريحة الميكروسكوب زجاجية بالحث بلطف مع الملقط حتى العصي الشبكية للزجاج وإزالة الشريحة من طبق بيتري.
15. تغطية شبكية على الشريحة مع أكوامونت وتغطية ذلك مع ساترة #1.5. ضع الشريحة في علبة شريحة (انظر الجدول للمواد) والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة.
16. إعادة الشريحة إلى الثلاجة ومخزن في درج شريحة (انظر الجدول للمواد) في 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال. بعد الشريحة تم كوفيرسليبيد لمدة 24 ساعة، استخدام طلاء الأظافر لختم على جانبي الشريحة لمنع جفاف.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.

4-استخدام إعادة بنائها إيمونوستينيد شبكية العين مع أوبسين S لتحديد اتجاه الشبكية

1. تصور التدرج s-opsin مع مجهر [كنفوكل] أو مجهر ابيفلوريسسينت مع مرفق كاميرا (انظر الجدول للمواد) وصورة الشبكية حيث أن الشبكية أكمله مرئياً في صورة واحدة (1B الأرقام، 2D، 3A، و 3D). ويمكن أن يتم ذلك بتصوير الشبكية في أقسام في تضخم منخفض وثم خياطة الصور معا.
2. اسم شبكية العين حيث تكون قابلة للتحديد. على سبيل المثال، اسم الشبكية الأولى أن يكون بناؤها "Retina1".
3. تنزيل وتثبيت إيماجيج في https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
4. قم بإنشاء مجلد فردي لكل الشبكية التي تحتاج إلى إعادة بناء، ولكن ترك المجلدات الفارغة. على سبيل المثال، قم بإنشاء مجلد بعنوان "Retina1". سيتم وضع كافة الملفات المطلوبة لإعادة بناء هذه الشبكية في هذا المجلد في الخطوات اللاحقة.
   ملاحظة: يتم فقط الملفات التي يجب أن تحتوي على هذه المجلدات الملفات التي يتم تحليلها بواسطة ريتيستروكت. أية ملفات خلاف تلك المفصلة أدناه سيجعل شبكية العين غير قادر على فتح بواسطة البرنامج ريتيستروكت.
5. فتح صورة شبكية العين في إيماجيج عن طريق تحديد ملف ← فتح وثم اختيار "Retina1".
6. دون إجراء أي تغييرات على الصورة، حفظه ك "image.png" إلى المجلد بعنوان "الشبكية 1" عن طريق تحديد ملف ← "حفظ باسم" ← بابوا نيو غينيا.
   ملاحظة: يجب تسمية الملف "image.png" في الترتيب لبرنامج ريتيستروكت التعرف على الملف كشبكية لإعادة الإعمار.
7. استخدام "أداة سطر مجزأة" لتحديد حواف الشبكية. بالنقر فوق في المكانين المتاخمة على الحدود للشبكية، سيكون أداة سطر مجزأة أساسا "الربط بين النقاط" بين المكانين المتاخمة، إنشاء مخطط تفصيلي. كرر حتى وضعت الشبكية كاملة. حفظ المخطط الشبكية ك "outline.roi" إلى المجلد بعنوان "Retina1" عن طريق تحديد تحليل إضافة أدوات ← ← دوروا مدير ← ← [t] ← مزيد حفظ.
   ملاحظة: يمكن التعرف على حافة الشبكية حيث تلطيخ s-أوبسين الانتقال إلى الخلفية.
8. استخدام "أداة سطر مجزأة" كما هو موضح في الخطوة 4، 7 إلى مخطط الحدود القرص البصري. حفظ المخطط القرص البصري ك "od.roi" إلى المجلد بعنوان "Retina1" عن طريق تحديد تحليل إضافة أدوات ← ← دوروا مدير ← ← [t] ← مزيد حفظ.
   ملاحظة: القرص البصري يتم تحديدها كحفرة صغيرة في وسط الشبكية، وسوف تختلف باختلاف نوعية التشريح.
   ملاحظة: جميع الملفات المطلوبة لإعادة الإعمار ريتيستروكت ("image.png" و "outline.roi" و "od.roi") يجب الآن حفظ المجلد "Retina1".
9. لتنزيل وتثبيت وفتح البرنامج ريتيستروكت، اتبع الإرشادات المذكورة في دليل المستخدم ريتيستروكت الموجودة في قسم "المواد التكميلية" من ستيرات, et al. ²⁴
10. بمجرد ريتيستروكت وقد ظهرت النافذة، انقر فوق رمز "فتح" في الجزء العلوي الأيسر من النافذة وحدد مجلد الدليل "Retina1".
11. سوف يطفو نافذة صورة تشير إلى عدم وجود أي شريط مقياس. انقر فوق "إغلاق"، وسوف تظهر صورة الشبكية في المربع. تصور الخطوط العريضة للشبكية بواسطة النقر فوق الزر "خصائص" في الأعلى حق من النافذة وتغيير مخطط اللون للون مرئية (الشكل 5ألف).
12. هام: حدد ما إذا كانت الشبكية من العين اليمنى أو العين اليسرى في اللوحة على الجانب الأيمن (الشكل 5ألف).
13. انقر فوق الزر "إضافة الدموع" على اليسار، وحدد فيها المسيل للدموع أو قطع في الشبكية بالنقر فوق القمم الثلاث المسيل للدموع (الشكل 5ألف). وهذا خلق خطوط الاتصال القمم الثلاث من القطع. كرر كل من التخفيضات في الشبكية.
14. تحديد الشبكية الظهرية بالنقر فوق نقطة تعسفي لمخطط الشبكية. سوف يظهر حرف "د" عند هذه النقطة في المخطط (الشكل 5ب).
    ملاحظة: سيتم الشبكية الظهرية النصف أكثر قتامة من الشبكية، عكس التدرج s-أوبسين. ومع ذلك، وسم الشبكية الظهرية في ريتيستروكت ليست طريقة موثوقة لتحديد نصف الظهرية الشبكية، حيث وضع علامات على "الظهرية" يمكن أن يكون تعسفياً في هذه الخطوة.
15. إعادة البناء الشبكية بواسطة النقر فوق الزر "إعادة الشبكية" في الأعلى يسار الشاشة (الشكل 5ب). سوف تظهر مؤامرة قطبية الشبكية أعيد بناؤها مع التخفيضات التي تظهر في نفس لون المخطط التفصيلي (الشكل 5ج).
16. انقر فوق الزر "حفظ" على يمين الشاشة بحيث يتم حفظ الشبكية أعيد بناؤها، وجميع البيانات المرتبطة به في الدليل مجلد "Retina1" (الشكل 5د).
17. حفظ الشبكية أعيد بناؤها بواسطة النقر فوق الزر "قوات الدفاع الشعبي" في اللوحة اليمنى (الشكل 5د). ستظهر تسألك عن مواصفات حجم مربع. الحجم الافتراضي مقبول للخطوات التالية. سيتم حفظ هذا العمل الشبكية أعيد بناؤها ك "image.polar.pdf" في الدليل المجلد "Retina1".
18. فتح "image.polar.pdf" في برنامج الرسام (أو برنامج التلاعب بصورة أخرى)، واستخدام أداة "دلو الطلاء" (أو ما شابه ذلك) لتغيير الخلفية الشبكية أعيد بناؤها إلى الأسود. حفظ الشبكية أعيد بناؤها كملف.tif، مثل "Retina1_reconstructed.tif" في الدليل المجلد "Retina1".
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا.
19. تحميل MATLAB شفرة للتناوب الشبكية تسمى "Retina_Rotator.m" (انظر المواد التكميلية). ضع ملف التعليمات البرمجية في المجلد الخاص به مع لا الملفات الأخرى الموجودة في المجلد.
20. فتح MATLAB، الإصدار 2007 أو في وقت لاحق. انقر نقراً مزدوجاً فوق رمز الملف لفتحه في MATLAB. في الإطار "الأوامر"، اكتب "Retina_Rotator" وثم اضغط على مفتاح enter. سوف تظهر نافذة بحث.
    ملاحظة: التعليمة البرمجية المحددة لملفات.tif. التعليمات البرمجية إذا لم يكن الملف ليتم تدويرها بالشكل الصحيح، وسوف لا تدوير الشبكية بشكل صحيح. راجع الخطوات 4.17 و 4.18. لحفظ الشبكية أعيد بناؤها بالشكل السليم.
21. افتح الملف لتدويرها. على سبيل المثال، اختر "Retina1_reconstructed.tif". التعليمة البرمجية ثم تحليل الشبكية أعيد بناؤها، وسيتم تلقائياً حفظ الشبكية استدارة ك "Retina1_reconstructed_rotated.tif" في المجلد حيث يقع الملف الأصلي.
22. بعد انتهاء التعليمات البرمجية بتحليل الشبكية، كما سوف تظهر نافذة عرض صور الشبكية قبل وبعد التدوير للمقارنة (أرقام 3B و ج 3؛ أرقام 3E و 3F).
    ملاحظة: هذه التعليمات البرمجية بالتناوب الشبكية أعيد بناؤها حيث أن النصف (ألمع) البطني في الجزء السفلي والنصف (الأكثر خفوت) الظهرية على الأعلى، وبالتالي دقة توجيه الشبكية وفقا للتدرج s-أوبسين¹. في حالة ما إذا كان من شبكية العين عين اليمنى أو العين اليسرى وقد تم توثيق، يمكن استقراء موقع القطبين الآنف والزمانية أيضا من هذا الأسلوب للتوجه (الشكل 3).

النتائج

قطع تخفيف وحيدة التي تقسم العضلات المستقيمة متفوقة بدقة وبشكل موثوق يحدد الشبكية الظهرية (الشكل 1). شرخ شرويد بدقة وبشكل موثوق يحدد الشبكية الآنف والزمانية مع تخفيضات كبيرة تخفيف على طول الشق شرويد الزمنية والأنف (الشكل 2). في هذا المثال، كما أدلى قطع تخفيف في الشبكية الظهرية بغية تحديد المحور الظهرية/البطني الشبكية (الشكل 2د، سهم عمودي). تظهر الخطوات هذه العمليات للغرض من النسخ المتماثل التي dissectors مستقبلا. مزيج من إيمونوهيستوتشيميستري أوبسين s (الشكل 3 ألف و 3D)، إعادة الإعمار مع برنامج ريتيستروكت (3B، 3E) وتناوب دقيقة مع رمز MATLAB مخصص (ج 3، 3F) يسمح تعريف النصفين البطني والظهريه الشبكية، فضلا عن القطبين الآنف والزمانية إذا كان معروفا ما إذا كانت الشبكية من عين اليمنى أو اليسرى (الشكل 3). ونحن أيضا مقارنة اثنين استخداماً s-أوبسين الأجسام المضادة الأولية للفعالية في وسم الأقماع s-أوبسين (الشكل 4أ-د): كلا الماعز جسم الأساسي مكافحة--s-أوبسين والأجسام المضادة الأساسي مكافحة--s-opsin أرنب فعالية التسمية الأقماع s-أوبسين (الشكل 4ﻫ) في الماوس نفسه.

وحددت التخفيضات التخفيف على s-أوبسين إيمونوستينيد التي أعيد بناؤها شبكية العين ومواقعها وقورنت باتجاه يحدده التدرج s-أوبسين. لدينا MATLAB مخصص باستخدام التعليمات البرمجية شبكية العين (انظر المواد التكميلية)، كانت استدارة بدقة حيث أن أعلى تركيز لتلطيخ s-opsin يقع بطنيا، مما يضع صحيح الظهرية في 90 ° (المستقيمة متفوقة)، الآنف الحقيقي في 0 ° (بالنسبة للأنف شرخ شرويد) وصحيح الزمانية في 180 ° (بالنسبة للشق شرويد الزمنية). تم تحديد قيمة كل فرد تخفيف قطع زاوية باستخدام أداة زاوية في إيماجيج بعد أن كانت استدارة شبكية العين وفقا للتدرج s-أوبسين. تم حساب متوسط زاوية لكل تخفيف نوع قص ومتوسط القيمة لكل نوع من أنواع قطع تخفيف كان ثم المرسومة على مؤامرة قطبية (الشكل 6). في المتوسط، حددت التخفيضات العضلات المستقيمة متفوقة القطب الظهرية عند 96.3 ± 4.3° (n = 11) (الشكل 6). تحديد الشق شرويد الآنف القطب الآنف عند 6.7 ± 5.8 درجة والشق شرويد الزمنية المحددة القطب الزمانية في ± 172.0 درجة 4.4 (n = 9؛ الشكل 6).

رقم 1: استخدام العضلات المستقيمة متفوقة على دقة تحديد الظهرية شبكية العين اليمنى- (أ) مثال على حرق القرنية الظهرية القريبة من الحدود القرنية سكليرال مع قلم نصيحة الكي (السهم الأبيض). العضلات المستقيمة متفوقة أيضا مرئية في طريقة العرض هذه (السهم الأبيض). (ب) مثال عن كل الشبكية المحملة مع التخفيف قطع الصنع في الشبكية الظهرية التي تتوسط في العضلات المستقيمة متفوقة. سهم يصور أعماق تخفيف قطع المحرز في الشبكية الظهرية التي تتوسط في العضلات المستقيمة متفوقة. الشبكية هي ملطخة بجسم الابتدائي الماعز المضادة-s-أوبسين (انظر الجدول للمواد) والثانوي جسم حمار المضادة الماعز 594 أليكسا (انظر الجدول للمواد؛ الإثارة: 590 نانومتر؛ والانبعاثات: 620 نانومتر) (السماوي). كان تصويرها الشبكية مع مجهر ابيفلوريسسينت مع عامل تصفية "الأحمر تكساس" (595 nm). الشبكية (ج) أعيد بناؤها في ريتيستروكت، وتناوب مع تعليمات برمجية مخصصة MATLAB (انظر المواد التكميلية) مع المستقيمة متفوقة العضلات تخفيف قطع مرئية (السهم الأبيض). دال: الظهرية، الخامس: البطني، t: الزمانية، n: الآنف. تغيير حجم أشرطة = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: استخدام الشق شرويد دقة تحديد أقطاب الآنف والزمانية لشبكية العين اليمنى- (أ) مثال على حرق القرنية الظهرية القريبة من الحدود القرنية سكليرال مع قلم نصيحة الكي. (ب) المشيمية الشق مرئية على الجزء الخلفي العين على الصلبة العينية (السهم الأبيض). حرق القرنية الظهرية أيضا مرئية في طريقة العرض هذه، تقع حوالي 90° من شرخ شرويد الزمانية. (ج) المشيمية الشق مرئية على الجزء الخلفي العين على الصلبة العينية، مسافراً من العصب البصري إلى الحدود القرنية سكليرال. الشبكية (د) ملطخة بالماعز المضادة-s-أوبسين (انظر الجدول للمواد) والثانوي جسم حمار المضادة الماعز 594 أليكسا (انظر الجدول للمواد؛ الإثارة: 590 نانومتر؛ والانبعاثات: 620 نانومتر) (السماوي) مع الشق choroid التخفيضات (أفقي أسهم) وتخفيف الظهرية قص (سهم عمودي). كان تصويرها الشبكية مع مجهر ابيفلوريسسينت مع عامل تصفية "الأحمر تكساس" (595 nm). (ه) شبكية بناؤها في ريتيستروكت واستدارة مع رمز MATLAB مخصص (انظر المواد التكميلية) مع خفض تخفيف الظهرية والتخفيضات الشق choroid الآنف والزمانية مرئية (الأسهم البيضاء). دال: الظهرية، الخامس: البطني، t: الزمانية، n: الآنف. تغيير حجم أشرطة = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: استخدام التدرج s opsin لتحديد جميع أقطاب أربعة الشبكية. (أ) مثال على الشبكية تشريح من عين اليمنى الذي تم إيمونوستينيد لتسمية s-opsin وتصويرها مجهر ابيفلوريسسينت مع عامل تصفية "الأحمر تكساس" (595 nm). أن التخفيضات في هذه الشبكية التعسفي حيث يتحدد اتجاه الطوبوغرافية بالتدرج s opsin. (ب) نتائج إعادة الشبكية في ريتيستروكت. لاحظ أن التدرج s-أوبسين ليست منحازة بشكل صحيح لأنه لم يتم تشغيل الشبكية من خلال التعليمات البرمجية المخصصة MATLAB (انظر المواد التكميلية). (ج) نتائج تناوب الشبكية في A مع التعليمات البرمجية المخصصة. تم تدويرها حيث أن أعلى تركيز لتلطيخ s-أوبسين يقع في الجزء السفلي الشبكية واعتبرت الشبكية البطني. نظراً لأن شبكية العين من عين اليمنى، القطب الزمانية يقع 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة من القطب الظهرية وهو القطب الآنف يقع 90° باتجاه عقارب الساعة من القطب الظهرية. (د) مثال على الشبكية تشريح من عين اليسرى التي تم إيمونوستينيد لتسمية s-opsin وتصويرها مع عامل تصفية "الأحمر تكساس" (595 nm). أن التخفيضات في هذه الشبكية التعسفي حيث يتحدد اتجاه الطوبوغرافية بالتدرج s opsin. (ه) نتائج رقمياً إعادة الشبكية في د مع ريتيستروكت. لاحظ أن التدرج s-أوبسين ليست منحازة بشكل صحيح لأن الشبكية لا قد تم تدويرها بواسطة تعليمات برمجية مخصصة. (و) نتائج تناوب الشبكية في د مع التعليمات البرمجية المخصصة. تم تدويرها حيث أن أعلى تركيز لتلطيخ s-أوبسين يقع في الجزء السفلي الشبكية واعتبرت الشبكية البطني. نظراً لأن شبكية العين من عين اليسرى، القطب الآنف يقع 90 درجة عكس اتجاه عقارب الساعة من القطب الظهرية وهو القطب الزمانية تقع 90° باتجاه عقارب الساعة من القطب الظهرية. دال: الظهرية، الخامس: البطني، t: الزمانية، n: الآنف. تغيير حجم أشرطة = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4: مقارنة بين الأجسام الأولية s-أوبسين اثنين في وسم الأقماع s-أوبسين- الشبكية (A) A ملطخة بالأجسام المضادة الأساسي مكافحة--s-opsin الماعز (انظر الجدول للمواد). (ب) الشبكية الأخرى من الماوس نفس ملطخة بأرنب المضادة-s-opsin جسم الأولية (انظر الجدول للمواد). (ج) ممثل المنطقة (0.1 x 0.1 مم²) من شبكية الملون مع الأجسام المضادة الأساسي مكافحة--s-opsin الماعز. صورة البت مجهر ابيفلوريسسينت في 40 X التكبير. المنطقة الممثل (0.1 x 0.1 مم²) (د) من شبكية الملون مع أرنب المضادة-s-أوبسين (انظر الجدول للمواد)، بديلاً جسم الأولية. اتخذ صورة مجهر ابيفلوريسسينت في 40 X التكبير. (ﻫ) كل الأجسام المضادة تسمية نفس العدد من شرائح s-المخروط الخارجي لأنه لا يوجد أي اختلاف كبير في عدد إيمونوبوسيتيفي s-الأقماع التي ملطخة الماعز المضادة-s-أوبسين وارنب المضادة-s-أوبسين في أي من الشبكية المختبرة اتمركزيه (n = 2؛ ANOVA مع اختبار بونفيروني وظيفة المخصصة ؛ p > 0.05). تغيير حجم أشرطة = 1 مم (أ-ب)؛ 25 ميكرومتر (ج-د). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الرقم 5: دليل مرئي لاستخدام برنامج ريتيستروكت لإعادة إعمار إيمونوستاينيد شبكية العين مع s-أوبسين- الشبكية (A) A فتحه في ريتيستروكت مع المخطط التفصيلي مرئية و "الدموع" وأضاف. وترد النقاط "المسيل للدموع" مع الأسهم البيضاء فرضه. جميع التخفيضات في هذه الشبكية تعسفية، كما استخدمت لا معلما خاصا للاحتفال باتجاه الشبكية خلال التشريح. المهم يرد أزرار باللون الأحمر. (ب) الشبكية مع جميع "دموع" وأضاف والشبكية الظهرية وحدد مع "دال" على حافة الشبكية. لاحظ أن الزر "إعادة بناء شبكية العين" الآن مرئية. المهم يرد أزرار باللون الأحمر. (ج) أن عملية إعادة إعمار شبكية. سوف تظهر المؤامرة القطبية الشبكية أعيد بناؤها على الحق، تبين تخفيف إجراء تخفيضات في سماوي (الأسهم الزرقاء فرضه لتوضيح مواقع قطع). (د) النتيجة النهائية لتشغيل شبكية من خلال ريتيستروكت. الشبكية ووليمونت الأصلي لا يزال على اليسار وأعيد بناؤها الشبكية يظهر على الجانب الأيمن. التخفيضات تخفيف مرئية في سماوي (الأسهم البيضاء فرضه لتوضيح مواقع قطع). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 6: شرخ العضلات والمشيميه المستقيمة متفوقة يمكن استخدامها لتوجيه دقة الشبكية الماوس. مؤامرة قطبية من الزوايا التي تم الحصول عليها من العضلات المستقيمة متفوقة أما التخفيف من التخفيضات أو شرخ choroid التخفيضات في شبكية العين التي أعيد بناء مع ريتيستروكت. وحددت التخفيضات التخفيف على s-أوبسين إيمونوستينيد التي أعيد بناؤها شبكية العين ومواقعها وقورنت بموقع التدرج s-أوبسين. استخدام التعليمات البرمجية المخصصة MATLAB بدقة استدارة شبكية العين حيث يكون أعلى تركيز لتلطيخ s-أوبسين يقع في بطنيا، صحيح الظهرية (90° المستقيمة متفوقة)، صحيح الآنف (0° للشق شرويد الآنف) وصحيح الزمانية (180° للزمانية المشيمية شرخ) وحددت لكل الشبكية. وحسبت قيمة كل تخفيف حدة زاوية قطع مصممة في إيماجيج وزاوية متوسط لكل تخفيف نوع قص. تحديد التخفيضات العضلات المستقيمة متفوقة القطب الظهرية عند 96.3 ± 4.3° (n = 11). شرخ شرويد الآنف وحدد القطب الآنف عند 6.7 ± 5.8 درجة والشق شرويد الزمنية المحددة القطب الزمانية في 172.0 ± 4.5° (n = 9). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التاريخية العميقة	موقع حرق القرنية	القطب الشبكية المحددة	تطبيق تجريبي
متفوقة المستقيمة	الظهرية	الظهرية	يعيش أو ثابت
شرخ شرويد الآنف	الظهرية	الآنف	يعيش أو ثابت
شرخ شرويد الزماني	الظهرية	الزماني	يعيش أو ثابت
التدرج S-أوبسين	لا شيء	الظهرية، البطني، الآنف، والزمانية	ثابت

الجدول 1: معالم العميق، والقطب الشبكية وهي تحدد، وما إذا كان يمكن استخدامها لتطبيق الأنسجة الحية أو الثابتة.

Discussion

كان هناك لا بروتوكول شامل وموحد لتحديد وتصنيف اتجاه الشبكية الماوس معزولة في الفضاء التشريحية. البروتوكول بالتفصيل هنا محاولات لملء هذا الفراغ بتوحيد وتفاصيل عن كيفية استخدام المعالم التشريحية العميقة كمرجع يشير إلى موثوق بها تحديد اتجاه الشبكية. فقد ثبت أن معالم تشريحية عميقة في هذا البروتوكول يوفر طريقة أكثر دقة وموثوقية لتوجيه الشبكية الماوس من معالم سطحية مثل حروق القرنية²². وهكذا، الدراسات التي اعتمدت على حروق القرنية لاتجاه الشبكية قد يكون أخطاء أكبر في الاتجاه من الدراسات التي اعتمدت على معالم مثل العضلات المستقيمة والشق choroid. ويبرز هذا التناقض بضرورة وأهمية هذا البروتوكول الموحد فيما يتعلق بتفسير النتائج وإجراء المقارنات بين الدراسات التي تعتمد على دقة التوجه الشبكية. عموما، على بروتوكول موحد سوف توفر طريقة شائعة لرؤية الباحثين لمتابعة، وبالتالي القضاء على وجود متغير التباس في الحصول على البيانات التي قد تحدث مع استخدام أساليب غير موحدة لتحديد الشبكية التوجه.

الأساليب التي تعرض هنا بسهولة قابل للتكرار وتنطبق على العديد من أنواع البروتوكولات التجريبية. في الواقع، هو واحد من أعظم مزايا هذا البروتوكول القدرة على التكيف. نظراً لأن الشق شرويد والتعبير s-أوبسين، ومعالم العضلات المستقيمة وقد تم العثور على جميع موثوق بها تحديد اتجاه الشبكية²² يمكن أن يكون اختيار المعلم الذي يناسب المعلمات تجريبية لتحسين الحصول على البيانات (الجدول 1). بالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين أساليب التشريح بغية زيادة توضيح التوجه للشبكية. على سبيل المثال، تخفيضات الشق choroid يمكن دمجها مع s-opsin immunohistochemistry بغية توجيه جميع أقطاب أربعة الشبكية: يمكن تحديد الآنف والزمانية في نصفي الكرة الأرضية من خلال التخفيضات الشق choroid، ويمكن تحديد إيمونوهيستوتشيميستري s-أوبسين نصفي الكرة الأرضية البطني والظهري. حتى الآن، قد تكون مقيدة القدرة على التكيف لهذا البروتوكول بالطبيعة الحساسة للوقت من تجارب علم وظائف الأعضاء. لأن الوقت الذي يستغرقه لتحديد علامة بارزة وحرق القرنية وتنفيذ قطع تخفيف يمكن أن يسفر عن موت الأنسجة الهامة في تجارب السابقين فيفو ، قد تكون بعض هذه الأساليب تشريح أقل من المستوى الأمثل. لحسن الحظ، فور ديسيكتور أصبح معتاداً على الشق choroid أو أسلوب تشريح العضلات المستقيمة متفوقة، تحديد معالم العميق، وجعل تخفيف تخفيضات بسرعة يصبح جزءا من روتين تشريح ولا تقم بإضافة إلى حد كبير طول التشريح. على الرغم من أن نعترف بأن إضافة الخطوات بالتفصيل هنا في الوقت المناسب إلى تجارب حساسيتها البالغة من حيث الوقت، نقترح استخدام التدرج s-opsin للتوجه الشبكية وظيفة المخصصة عند صلاحية الأنسجة لم يعد قضية (رقم 3 ). تلطيخ الشبكية ل s opsin وسيلة فعالة لتوجيه شبكية العين، كما أنه يمكن تحديد جميع أقطاب أربعة: s-opsin تلطيخ يقسم الشبكية إلى أقطاب الظهرية والبطني ويسمح لتحديد الآنف والزمانية أعمدة تبعاً لما إذا كانت الشبكية هو من عين اليمنى أو اليسرى (الشكل 3). ولذلك، نعتقد أن هذا البروتوكول يوفر مجموعة موثوقة وقابلة للتكرار من أساليب دقيقة التوجيه الشبكية التي يمكن أن تفي بأي معلمات التجريبية.

كما مع أي تعديل تشريح الشبكية، محدودة صحة طريقة التشريح بالدقة في ديسيكتور ونوعية الأنسجة التي ظلت معزولة. إذا كان أي الأنسجة المفقودة أثناء تشريح أو شبكية هو المهترئ جداً لإعادة الإعمار دقيقة، ريتيستروكت والبرنامج MATLAB لن قادراً على إعادة بناء موثوق بها أو توجيه الشبكية. ولذلك من المهم أن ممارسة أسلوب التشريح قبل استخدامها لجمع البيانات والتجارب. في حين أوضح أنواع تشريح هنا ليست صعبة، يجب أن تمارس للتأكد من التكرار لتحديد اتجاه الشبكية مع معلما خاصا. وعلاوة على ذلك، فمن الضروري أن يتم استخدام هذه الممارسة dissector بصريا تحديد المعالم التشريحية قبل البدء في جمع البيانات للتأكد من أن التاريخي الصحيح. طريقة واحدة للتحقق من دقة ديسيكتور معين هو جعل أما الشق choroid تخفيضات أو العضلات المستقيمة متفوقة التخفيضات ومن ثم مقارنة موقع التخفيضات إلى التدرج s-أوبسين، أنه علامة ثابتة وهكذا لا تعتمد على دقة ديسيكتيو نون dissectors المحتملة أيضا مقارنة شبكية العين أعيد بناؤها إلى أمثلة عن شبكية العين أعيد بناؤها مع معلم دقيقة وترد التخفيضات في الشكل 1 و الشكل 2. أساسا، ديسيكتور محتملة يجب تنفيذ الخطوات المذكورة في هذا البروتوكول لنوع خاص تشريح، سواء أكان العضلات المستقيمة متفوقة أو المشيمية الشق الأسلوب، ومقارنة النتائج بالتدرج s opsin إثبات الصحة ديسيكتور خاصة. لأنه إذا كان ديسيكتور غير متأكد حول الموقع التاريخي، قد تترتب عليه توجه غير دقيقة للشبكية أن الإرادة، بشكل افتراضي، تؤثر على جمع البيانات وتفسيرها.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5244
Axioplan2 Epifluorescent Microscope	Zeiss	N/A
Clear Nailpolish	N/A	N/A
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker	Sigma-Aldrich	CLS6780FP
Costar TC-Treated 24-well Plates	Sigma-Aldrich	CLS3524
Dissection Microscope	Olympus	SZ51
Donkey anti-Goat Alexa 594	Life Technologies	A11058
Donkey anti-Rabbit Alexa 594	Life Technologies	A21207
Donkey Normal Serum	Millipore	566460	Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Goat anti-s-opsin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-14363	Not commerically available as of 2017
Graefe Curved Forceps	Fine Science Tools	11052-10
ImageJ or FIJI	National Institute of Health	N/A	Freely available software
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer	Bovie Medical Corporation	AA00
MATLAB	MathWorks	N/A	At least version 2007b or later
Micro Cover Glasses	VWR International	48393-241
Micro Slide Trays	VWR International	82020-913
Moira Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40
Nitrocellulose membrane	Millipore	HAWP04700
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)
PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm)	BD PrecisionGlide	305175
Pyrex Glass Petri Dish	Sigma-Aldrich	CLS3160152
R	The R Project for Statistical Computing	N/A	Freely available software; version 3.4.3 or later
Rabbit anti-s-opsin	Millipore	ABN1660
Retiga R3 Microscope Camera	Qimaging	01-RET-R3-R-CLR-14-C
Retistruct	N/A	N/A	Freely available software  compatiable with Windows 7 or Windows 10
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media	Fisher Scientific	14-390-5
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)
Vannas Spring Dissection Scissors	Fine Science Tools	15000-03
5MP USB Microscope Digital Camera	AmScope	MU500	To be used with the Olympus Dissection Microscope