Dove si taglia materia: Una dissezione e analisi guida per l'orientamento spaziale della Retina di topo da oculare luoghi d'interesse

Riepilogo

Questo protocollo fornisce una guida completa di dissezione e analisi per l'utilizzo di luoghi d'interesse profondo oculare, s-opsina immunohistochemistry, Retistruct e codice personalizzato esattamente ed attendibilmente orientare la retina di topo isolato nello spazio anatomico.

Abstract

Accurato e affidabile orientamento spaziale della retina di topo isolato l'identificazione è importante per molti studi visual Neuroscience, tra cui l'analisi della densità e dimensione gradienti di tipi di cellule della retina, la sintonizzazione di direzione della direzione-selettivo le cellule del ganglio e l'esame dei modelli topografici degenerazione in alcune malattie della retina. Tuttavia, ci sono molti metodi di dissezione oculari diversi segnalati nella letteratura che vengono utilizzati per identificare ed etichettare retinica orientamento nella retina di topo. Mentre il metodo di orientamento utilizzato in tali studi è spesso trascurato, non segnalazione orientamento come retinica è determinato può causare discrepanze nella letteratura e nella confusione quando si tenta di confrontare i dati tra gli studi. Superficiale oculare luoghi d'interesse quali le ustioni corneali sono comunemente usati, ma recentemente sono stati indicati per essere meno affidabile rispetto a punti di riferimento più profondi come i muscoli retti, la fessura Coroidea o il gradiente di s-opsina. Qui, forniamo una guida completa per l'utilizzo di luoghi d'interesse profondo oculare accuratamente sezionare e documentare l'orientamento spaziale di una retina di topo isolato. Abbiamo anche confrontato l'efficacia di due anticorpi s-opsina e incluso un protocollo per s-opsina immunohistochemistry. Perché orientamento della retina secondo il gradiente di s-opsina richiede ricostruzione retinica con software Retistruct e rotazione con codice personalizzato, abbiamo presentato i passaggi importanti necessari per utilizzare questi due programmi. Nel complesso, l'obiettivo del presente protocollo è per fornire un insieme affidabile e ripetibile di metodi per l'orientamento esatto della retina che è adattabile ai protocolli più sperimentali. Un obiettivo globale di questo lavoro è quello di standardizzare i metodi di orientamento della retina per gli studi futuri.

Introduzione

Un aspetto importante e a volte trascurato delle neuroscienze retinica è l'orientamento corretto e l'analisi della retina isolata intero-monta, sia esso l'orientamento di una retina in una camera di registrazione di elettrofisiologia o su un vetrino istologico. Ciò è particolarmente importante per gli studi che coinvolgono la retina di topo, che è attualmente il modello più utilizzato per le indagini del sistema visivo dei mammiferi. Recenti scoperte rivelano che la retina di topo non è spazialmente uniforme ma ha gradienti di densità e dimensione di tipi di cellule retiniche funzionalmente distinte, come cellule del ganglio melanopsina, le cellule del ganglio di OFF-alfa transitorie e opsine cono^{1,2 ,3,4,5}. Di conseguenza, il metodo utilizzato per determinare l'orientamento della retina può influenzare i risultati sperimentali che coinvolgono cellule tipo o opsina distribuzioni^2,3,6, direzione tuning di direzione-selettivo ganglio cellule^7,8,9e modelli topografici di degenerazione retinica^{10,11,12,13,14} . In realtà, non segnalazione orientamento come retinica è segnalato può causare discrepanze nella letteratura e nella confusione quando si tenta di confrontare i dati tra gli studi. Pertanto è fondamentale che i ricercatori riferiscono il metodo per identificare l'orientamento della retina in modo che i risultati di tali studi possono essere interpretati in modo accurato.

Orientamento della retina viene comunemente identificato segnando la cornea dorsale, ventrale, nasale o temporale prima enucleazione oculare^{1,3,12,15,16,17 ,18,19} o da taglio o macchiatura avventurare profondo anatomico occhio muscoli extraocular^6,7, coroide fissure^20,21, o s-opsina sfumatura^2,3. I muscoli retti utilizzabile per identificare le dorsali, ventrali, nasale e retina temporale facendo un taglio profondo sollievo che taglia in due il pignoramento di uno il retto superiore, retto inferiore, rectus mediale o muscolo di rectus laterale, rispettivamente. Tuttavia, per la maggior parte degli esperimenti, usando un muscolo retto è sufficiente per orientare la retina²². Fessura del coroidico, che è un residuo di sviluppo dell'occhio, può essere visto come una sottile linea orizzontale sulla parte posteriore dell'occhio. Ogni fine di questa riga termina alle vie nasali o il Polo temporale del globo²³. Infine, espressione di s-opsina assimetricamente è distribuito alla retina ventrale nei topi, e s-opsina anticorpi possono essere usati per rivelare la retina ventrale in immunohistochemical esperimenti¹.

Recenti lavori di Stabio, et al. ²² hanno dimostrato che superficiale oculare luoghi d'interesse quali le ustioni corneali sono un metodo meno affidabile per orientare la retina nello spazio anatomico, probabilmente a causa di errori umani e variabilità nel rendere l'ustione cornea quando si utilizza il temporale e mediale canthi come punti di riferimento. Al contrario, profonde luoghi d'interesse, quali il muscolo retto superiore, fenditura coroidico e il gradiente di s-opsina, hanno dimostrati di essere più affidabili e precisi punti di riferimento per orientare la retina²². Tuttavia, l'identificazione di questi punti di riferimento anatomici richiede passaggi di dissezione unici che non sono descritti in dettaglio nella letteratura. Così, l'obiettivo del presente protocollo è di fornire un tutorial completo su come usare il muscolo retto superiore, fenditura coroidico e gradiente s-opsina per identificare con precisione l'orientamento spaziale della retina di topo. Inoltre, abbiamo incluso un confronto tra l'efficacia di due anticorpi s-opsina, nonché un protocollo per s-opsina immunohistochemistry.

Un'ulteriore sfida per studi basati su preciso orientamento retinica è i grandi tagli alleviamento richiesti per appiattire le retine wholemount su una camera di registrazione, un piatto o una diapositiva. Questo può comportare alcune difficoltà per l'analisi di ciò che è naturalmente una struttura tridimensionale, quando esso è immaginata come una struttura piana bidimensionale. Un programma chiamato Retistruct²⁴ può essere utilizzato per restituire un piatto wholemount della retina alla sua struttura tridimensionale prima che i dati raccolti da esso viene analizzati. Così, una sezione di questo protocollo è dedicata a evidenziare i passaggi che sono necessari per l'utilizzo del software Retistruct per ricostruire le retine s-opsina immunostained del mouse. Abbiamo inserito anche una sezione del protocollo per l'utilizzo dei nostri script MATLAB personalizzato, che è stato sviluppato per retine accuratamente ruotare e Oriente del mouse colorate con s-opsina.

Protocollo

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di The University of Akron.

1. utilizzando il punto di riferimento del muscolo retto superiore per identificare l'orientamento della retina

Nota: Il muscolo retto superiore è un punto di riferimento per la retina dorsale (tabella 1). Se l'esperimento non richiede la marcatura della retina dorsale, ignorare il passaggio 1 e procedere al passaggio 2.

1. Seguire il protocollo istituzionale Animal Care e Comitato di uso approvato per l'eutanasia del mouse.
2. Per identificare l'orientamento generale del globo, fare un'ustione segno sulla cornea dorsale direttamente tra i canthi nasale e temporale vicino al confine di cornea-sclera immediatamente dopo l'eutanasia (Figura 1A). Fare l'ustione segno riscaldamento una penna cauterizzante per dieci secondi e poi toccando la punta della penna alla cornea dorsale per meno di un secondo.
   Nota: Tenendo che la penna di cauterio alla cornea per troppo tempo causerà il globo perforare.
   Nota: Mentre alcune penne cauterizzanti emettono luce, la penna di cauterio elencata in Tabella materiali non emette alcuna luce quando riscaldato, rendendolo una scelta sicura per esperimenti scuro-adattati.
3. Per enucleazione, utilizzare forcipe curvo per spingere l'occhio dallo zoccolo delicatamente e afferrare il globo da sotto. Non tagliare il nervo ottico per rimuovere il globo; invece, sollevare lentamente il mondo dal suo zoccolo mentre simultaneamente spostarlo delicatamente da sinistra a destra fino a quando il mondo viene rilasciato dalla presa di corrente.
   Nota: Questo movimento vi permetterà i muscoli retti rimanere attaccati al globo quando il mondo è finalmente rimosso completamente dalla presa di corrente. Il nervo ottico anche spesso rimarrà attaccato al globo.
4. Trasferire il globo con i muscoli retti collegati in una piastra Petri contenente mezzo di dissezione. Assicurarsi di tenere traccia di quale occhio è l'occhio di sinistra e che è l'occhio di destra.
   Nota: Il dissettore dovrebbe utilizzare un mezzo di dissezione appropriato che si allinea con il loro protocollo sperimentale.
5. Nell'ambito di dissezione, localizzare visivamente l'ustione cornea dorsale e identificare il muscolo retto superiore con cui è associata (Figura 1A).
6. Con le forbici di dissezione o un 20 G (0,9 mm x 25 mm) ago puntura (Vedi Tabella materiali), la cornea presso l'ustione. Fare un profondo alleviando il taglio nel globo verso il nervo ottico a bisecare il muscolo superiore. Una retina isolata e ricostruita con questo taglio è mostrata nelle figure 1B e 1C.
7. Cominciate a isolare la retina utilizzando due set di pinze (Vedi Tabella materiali) strappare delicatamente il foro fatto con la puntura nel passaggio 1.6 fino a quando è esposta parte della retina.
   Nota: È importante che questo sia fatto con delicatezza, come strappo con forza eccessiva può causare il taglio alleviamento strappare maggiori.
8. Utilizzare pinze per stuzzicare a pezzi la retina da sclera fino a quando la sclera è stato completamente rimosso. Rimuovere l'iride, cristallino, vitreo e qualsiasi strutture rimanenti con una pinza fino a quando la retina è completamente isolata.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Se il tessuto sta per essere risolto per s-opsina immunohistochemistry, continuare al punto 3.5.

2. utilizzando il punto di riferimento di coroidico fenditura per identificare orientamento retinica

Nota: La fessura coroidico è presente sulla sclera sulla parte posteriore dell'occhio e corre dal Polo temporale al Polo nasale (figure 2B e 2C; Tabella 1).

1. Seguire il protocollo istituzionale Animal Care e Comitato uso approvato per l'eutanasia del mouse.
2. Per identificare l'orientamento generale del globo, fare un'ustione segno sulla cornea dorsale direttamente tra i canthi nasale e temporale vicino al confine di cornea-sclera immediatamente dopo l'eutanasia (Figura 2A). Fare l'ustione segno riscaldamento una penna cauterizzante per dieci secondi e poi toccando la punta della penna alla cornea dorsale per meno di un secondo.
   Nota: Tenendo che la penna di cauterio alla cornea per troppo tempo causerà il globo perforare.
3. Enucleare l'occhio e trasferire il globo in una piastra Petri contenente mezzo di dissezione. Assicurarsi di tenere traccia di quale occhio è l'occhio di sinistra e che è l'occhio di destra.
   Nota: Il dissettore dovrebbe utilizzare un mezzo di dissezione appropriato che si allinea con il loro protocollo sperimentale.
4. Visivamente individuare e identificare la coroide fessura sulla parte posteriore dell'occhio (Figura 2B, C 2).
   Nota: La fessura coroidico è anche visibile all'interno del paraocchi sotto luce infra-rosso²⁰.
5. Orientare il globo in di Petri in modo che l'ustione dorsale si trova presso il polo superiore, come sarebbe se l'occhio era ancora nel topo.
   Nota: La presenza della dorsale burn permette l'identificazione del lato nasale e temporale del globo, purché si tratti di un occhio destro o sinistro è stata documentata: se è un occhio di destra, la fessura Coroidea nasale sarà a destra dell'ustione e le tempora fenditura coroidico l sarà alla sinistra dell'ustione. Se è un occhio di sinistra, la fessura Coroidea temporale sarà a destra dell'ustione e la fessura Coroidea nasale sarà alla sinistra dell'ustione.
   Con le forbici di dissezione o un 20 G (0,9 x 25mm) ago (Vedi Tabella materiali), fare una puntura nel mondo in cui si trova l'ustione dorsale.
6. Rendere un alleviamento poco profondo taglio verso il nervo ottico in cui si trova l'ustione cornea dorsale. Questo taglio sarà perpendicolare alla fenditura coroidico, che consenta l'identificazione della retina dorsale dopo l'isolamento (Figura 2D).
7. Fare i seguenti due tagli profondo sollievo verso il nervo ottico: uno allineando le lame della dissezione Forbici fino con la linea temporale coroidico fessura sulla parte posteriore dell'occhio, e uno di fodera le lame della dissezione Forbici fino con la coroide nasale linea di fenditura sulla parte posteriore dell'occhio. Questi tagli sono mostrati su una retina isolata e ricostruita in Figura 2D e 2E.
   Nota: In alternativa, un taglio profondo possa essere effettuato presso la fessura temporale coroidico e un taglio superficiale possa essere effettuato presso la fessura Coroidea nasale, rendendo l'ustione cornea dorsale tagliare inutili. Questo consente per orientamento accurato della retina con un minor numero di tagli alleviamento.
8. Cominciate a isolare la retina utilizzando due set di pinze (Vedi Tabella materiali) strappare delicatamente il foro fatto con la puntura in punti 2.7 e 2.8 fino a quando è esposta parte della retina.
   Nota: È importante che questo sia fatto con delicatezza, come strappo con forza eccessiva può causare l'alleviamento cut(s) strappare maggiori.
9. Utilizzare pinze per stuzzicare a pezzi la retina da sclera fino a quando la sclera è stato completamente rimosso. Rimuovere l'iride, cristallino, vitreo e qualsiasi strutture rimanenti con una pinza fino a quando la retina è completamente isolata.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Se il tessuto sta per essere risolto per s-opsina immunohistochemistry, continuare al punto 3.5.

3. etichettatura il gradiente di S-opsina nella Retina di topo

Nota: L'espressione di fotopigmento s-opsina assimetricamente è distribuito al retina ventrale¹, rendendolo un indicatore eccellente per la metà ventrale della retina. Questo metodo è solo utile per fisso e immunostained tessuto (tabella 1). La procedura seguente può essere applicata per le retine che sono state sezionate utilizzando uno dei metodi di cui sopra.

1. Seguire il protocollo istituzionale Animal Care e Comitato uso approvato per l'eutanasia del mouse.
2. Immediatamente dopo l'eutanasia, enucleare l'occhio e mettere il mondo in una capsula di Petri con il mezzo di dissezione. Assicurarsi di tenere traccia di quale occhio è l'occhio di sinistra e che è l'occhio di destra al fine di identificare l'orientamento della retina dopo la retina viene sezionata.
   Nota: Il dissettore dovrebbe utilizzare un mezzo di dissezione appropriato che si allinea con il loro protocollo sperimentale.
3. Cominciate a isolare la retina utilizzando due set di pinze (tabella materiali) delicatamente strappare un buco nella cornea, fino a quando è esposta parte della retina.
   Nota: È importante che questo sia fatto con delicatezza, come strappo con forza eccessiva può causare la retina a strappare.
4. Utilizzare pinze per stuzzicare a pezzi la retina da sclera fino a quando la sclera è stato completamente rimosso. Rimuovere l'iride, cristallino, vitreo e qualsiasi strutture rimanenti con una pinza fino a quando la retina è completamente isolata.
   Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Se usando la retina per un ex vivo esperimento, condurre l'esperimento prima di eseguire la procedura seguente.
5. Utilizzando le forbici di dissezione, fare quattro tagli alleviare nella retina in modo che giace piatto. Salire il retina del ganglio-lato della cellula membrana di nitrocellulosa (Tabella materiali) premendo delicatamente ogni angolo della retina sulla membrana con il forcipe.
   Nota: La posizione dei tagli alleviamento può essere arbitraria quando si utilizza il gradiente di s-opsina per orientamento della retina.
6. Usando il forcipe, trasferimento della retina montata per il primo pozzo in una piastra a 24 pozzetti (Tabella materiali) riempito con 1 mL di paraformaldeide al 4% (Tabella materiali) per il fissaggio. Collocare la piastra a 24 pozzetti su agitatore orbitale a temperatura ambiente (Tabella materiali) e fissare la retina per esattamente 40 min.
   Nota: Tutti i seguenti passaggi di lavaggio e incubazione deve essere completati con la piastra a 24 pozzetti su agitatore orbitale.
7. Lavare la retina per 15 min a temperatura ambiente di trasferirlo al secondo ben riempito con 1 mL di PBS 0.1 M. Ripetere questo passaggio due volte trasferendo in sequenza la retina dei pozzetti di terzo e quarto 0,1 M PBS-riempito.
8. Trasferire la retina montata il quinto contenente 1 mL di soluzione (1,7% Triton X-100 e 5,2% asino normale del siero in 0.1 M PBS; Vedi Tabella materiali) di blocco e incubare per una notte a 4 ° C.
9. Aggiungere l'anticorpo primario di coniglio anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali) per la soluzione bloccante ad una concentrazione di 1: 500 e incubare per tre giorni a 4 ° C.
10. Lavare l'anticorpo primario in eccesso dalla retina sei volte in sequenza collocandolo in sei pozzi riempiti con 1 mL di PBS 0.1 M per 10 minuti ciascuno, a temperatura ambiente.
11. Mettere la retina in un pozzo con fresca soluzione bloccante (1,7% Triton X-100 e 5,2% asino normale del siero in 0.1 M PBS) e aggiungere anticorpo secondario di asino anti-coniglio Alexa-594 (Vedi Tabella materiali). Incubare la retina con l'anticorpo secondario durante la notte a 4 ° C.
12. Lavare l'anticorpo secondario in eccesso dalla retina sei volte in sequenza collocandolo in sei pozzi riempiti con 1 mL di PBS di 0.1 M fresco per 10 minuti ciascuno, a temperatura ambiente.
13. Usando il forcipe, trasferire la retina montata a una piastra Petri contenente 0.1 M PBS. Rilasciare la retina dalla membrana di nitrocellulosa inserendo delicatamente le punte di pinzetta tra la retina e la membrana fino a quando la retina non è più collegata.
14. Montare la retina su un vetrino per microscopio da delicatamente lo avesse con il forcipe, fino a quando la retina si attacca al vetro e rimuovere il vetrino di Petri.
15. Coprire la retina sulla diapositiva con Lange e coprire con un vetrino coprioggetto #1.5. Porre il vetrino in un vassoio scorrevole (Vedi Tabella materiali) e lasciare riposare a temperatura ambiente per un'ora.
16. Tornare alla diapositiva il frigorifero e il negozio in un vassoio scorrevole (Vedi Tabella materiali) a 4 ° C quando non in uso. Dopo la diapositiva è stato coperti con per 24 ore, è possibile utilizzare smalto per sigillare i lati del vetrino per evitare il disseccamento.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.

4. utilizzando ricostruito retine Immunostained con S-opsina per identificare l'orientamento della retina

1. Visualizzare il gradiente di s-opsina con un microscopio confocale o un microscopio epifluorescente con un allegato di fotocamera (Vedi Tabella materiali) e immagine della retina, in modo che l'intera retina è visibile in una sola immagine (figure 1B, 2D, 3A e 3D). questo può essere fatto di imaging della retina nelle sezioni a basso ingrandimento e poi cucire insieme le immagini.
2. Nome le retine in modo siano identificabili. Ad esempio, denominare la retina prima di essere ricostruita "Retina1".
3. Scaricare e installare ImageJ all'https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
4. Creare una singola cartella per ogni retina che ha bisogno di essere ricostruito, ma lasciare le cartelle vuote. Ad esempio, creare una cartella denominata "Retina1". Tutti i file necessari per ricostruire questa retina inserirà in questa cartella nei passaggi successivi.
   Nota: Queste cartelle devono contenere solo i file sono i file che devono essere analizzati da Retistruct. Qualsiasi file diversi da quelli illustrati qui di seguito verranno farà la retina in grado di essere aperti dal software Retistruct.
5. Aprire l'immagine della retina in ImageJ selezionando File → Apri e poi scegliendo "Retina1".
6. Senza apportare modifiche all'immagine, salvarlo come "image. png" alla cartella intitolata "Retina 1" selezionando File → Salva → PNG.
   Nota: Il file deve essere denominato "image. png" per il software di Retistruct di riconoscere il file come una retina per la ricostruzione.
7. Utilizzare lo strumento linea segmentata per delineare i bordi della retina. Facendo clic su due punti adiacenti al confine della retina, lo strumento linea segmentata sarà essenzialmente "unire i puntini" tra i due punti adiacenti, creando un contorno. Ripetere fino a quando l'intera retina è stata delineata. Risparmia il contorno di retina come "outline.roi" nella cartella intitolata "Retina1" selezionando Analyze → strumenti → ROI gestione → Aggiungi [t] → altro → Salva.
   Nota: Il bordo della retina può essere identificato dove la colorazione s-opsina transizioni allo sfondo.
8. Utilizzare lo strumento linea segmentata come indicato nel passaggio 4.7 per delineare il bordo del disco ottico. Risparmia il contorno del disco ottico come "od.roi" nella cartella intitolata "Retina1" selezionando Analyze → strumenti → ROI gestione → Aggiungi [t] → altro → Salva.
   Nota: Il disco ottico è identificato come il piccolo foro al centro della retina e varia in base alla qualità della dissezione.
   Nota: Tutti i file necessari per la ricostruzione di Retistruct ("image. png", "outline.roi" e "od.roi") deve ora essere salvati nella cartella "Retina1".
9. Per scaricare, installare e aprire il programma Retistruct, seguire le istruzioni riportate nella Guida dell'utente di Retistruct trovata nella sezione materiali supplementari di Sterratt, et al. ²⁴
10. Una volta che il Retistruct è apparsa la finestra, fare clic sull'icona "Apri" nella parte superiore sinistra della finestra e selezionare la cartella della directory "Retina1".
11. Una finestra pop-up che indica che non esiste nessuna barra di scala. Fare clic su "Chiudi" e un'immagine della retina appariranno nella finestra. Visualizzare il contorno della retina facendo clic sul pulsante "Proprietà" in alto a destra del colore di contorno finestra e cambiamento da un colore visibile (Figura 5A).
12. IMPORTANTE: Specificare se la retina è da un occhio destro o sinistro occhio nel pannello a sinistra (Figura 5A).
13. Fare clic sul pulsante "Aggiungi Tear" sulla sinistra e specificare dove una lacrima o taglio è nella retina cliccando sui tre vertici dello strappo (Figura 5A). Questo creerà delle linee che collegano i tre vertici del taglio. Ripetere per tutti i tagli nella retina.
14. Specificare la retina dorsale facendo clic su un punto arbitrario della struttura retinica. Una lettera maiuscola "D" apparirà a quel punto sul contorno (Figura 5B).
    Nota: La retina dorsale sarà la metà più scura della retina, di fronte il gradiente di s-opsina. Tuttavia, la marcatura della retina dorsale in Retistruct non è un metodo affidabile per identificare la metà dorsale della retina, quindi la marcatura della "dorsale" può essere arbitraria in questo passaggio.
15. Ricostruire la retina facendo clic sul pulsante "Ricostruire la Retina" nella parte superiore sinistra della schermata (Figura 5B). Un diagramma polare della retina ricostruito apparirà con i tagli visibili dello stesso colore come la sagoma (Figura 5C).
16. Modo che la retina ricostruita e tutti i dati associati con esso viene salvato nella directory della cartella "Retina1"(Figura 5), fare clic sul pulsante "Salva" sulla destra dello schermo.
17. Salvare la retina ricostruita facendo clic sul pulsante "PDF" nel riquadro a destra(Figura 5). Una finestra apparirà chiedendo di dimensioni specifiche. La dimensione predefinita è accettabile per le fasi successive. Questa azione salverà la retina ricostruita come "image.polar.pdf" nella directory della cartella "Retina1".
18. Aprire "image.polar.pdf" in un programma di disegno (o altro programma di manipolazione di immagine) e utilizzare lo strumento "Secchiello" (o simile) per cambiare lo sfondo della retina ricostruito al nero. Salvare la retina ricostruita come un file con estensione TIF, ad esempio "Retina1_reconstructed.tif" nella directory della cartella "Retina1".
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
19. Scarica il codice MATLAB per rotazione retina chiamata "Retina_Rotator.m" (Vedi materiali supplementari). Inserire il file di codice nella propria cartella con nessun altro file nella cartella.
20. Aprire MATLAB, versione 2007b o versione successiva. Fare doppio clic sul file di codice per aprirlo in MATLAB. Nella finestra di comando, digitare "Retina_Rotator" e poi premere il tasto INVIO. Verrà visualizzata una finestra di ricerca.
    Nota: Il codice è specifico per i file con estensione TIF. Se il file deve essere ruotato non è nel formato corretto, il codice non gira correttamente la retina. Vedere i passaggi 4.17 e 4.18. per salvare la retina ricostruita nel formato corretto.
21. Aprire il file deve essere ruotato. Ad esempio, scegliere "Retina1_reconstructed.tif". Il codice quindi analizzerà la retina ricostruita e salverà automaticamente ruotata retina come "Retina1_reconstructed_rotated.tif" nella cartella dove si trova il file originale.
22. Al termine il codice analizzando la retina, inoltre verrà visualizzata una finestra, mostrando le immagini della retina prima e dopo la rotazione per confronto (figure 3B e 3C; Figure di 3E e 3F).
    Nota: Questo codice ruota la retina ricostruita in modo che la metà (più luminosa) ventrale è sul fondo e la metà (più debole) dorsale è in alto a sinistra, così accuratamente orientare la retina secondo il gradiente di s-opsina¹. Se se la retina è da un occhio di destra, o l'occhio di sinistra è stata documentata, la posizione dei poli nasali e temporali possa anche essere estrapolata da questo metodo di orientamento (Figura 3).

Risultati

Un unico taglio alleviamento che taglia in due il muscolo retto superiore esattamente ed attendibilmente identifica la retina dorsale (Figura 1). La fessura Coroidea esattamente ed attendibilmente identifica la retina nasale e temporale con alleviamento profondi tagli lungo la fessura Coroidea temporale e nasale (Figura 2). In questo esempio, un taglio alleviamento è stato fatto anche nella retina dorsale al fine di identificare l'asse dorsale/ventrale della retina (Figura 2D, freccia verticale). I passaggi di questi processi sono indicati per scopo di replica da dissettori futuri. Una combinazione di s-opsina immunohistochemistry (Figura 3A e 3D), ricostruzione con software Retistruct (3B, 3E) e la rotazione con un codice personalizzato di MATLAB (3C, 3F) permette la identificazione delle metà ventrale e dorsale della retina, come pure i poli nasali e temporali, se è noto se la retina è da un occhio destro o sinistro (Figura 3). Abbiamo anche confrontato due anticorpi primari s-opsina comunemente usati per l'efficacia della etichettatura coni s-opsina (Figura 4A-D): entrambi la capra anticorpo primario anti-s-opsina e l'anticorpo primario di coniglio anti-s-opsina efficacemente etichetta coni di s-opsina (Figura 4E) nello stesso mouse.

Alleviamento tagli sono stati identificati su retine immunostained ricostruito s-opsina e loro posizioni sono state confrontate con l'orientamento determinato dal gradiente s-opsina. Utilizzando il nostro personalizzato MATLAB codice (Vedi Materiali supplementari), retine sono state accuratamente ruotata in modo che la più alta concentrazione di s-opsina macchiatura è situata ventralmente, ponendo così vero dorsale a 90 ° (per il retto superiore), vero nasale a 0 ° (per nasale coroidico fenditura) e vero temporale (per fenditura coroidico temporale) a 180 °. Il valore di ogni individuo alleviamento angolo di taglio è stato determinato tramite lo strumento angolo ImageJ dopo le retine sono state ruotate secondo il gradiente di s-opsina. Un angolo medio è stato calcolato per ogni alleviamento tagliato tipo e il valore medio di ogni tipo di taglio allevia quindi era tracciato su un diagramma polare (Figura 6). In media, tagli di muscolo retto superiore identificato il Polo dorsale a 96,3 ± 4,3 ° (n = 11) (Figura 6). La fessura Coroidea nasale il Polo nasale a 6,7 ± 5,8 ° e identificate la fessura Coroidea temporale il Polo temporale a 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; Figura 6).

Figura 1: utilizzando il muscolo retto superiore per identificare con precisione la dorsale retina di un occhio di destra. (A) un esempio di un'ustione cornea dorsale nei pressi del confine corneale scleral fatto con una penna di punta di cauterio (freccia bianca). Il muscolo retto superiore è anche visibile in questa visualizzazione (freccia bianca). (B) un esempio di un intera retina montato con un alleviamento taglio nella retina dorsale di bisecando il muscolo retto superiore. Freccia rappresenta il profondo alleviando il taglio effettuato nella retina dorsale di bisecando il muscolo retto superiore. La retina è macchiata con anticorpo primario capra anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali) e di anticorpo secondario asino anti-capra Alexa 594 (Vedi Tabella materiali; eccitazione: 590 nm; emissione: 620 nm) (ciano). Retina era imaged con un microscopio epifluorescente con un filtro di Texas Red (595 nm). (C) A retina ricostruito in Retistruct e ruotato con un codice personalizzato di MATLAB (Vedi Materiali supplementari) con il rectus superiore muscolo relieving taglio visibile (freccia bianca). D: dorsale, v: ventrale, t: temporale, n: nasale. Scala bar = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: usando la fessura Coroidea per identificare con precisione i poli nasali e temporali della retina dell'occhio di destra. (A) un esempio di un'ustione cornea dorsale nei pressi del confine corneale scleral fatto con una penna di punta di cauterio. (B), della coroide fessura visibile sulla parte posteriore dell'occhio sulla sclera (freccia bianca). L'ustione cornea dorsale è anche visibile in questa visualizzazione, situata a circa 90° dalla fessura temporale coroidico. (C), della coroide fessura visibile sulla parte posteriore dell'occhio sulla sclera, in viaggio dal nervo ottico al confine corneale scleral. (D) una retina macchiato con capra anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali) e di anticorpo secondario asino anti-capra Alexa 594 (Vedi Tabella materiali; eccitazione: 590 nm; emissione: 620 nm) (ciano) con tagli di fenditura coroidico (orizzontale le frecce) e la dorsale alleviamento tagliato (freccia verticale). Retina era imaged con un microscopio epifluorescente con un filtro di Texas Red (595 nm). (E) una retina ricostruito in Retistruct e ruotato con un codice personalizzato di MATLAB (Vedi materiali supplementari) con il taglio di alleviamento dorsale e i tagli di nasale e temporale coroidico fenditura visibili (frecce bianche). D: dorsale, v: ventrale, t: temporale, n: nasale. Scala bar = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: utilizzando la sfumatura di s-opsina per identificare tutti i quattro poli della retina. (A), un esempio di una retina sezionato da un occhio di destra che è stato immunostained per etichettare s-opsina e imaged con un microscopio epifluorescente con un filtro di Texas Red (595 nm). I tagli in questa retina sono arbitrari poiché l'orientamento topografico è determinato dal gradiente s-opsina. (B) i risultati di ricostruire la retina in A con Retistruct. Si noti che la sfumatura di s-opsina non è allineata correttamente, perché la retina non è stata eseguita mediante il codice MATLAB personalizzato (Vedi Materiali supplementari). (C) i risultati di rotazione la retina nella A con codice personalizzato. La retina è stata ruotata in modo che la più alta concentrazione di s-opsina macchiatura si trova nella parte inferiore e identificata come retinico ventrale. Poiché la retina è da un occhio di destra, il lobo temporale è situato 90° in senso antiorario dal Polo dorsale e il Polo nasale si trova 90° in senso orario dal Polo dorsale. (D) un esempio di una retina sezionato da un occhio di sinistra che è stato immunostained per etichettare s-opsina e imaged con un filtro di Texas Red (595 nm). I tagli in questa retina sono arbitrari poiché l'orientamento topografico è determinato dal gradiente s-opsina. (E) i risultati di ricostruire digitalmente la retina in D con Retistruct. Si noti che la sfumatura di s-opsina non è allineata correttamente, perché la retina non è stata ruotata di codice personalizzato. (F) i risultati di rotazione la retina in D con il codice personalizzato. La retina è stata ruotata in modo che la più alta concentrazione di s-opsina macchiatura si trova nella parte inferiore e identificata come retinico ventrale. Poiché la retina è da un occhio di sinistra, il Polo nasale si trova 90° in senso antiorario dal Polo dorsale e il lobo temporale è situato 90° in senso orario dal Polo dorsale. D: dorsale, v: ventrale, t: temporale, n: nasale. Scala bar = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: confronto di due anticorpi primari s-opsina in etichettatura coni s-opsina. (A) A retina macchiato con l'anticorpo di capra anti-s-opsina primario (Vedi Tabella materiali). (B) altre retina dello stesso mouse macchiato con l'anticorpo primario di coniglio anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali). (C), A rappresentante regione (0,1 x 0,1 mm²) da una retina macchiato con l'anticorpo di capra anti-s-opsina primario. Immagine catturata su un microscopio epifluorescente a 40 ingrandimenti. (D), una rappresentante regione (0,1 x 0,1 mm²) da una retina macchiata di coniglio anti-s-opsina (Vedi Tabella materiali), un'alternativa di anticorpo primario. Immagine è stata scattata su un microscopio epifluorescente a 40 ingrandimenti. (E) entrambi gli anticorpi etichetta lo stesso numero di segmenti esterni s-cono perché non c'è nessuna differenza significativa nel numero di immunopositive s-coni che sono macchiati di capra anti-s-opsina e coniglio anti-s-opsina presso uno qualsiasi dei retinico testata eccentricità (n = 2; ANOVA con post hoc test di Bonferroni; p > 0.05). Scala bar = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: una guida visiva per l'utilizzo del software Retistruct per ricostruire le retine immunostained con s-opsina. (A) A retina aperti in Retistruct con il contorno visibile e una "Tear" aggiunto. Punti dello "Strappo" sono indicati con frecce bianche sovrapposte. Tutti i tagli in questa retina sono arbitrari, come nessun particolare punto di riferimento è stato utilizzato per contrassegnare retinica orientamento durante la dissezione. Tasti importanti sono delineati in rosso. (B) una retina con tutte le "Tears" aggiunto e la retina dorsale identificato con "D" sul bordo della retina. Si noti che il pulsante di "Ricostruire la Retina" è ora visibile. Tasti importanti sono delineati in rosso. (C) il processo di ricostruzione una retina. Il diagramma polare della retina ricostruita appariranno sulla destra, mostrando che l'alleviamento tagli in ciano (frecce blu sovrapposte per chiarire le posizioni di taglio). (D) il risultato finale dell'esecuzione una retina attraverso Retistruct. La retina wholemount originale rimane sulla sinistra e la retina ricostruita appare sulla destra. I tagli di scarico sono visibili in ciano (frecce bianche sovrapposte per chiarire le posizioni di taglio). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: la fessura di coroide e del muscolo di rectus superiore può essere utilizzata per orientare con precisione la retina di topo. Un diagramma polare degli angoli ottenuti da entrambi muscolo retto superiore alleviamento tagli o fenditura coroidico tagli in retine sono state ricostruite con Retistruct. Alleviamento tagli sono stati identificati su retine immunostained ricostruito s-opsina e loro posizioni sono state confrontate con la posizione della sfumatura s-opsina. Utilizzando il codice personalizzato di MATLAB per ruotare con precisione le retine in modo che la più alta concentrazione di s-opsina macchiatura è situato ventralmente, vero dorsale (90° per retto superiore), true nasale (0° per la fenditura coroidico nasale) e vero temporale (a 180° per temporale coroide fenditura) sono stati determinati per ogni retina. Il valore di ogni angolo di taglio è stata determinata in ImageJ e un angolo medio di alleviamento individuali è stato calcolato per ogni alleviamento tagliato tipo. Tagli di muscolo retto superiore identificato il Polo dorsale a 96,3 ± 4,3 ° (n = 11). La fessura Coroidea nasale il Polo nasale a 6,7 ± 5,8 ° e identificate la fessura Coroidea temporale il Polo temporale a 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Pietra miliare profondo	Posizione di ustione corneale	Polo della Retina identificato	Applicazione a titolo sperimentale
Retto superiore	Dorsale	Dorsale	Dal vivo o fisso
Fenditura coroidico nasale	Dorsale	Nasale	Dal vivo o fisso
Fenditura coroidico temporale	Dorsale	Temporale	Dal vivo o fisso
S-opsina gradiente	Nessuno	Dorsali, ventrali, nasale e temporale	Fisso

Tabella 1: Profonde punti di riferimento, il Polo della retina si identificano, e se possono essere utilizzati per applicazione diretta o fisse del tessuto.

Discussione

C' non è stato nessun protocollo completo, standardizzato per la determinazione e l'orientamento della retina di topo isolato nello spazio anatomico di etichettatura. Il protocollo dettagliato qui tenta di riempire questo vuoto standardizzando e dettagliare come utilizzare profondo anatomici come punti di riferimento in modo affidabile identificare orientamento retinica. È stato dimostrato che i profondo anatomici in questo protocollo forniscano un metodo più preciso e affidabile per orientare la retina di topo più superficiale punti di riferimento come bruciature corneali²². Così, gli studi che hanno contato sulle ustioni corneali per orientamento retinica possono avere avuto errori maggiori nell'orientamento rispetto a studi che hanno fatto affidamento su punti di riferimento quali i muscoli retti e fenditura coroidico. Questa discrepanza mette in evidenza la necessità e l'importanza di questo protocollo standardizzato per quanto riguarda l'interpretazione dei risultati e di effettuare confronti tra gli studi che dipendono da orientamento accurato della retina. Nel complesso, un protocollo standardizzato fornirà un metodo comune per i ricercatori di visione da seguire, eliminando così la presenza di una variabile di confusione nell'acquisizione di dati che può verificarsi con l'uso di metodi non standardizzati per l'identificazione della retina orientamento.

I metodi qui presentati sono facilmente ripetibile ed applicabile a molti tipi di protocolli sperimentali. Infatti, uno dei più grandi vantaggi di questo protocollo è la sua adattabilità. Perché la fenditura coroidico, espressione s-opsina e luoghi d'interesse del muscolo retto sono stati trovati per identificare in maniera affidabile orientamento retinica²² il punto di riferimento che meglio si adatta i parametri sperimentali possa essere scelti per ottimizzare l'acquisizione di dati (tabella 1). Inoltre, i metodi di dissezione possono essere combinati in modo da chiarire ulteriormente l'orientamento della retina. Ad esempio, fenditura coroidico tagli possono essere combinati con s-opsina immunohistochemistry per potersi orientare tutti i quattro poli della retina: emisferi nasali e temporali possono essere identificati dai tagli coroidico fenditura, e s-opsina immunohistochemistry può identificare emisferi ventrali e dorsali. Ancora, l'adattabilità del presente protocollo può essere vincolata dalla natura sensibili al tempo degli esperimenti di fisiologia. Poiché il tempo che necessario per identificare un punto di riferimento, fare un'ustione cornea ed eseguire un taglio alleviamento potrebbe provocare la morte di significativa del tessuto negli esperimenti ex vivo , alcuni di questi metodi di dissezione può essere meno ottimale. Fortunatamente, una volta un dissettore ha acquisire familiarità con la fenditura coroidico o il metodo di dissezione del muscolo retto superiore, individuando i punti di riferimento profondi e rendendo l'alleviamento tagli rapidamente diventano parte della routine di dissezione e non aggiungono significativamente alla lunghezza della dissezione. Anche se riconosciamo che i passaggi qui descritti possono aggiungere il tempo agli esperimenti estremamente sensibili al fattore tempo, suggeriamo di utilizzare il gradiente di s-opsina per post hoc, retinica orientamento quando la vitalità del tessuto non è più un problema (Figura 3 ). Macchiatura della retina per s-opsina è un modo efficace per orientare la retina, come può identificare tutti i quattro poli: s-opsina macchiatura divide la retina in poli dorsali e ventrali e permette l'identificazione del nasale e temporale poli a seconda che la retina è da un occhio destro o sinistro (Figura 3). Pertanto, riteniamo che questo protocollo offre un insieme affidabile e ripetibile di metodi per orientamento accurato della retina che può soddisfare qualsiasi parametri sperimentali.

Come con qualsiasi modifica per la dissezione della retina, la validità del metodo di dissezione è limitata dalla precisione del dissettore e la qualità del tessuto che è stato isolato. Se tutto il tessuto viene perso durante la dissezione o una retina è troppo danneggiata per la ricostruzione accurata, Retistruct e il programma MATLAB non sarà in grado di ricostruire in modo affidabile o di orientare la retina. Pertanto è importante praticare il metodo di dissezione prima di utilizzarlo per la raccolta di dati di esperimenti. Mentre i tipi delle dissezioni spiegato qui non sono difficili, deve essere praticati per assicurare la ripetibilità di identificare l'orientamento della retina con un particolare punto di riferimento. Inoltre, è indispensabile che la pratica di dissettore identificare visivamente i reperi anatomici prima di iniziare la raccolta dei dati per assicurarsi che il punto di riferimento corretto viene utilizzata. È un modo per verificare la precisione di un dissettore particolare per rendere entrambi fenditura coroidico tagli o muscolo retto superiore tagli e quindi confrontare la posizione dei tagli per il gradiente di s-opsina, poiché è un segno fisso e quindi non dipenda la precisione di dissectio n. potenziali dissettori possono anche confrontare le loro retine ricostruite agli esempi di retine ricostruite con punto di riferimento accurato tagli sono mostrati nella Figura 1 e nella figura 2. Essenzialmente, un dissettore potenziale deve eseguire la procedura descritta in questo protocollo per un tipo particolare di dissezione, sia esso il muscolo retto superiore o coroide fessurarsi metodo e confrontare i risultati con il gradiente di s-opsina per stabilire la validità di un dissettore di particolare. Perché se non è sicuro circa la posizione del punto di riferimento il dissettore, può provocare un orientamento impreciso della retina che sarà, per impostazione predefinita, colpiscono interpretazione e raccolta dei dati.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5244
Axioplan2 Epifluorescent Microscope	Zeiss	N/A
Clear Nailpolish	N/A	N/A
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker	Sigma-Aldrich	CLS6780FP
Costar TC-Treated 24-well Plates	Sigma-Aldrich	CLS3524
Dissection Microscope	Olympus	SZ51
Donkey anti-Goat Alexa 594	Life Technologies	A11058
Donkey anti-Rabbit Alexa 594	Life Technologies	A21207
Donkey Normal Serum	Millipore	566460	Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Goat anti-s-opsin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-14363	Not commerically available as of 2017
Graefe Curved Forceps	Fine Science Tools	11052-10
ImageJ or FIJI	National Institute of Health	N/A	Freely available software
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer	Bovie Medical Corporation	AA00
MATLAB	MathWorks	N/A	At least version 2007b or later
Micro Cover Glasses	VWR International	48393-241
Micro Slide Trays	VWR International	82020-913
Moira Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40
Nitrocellulose membrane	Millipore	HAWP04700
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)
PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm)	BD PrecisionGlide	305175
Pyrex Glass Petri Dish	Sigma-Aldrich	CLS3160152
R	The R Project for Statistical Computing	N/A	Freely available software; version 3.4.3 or later
Rabbit anti-s-opsin	Millipore	ABN1660
Retiga R3 Microscope Camera	Qimaging	01-RET-R3-R-CLR-14-C
Retistruct	N/A	N/A	Freely available software  compatiable with Windows 7 or Windows 10
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media	Fisher Scientific	14-390-5
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)
Vannas Spring Dissection Scissors	Fine Science Tools	15000-03
5MP USB Microscope Digital Camera	AmScope	MU500	To be used with the Olympus Dissection Microscope