어디 당신이 문제: 한 해 부 자르고 눈 랜드마크에서 마우스 망막의 공간적 방향에 대 한 분석 가이드

요약

이 프로토콜 하 정확 하 고 확실 하 게 해 부 공간에서 격리 된 마우스 망막 깊은 눈 랜드마크, s opsin immunohistochemistry, Retistruct, 및 사용자 지정 코드의 사용에 대 한 포괄적인 해 부와 분석 가이드를 제공 합니다.

초록

시각 신경 과학, 밀도의 분석 및 망막 세포 유형의 크기 그라디언트를 포함 하 여 많은 연구에 대 한 중요 하다 정확 하 고 안정적으로 식별 격리 된 마우스 망막의 공간적 방향 방향 선택의 방향 조정 신경 절 세포와 일부 망막 질병에 지형 변성 패턴의 시험. 그러나, 많은 다른 눈 해 부 문학에서 보고 된 사용 되는 방법이 식별 하 고 레이블을 마우스 망막에서 망막 방향 있다. 방향 등의 연구에 사용 하는 방법 자주 간과 하지 보고 어떻게 망막 방향 결정 됩니다 발생할 수 있습니다 불일치 문학과 혼란에 연구 사이의 데이터를 비교 하려고 할 때. 각 막 화상 등 피상적인 눈 랜드마크는 일반적으로 사용 하지만 최근 곧바로 근육, 맥락 막의 균열, 또는 s opsin 그라데이션 같은 깊은 랜드마크 보다 덜 신뢰할 수 표시 되었습니다. 여기, 우리는 정확 하 게 해 부하 고 격리 된 마우스 망막의 공간적 방향 문서화 깊은 눈 건축물의 사용에 대 한 포괄적인 가이드를 제공 합니다. 우리는 또한 두 s opsin 항 체의 효과 비교 하 고 s opsin immunohistochemistry에 대 한 프로토콜을 포함. S-opsin 그라데이션에 따라 망막의 Retistruct 소프트웨어와 함께 망막 재건 및 회전 사용자 지정 코드를 해야 하므로 우리 모두이 프로그램을 사용 하는 데 필요한 중요 한 단계를 제시 했습니다. 전반적으로,이 프로토콜의 목표 안정적이 고 반복 가능한 가장 실험 프로토콜에는 정확 하 게 망막 방향 위한 메서드 집합을 제공 하는. 이 작품의 지배적인 목표는 망막 방향 방법 미래 연구에 대 한 표준화입니다.

서문

망막 신경 과학의 중요 하 고 때로는 간과 측면은 전기 생리학 기록 실에서 또는 조직학 슬라이드에 망막의 방향을 적절 한 방향 및 고립 된 전체 마운트 망막의 분석 이다. 이것은 포유류 시각 시스템의 조사에 대 한 가장 널리 사용 되는 모델은 현재 마우스 망막과 관련 된 연구를 위해 특히 중요 하다. 최근의 발견 공개 마우스 망막이 공간적으로 균일 하지만 melanopsin 신경 절 세포, 과도 OFF-알파 신경 절 세포, 원뿔 opsins^{1,2 등 기능적으로 뚜렷한 망막 세포 유형의 밀도 및 크기 그라디언트는 ,3,,45}. 따라서, 망막의 방향을 결정 하는 데 사용 하는 방법 실험 결과 셀 형식 또는 opsin 배포판^2,,36을 포함을 영향을 미칠 수 방향 선택의 방향 조정 신경 절 세포^7,,89, 그리고 망막 변성^{10,,1112,13,14의 지형 패턴} . 사실, 안 보고 어떻게 망막 방향을 보고 발생할 수 있습니다 불일치 문학과 혼란에 연구 사이의 데이터를 비교 하려고 할 때. 그것은 따라서 연구팀은 이러한 연구의 결과 정확 하 게 해석 될 수 있도록 망막의 방향을 식별 하는 방법 보고.

망막 방향 일반적으로 안구 enucleation^{1,3,12,,1516,17 이전 등, 복 부, 비 강 또는 일시적인 각 막 점수 구분 ,,1819} 또는 절단 또는 깊은 해 부 눈 아 안구 근육^6,7같은 얼룩, 맥락 막 게^20,21, 또는 s-opsin 그라데이션^2,3. 곧바로 근육 식별 하는 등, 복 부, 비음, 일시적인 망막 우수한 곧바로, 열 등 곧바로, 중간 곧바로, 또는 측면 곧바로 근육, 깊은 구호 컷 하나의 첨부 파일을 양분 하 여 각각 사용할 수 있습니다. 그러나, 대부분의 실험에 대 한 하나의 곧바로 근육을 사용 하 여 망막²²방향을 위해 충분 하다. 맥락 막 게 눈 개발의 나머지는 눈의 뒤에 희미 한 가로 라인으로 볼 수 있습니다. 이 선의 각 끝 비음 또는 세계²³의 시간 극에서 종료합니다. 마지막으로, s-opsin 식 쥐, 복 부 망막에 비대칭으로 배포 되 고 s opsin 항 체 immunohistochemical 실험¹에서 복 부 망막을 사용할 수 있습니다.

최근 작품 Stabio, 외. ²² 각 막 화상 등 피상적인 눈 랜드마크는 해 부 공간, 인간의 오류 및 임시 및 중간 사용 하는 경우 각 막 화상에 변화 가능성이 높습니다에 망막 방향을 위한 덜 안정적인 방법 시연 참조 점으로 canthi입니다. 반면, 우수한 곧바로 근육, 맥락 막 균열 및 s opsin 그라데이션 같은 깊은 랜드마크 망막²²방향을 위한 더 안정적이 고 정확한 랜드마크 될 표시 되었습니다. 그러나, 이러한 해부학 적 랜드마크의 식별 문학에서 자세히 설명 되지 않은 독특한 절 개 단계를 요구 한다. 따라서,이 프로토콜의 목표는 우수한 곧바로 근육, 맥락 막 균열 및 s opsin 그라디언트를 사용 하 여 마우스 망막의 공간적 방향 정확 하 게 식별 하는 방법에 대 한 포괄적인 자습서를 제공 하는 것입니다. 또한, 우리는 두 s opsin 항 체, s opsin immunohistochemistry에 대 한 프로토콜의 효과의 비교를 포함 했다.

정확 하 게 망막 방향에 의존 하는 연구를 한 추가 도전 wholemount 망막 녹음 실, 접시, 또는 슬라이드에 병합 하는 데 필요한 큰 구호 컷입니다. 이 편평한 2 차원 구조로 군데는 무엇 인지 자연스럽 게 3 차원 구조 분석에 대 한 문제를 발생할 수 있습니다. Retistruct²⁴ 라는 프로그램 돌아갑니다 플랫 wholemount 망막의 3 차원 구조 그것에서 수집 된 데이터를 분석 하기 전에 사용할 수 있습니다. 따라서,이 프로토콜의 섹션 Retistruct 소프트웨어를 사용 하 여 s opsin immunostained 마우스 망막을 재구성 하는 데 필요한 단계를 강조 전용입니다. 우리는 또한 s opsin로 얼룩진 정확 하 게 회전 하 고 동양 마우스 망막에 개발 되었다 우리의 사용자 정의 MATLAB 스크립트를 사용 하 여 프로토콜의 섹션을 포함.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 애 크 론 대학에 의해 승인 되었습니다.

1.를 사용 하 여 우수한 곧바로 근육 랜드마크 망막 방향 식별

참고: 우수한 곧바로 근육 등 망막 (표 1)에 대 한 랜드마크입니다. 실험 등 망막의 표시를 요구 하지 않으면 1 단계를 생략 하 고 2 단계로 계속.

1. 마우스 안락사에 대 한 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜을 따릅니다.
2. 세계의 일반적인 방향을 식별, 화상을 직접 안락사 (그림 1A) 직후 각 막 공 막 국경 근처 비 강 및 임시 canthi 사이 지 각 막에 표시를 확인 합니다. 굽기로 펜 10 초간가 열 하 고 다음 두 번째 미만 등 각 막에 펜 끝을 감동 하 여 표시를 확인 합니다.
   참고: 들고 있지만 펜에 대 한 각 막에 너무 오래 펑크 세계를 일으킬 것입니다.
   참고: 일부 있지만 펜 빛을 방출 할 하는 동안 재료의 테이블에 에서 나열 된로 펜 dark-adapted 실험에 대 한 안전 옵션가 열 될 때 빛을 방출 하지 않습니다.
3. Enucleation, 곡선된 겸 자 사용 하 여 부드럽게 눈을 소켓에 밀어 그립 밑에서 세계를. 세계;를 제거 하는 시 신경 절단 하지 마십시오 대신, 천천히 들어올립니다 세계 그것의 소켓에서 동시에 움직이는 동안 부드럽게 왼쪽에서 오른쪽으로 세계는 소켓에서 뺍니다.
   참고:이 모션 곧바로 근육이 마침내 세계 소켓에서 완전히 제거 될 때 세계에 연결 된 남아 있게 됩니다. 시 신경 또한 종종 세계에 연결 된 유지 됩니다.
4. 절 개 매체를 포함 하는 페 트리 접시에 곧바로 연결 된 근육으로 전 세계를 전송 합니다. 어느 눈은 왼쪽된 눈과 오른쪽 눈은 있는지 확인 합니다.
   참고:는 것 그들의 실험 프로토콜에 정렬 한 적절 한 해 부 매체를 사용 해야 합니다.
5. 절 개 범위에서 시각적으로 지 각 막 화상 찾아서 식별과 우수한 곧바로 근육 그것은 관련 (그림 1A).
6. G (0.9 m m x 25 m m) 화상 표시에서 각 막 ( 재료의 표참조), 펑크 바늘 해 부가 위 또는 20를 사용 하 여. 뛰어난 근육을 이등분 하는 시 신경으로 세계에 컷을 덜어 깊은 확인 합니다. 이 컷을 격리 하 고 재건 망막 그림 1B 및 1 C에 표시 됩니다.
7. 부드럽게 망막의 부분 노출 될 때까지 단계 1.6에서에서 빵 꾸로 만든 구멍을 찢 어를 포 셉 ( 재료의 표참조)의 두 세트를 사용 하 여 망막을 분리 하기 시작 합니다.
   참고: 그것은 중요 한 것이 너무 강력 하 게 찢 어 서, 부드럽게 할 수 더 눈물로 덜어 잘라내기 발생할 수 있습니다.
8. 집게를 사용 하 여 애타게 떨어져는 공 막에서 망막까지 공 막 엔 완전히 제거 되었습니다. 망막은 완전히 격리 될 때까지 집게와 조리개, 렌즈, 유리, 및 모든 나머지 구조를 제거 합니다.
   참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 조직 s opsin immunohistochemistry 고정 될 것 이다, 단계 3.5 계속.

2.를 사용 하 여 맥락 막 게 랜드마크 망막 방향 식별

참고: 맥락 막 게 sclera 눈의 뒷면에 존재 하는 및 비 강 극 (그림 2B 와 2c; 임시 극에서 실행 표 1).

1. 마우스 안락사에 대 한 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜을 따릅니다.
2. 세계의 일반적인 방향을 식별, 화상을 직접 안락사 (그림 2A) 직후 각 막 공 막 국경 근처 비 강 및 임시 canthi 사이 지 각 막에 표시를 확인 합니다. 굽기로 펜 10 초간가 열 하 고 다음 두 번째 미만 등 각 막에 펜 끝을 감동 하 여 표시를 확인 합니다.
   참고: 들고 있지만 펜에 대 한 각 막에 너무 오래 펑크 세계를 일으킬 것입니다.
3. 눈을 enucleate 하 고 전송 해 부 매체를 포함 하는 페 트리 접시에 세계. 어느 눈은 왼쪽된 눈과 오른쪽 눈은 있는지 확인 합니다.
   참고:는 것 그들의 실험 프로토콜에 정렬 한 적절 한 해 부 매체를 사용 해야 합니다.
4. 시각적으로 찾아서 뒷면 (그림 2B, 2c) 눈의 맥락 막 균열을 확인 합니다.
   참고: 맥락 막 게 적외선 라이트²⁰아이피 내부 표시 이기도합니다.
5. 마우스에 여전히 눈 이라면 될 것 이라고 지 굽기는 우수한 극에 페 트리 접시에 세계 동양.
   참고:는 지 느 러 미의 존재 화상의 세계, 비 강 및 시간적 측면의 식별에 대 한 수 만큼 오른쪽 또는 왼쪽 눈 인지 문서화 되었습니다: 오른쪽 눈 이면 코 맥락 막 게 화상 및는 tempora의 오른쪽에 있을 것입니다 화상의 왼쪽 l 맥락 막 게 될 것입니다. 왼쪽된 눈 이면 시간적 맥락 막 게 화상의 오른쪽에 있을 것입니다 그리고 비 맥락 막 게 화상의 왼쪽에 있을 것입니다.
   해 부가 위 또는 20를 사용 하 여 G (0.9 x 25 m m) 등 화상은 세계에 ( 재료의 표참조) 확인 한 펑크 바늘.
6. 확인 하십시오 얕은 덜어 시 신경으로 컷 등 각 막 화상은. 이 컷 절연 (그림 2D) 후 지 망막의 식별을 위해 허용 하는 맥락 막 균열에 수직 될 것입니다.
7. 시 신경으로 다음 두 개의 깊은 덜어 삭감: 해 부의 칼 날을 줄 하나는 눈의 뒤에 시간적 맥락 막 게 라인을 위 및 해 부의 칼 날을 줄 하나를 비 맥락 막과가 위 눈의 뒷면에 게 선입니다. 이 상처는 그림 2D 와 2E고립과 재건 망막에 표시 됩니다.
   참고: 또는 시간적 맥락 막 균열에 깊은 상처를 만들 수 있습니다 하 고 불필요 한 컷 등 각 막 화상을 만드는 코 맥락 막 균열에서 얕은 상처를 만들 수 있습니다. 적은 덜어 삭감으로 망막의 정확한 방향에 대 한 수 있습니다.
8. 부드럽게 망막의 부분 노출까지 2.7 및 2.8 단계에서 빵 꾸로 만든 구멍을 찢 어를 포 셉 ( 재료의 표참조)의 두 세트를 사용 하 여 망막을 분리 하기 시작 합니다.
   참고: 그것은 중요 한 것이 너무 강력 하 게 찢 어 서, 부드럽게 할 수 더 눈물로 덜어 cut(s) 발생할 수 있습니다.
9. 집게를 사용 하 여 애타게 떨어져는 공 막에서 망막까지 공 막 엔 완전히 제거 되었습니다. 망막은 완전히 격리 될 때까지 집게와 조리개, 렌즈, 유리, 및 모든 나머지 구조를 제거 합니다.
   참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 조직 s opsin immunohistochemistry 고정 될 것 이다, 단계 3.5 계속.

3. 라벨 마우스 망막에 S opsin 그라데이션

참고: s-opsin photopigment 식 비대칭으로 복 부 망막¹, 망막의 복 부 절반에 대 한 우수한 마커 만들기 배포 됩니다. 이 메서드는만 고정 및 immunostained 조직 (표 1). 다음 단계는 상기 방법 중 하나를 사용 하 여 해 부 되어 있는 망막에 적용할 수 있습니다.

1. 마우스 안락사에 대 한 승인된 기관 동물 관리 및 사용 위원회 프로토콜을 따릅니다.
2. 안락사, 직후 눈을 enucleate 하 고 세계 해 부 매체와 페 트리 접시에 놓습니다. 어느 눈은 왼쪽된 눈과 오른쪽 눈 망막 해 부 후 망막 방향 식별입니다 있는지 확인 합니다.
   참고:는 것 그들의 실험 프로토콜에 정렬 한 적절 한 해 부 매체를 사용 해야 합니다.
3. 망막의 부분 노출 될 때까지 부드럽게 각 막에 구멍을 찢을 집게 (자료 테이블)의 두 세트를 사용 하 여 망막을 시작 합니다.
   참고: 그것은 중요 한 것이 너무 강력 하 게 찢 어 서, 부드럽게 할 수 눈물로 망막을 발생할 수 있습니다.
4. 집게를 사용 하 여 애타게 떨어져는 공 막에서 망막까지 공 막 엔 완전히 제거 되었습니다. 망막은 완전히 격리 될 때까지 집게와 조리개, 렌즈, 유리, 및 모든 나머지 구조를 제거 합니다.
   참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 사용 하 여 망막은 ex vivo 실험 하는 경우 다음 단계를 수행 하기 전에 실험을 실시 합니다.
5. 해 부가 위를 사용 하 여 할 망막에 4 구호 상처 그래서 평평 거짓말 것입니다. 집게와 막에 망막의 각 모서리를 부드럽게 눌러 니트로 막 (자료 테이블)에 최대 망막 신경 절 세포 쪽 탑재 합니다.
   참고: 완화 상처의 위치 수 임의 망막 방향에 대 한 s opsin 그라디언트를 사용 하 여.
6. 집게를 사용 하 여 전송 탑재 망막 24-잘 접시 (자료 테이블)의 첫 번째 잘 가득 1 mL 4 %paraformaldehyde (자료 테이블)의 고정을 위한. 실내 온도 (자료 테이블)에 궤도 통에 24-잘 접시를 놓고 40 분 정확 하 게 망막을 수정 합니다.
   참고: 모든 다음 세척 및 인큐베이션 단계 궤도 통에 24-잘 접시와 함께 완료 되어야 한다.
7. 잘 1 mL의 0.1 M PBS 가득한 두 번째 그것을 전송 하 여 실 온에서 15 분 동안 망막을 씻어. 두 번 순차적으로 0.1 M PBS 가득 세 번째 및 네 번째 우물에 망막을 전송 하 여이 단계를 반복 합니다.
8. 차단 솔루션 (1.7% 트라이 톤 X-100 그리고 5.2% 당나귀 정상 혈 청 0.1 M PBS에, 참조 테이블의 재료)의 다섯 번째 잘 포함 1 mL에 탑재 된 망막을 전송 하 고 하룻밤 4 ° c.에 품 어
9. 토끼 반-s-opsin 1 차적인 항 체를 추가 ( 재료의 표참조) 1: 500의 농도에 차단 솔루션 및 4 ° c.에 3 일 동안 품 어
10. 순차적으로 각 실 온에서 10 분 동안 1 mL의 0.1 M PBS 가득한 6 우물에 그것을 배치 하 여 망막에서 초과 1 차적인 항 체 6 번을 씻어.
11. 망막에 신선한 차단 솔루션 (1.7% 트라이 톤 X-100 그리고 5.2% 당나귀 정상 혈 청 0.1 M PBS에) 잘 놓고 당나귀 안티 토끼 알 렉 사-594 이차 항 체를 추가 ( 재료의 표참조). 4 ° c.에 하룻밤 이차 항 체와 망막을 품 어
12. 순차적으로 각 실 온에서 10 분 동안 신선한 0.1 M PBS의 1 mL 가득 6 웰 스에 배치 하 여 망막에서 초과 이차 항 체 6 번을 씻어.
13. 0.1 m M PBS를 포함 하는 배양 접시에 탑재 된 망막을 전송 집게를 사용 하 여. 망막 이상 연결 될 때까지 부드럽게 망막 사이의 막 집게의 끝을 삽입 하 여 니트로 막에서 망막을 놓습니다.
14. 부드럽게 망막 유리에 붙어 때까지 집게와 괴롭히는 여 유리 현미경 슬라이드에 망막을 탑재 하 고 페 트리 접시에서 슬라이드를 제거 합니다.
15. Aquamount와 함께 슬라이드에 망막을 커버 하 고 #1.5 coverslip로 그것을 커버. 슬라이드 슬라이드 트레이에 배치 ( 재료의 표참조) 하 고 실 온에서 한 시간 동안 앉아.
16. 냉장고와 저장소 슬라이드 트레이에서 슬라이드 돌아가기 ( 재료의 표참조) 사용에 4 ° C에서. 후 슬라이드 coverslipped 24 시간 동안, 매니큐어를 사용 하 여 건조를 방지 하기 위해 슬라이드의 측면을 봉인.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.

4. 사용 하 여 재건 S-opsin 망막 방향 식별 하와 망막 Immunostained

1. Confocal 현미경 또는 카메라 부착을 가진 epifluorescent 현미경 s opsin 그라데이션 시각화 ( 재료의 표참조)는 망막 전체 망막은 하나의 이미지(그림 1B, 2D, 3A, 및 에서에서 볼 수 있도록 이미지 3D). 이것은 낮은 확대 섹션에서 망막을 상상 하 고 다음 이미지를 함께 바느질 하 여 행 해질 수 있다.
2. 그래서 그들은 식별 된 망막을 이름을 지정 합니다. 예를 들어, 이름을 수 첫 번째 망막 재건 "Retina1".
3. 다운로드 및 https://imagej.nih.gov/ij/download.html에 ImageJ를 설치.
4. 개축 될 하지만 폴더를 비워 각 망막에 대 한 개별 폴더를 만듭니다. 예를 들어 "Retina1" 라는 폴더를 만듭니다. 이 망막을 재구성 하는 데 필요한 모든 파일은 이후 단계에서이 폴더에 배치 됩니다.
   참고:이 폴더 포함 해야 유일한 파일은 Retistruct에 의해 분석할 파일. 아래 열거 하는 이외의 모든 파일 Retistruct 소프트웨어에서 열 수 없는 망막을 만들 것입니다.
5. 파일을 선택 하 여 ImageJ에 망막의 이미지를 엽니다 → "Retina1" 선택 하 고 열기.
6. 이미지를 지금 변경 하지 않고 "image.png" 폴더 제목으로 저장 "망막" 파일 → 다른 이름으로 저장 → PNG를 선택 하 여 1.
   참고: 파일 "image.png" 재건에 대 한 망막으로 인식 하도록 Retistruct 소프트웨어에 대 한 순서로 선정 해야 합니다.
7. 세그먼트 선 도구를 사용 하 여 망막의 가장자리를 대략적으로. 망막의 테두리에서 두 개의 인접 한 관광 명소를 클릭 하 여 세그먼트 선 도구는 기본적으로 "" 윤곽을 만드는 두 개의 인접 한 관광 명소 사이의 점 들을 연결 것입니다. 전체 망막 설명 될 때까지 반복 합니다. 망막 개요 분석을 선택 하 여 "Retina1" 라는 폴더에 "outline.roi"로 저장 → 도구 → ROI 관리자 → [t] → 저장 →를 추가 합니다.
   참고: 망막의 가장자리 식별할 수 있습니다 어디 배경 전환 s opsin 얼룩.
8. 광학 디스크의 테두리 개요 세그먼트 선 도구 단계 4.7에서에서 지시 하는 대로 사용 합니다. 광학 디스크 개요 분석을 선택 하 여 "Retina1" 라는 폴더에 "od.roi"로 저장 → 도구 → ROI 관리자 → [t] → 저장 →를 추가 합니다.
   참고: 광학 디스크 망막, 중간 작은 구멍으로 식별 되 고 해 부의 품질에 따라 달라 집니다.
   참고: Retistruct 개조 ("image.png", "outline.roi", 및 "od.roi")에 필요한 파일을 모두 해야 이제 저장 폴더 "Retina1".
9. 다운로드, 설치, 및 Retistruct 프로그램, Sterratt, 그 외 의 보충 자료 섹션에서 Retistruct 사용자 가이드에 설명 된 지침에 따라 ²⁴
10. 창 등장 했다 Retistruct 클릭 상단에 있는 "열기" 아이콘 창의 왼쪽 하 고 "Retina1" 디렉터리 폴더를 선택 합니다.
11. 이미지 창 없음 눈금 막대 있는지 나타내는 나타납니다. "닫기"를 클릭 하 고 망막의 이미지 상자에 나타납니다. 상단에 있는 "속성" 버튼을 클릭 하 여 망막의 개요를 시각화 표시 색상 (그림 5A) 창 및 변경 윤곽선 색의 오른쪽.
12. 중요: 오른쪽 눈 또는 (그림 5A) 왼쪽에 있는 패널의 왼쪽된 눈에서 망막 인지 지정 합니다.
13. 왼쪽에 있는 "눈물 추가" 버튼을 클릭 하 고 눈물 또는 커트가 망막 눈물 (그림 5A)의 세 꼭지점을 클릭 하 여 지정 합니다. 이 컷의 세 꼭지점을 연결 하는 선을 만듭니다. 망막에 모든 상처에 대 한 반복 합니다.
14. 등 쪽 망막 망막 개요의 임의의 지점에 클릭 하 여 지정 합니다. 대문자 "D"는 (그림 5B) 개요에 그 시점에서 표시 됩니다.
    참고: 등 망막 s opsin 그라디언트 반대 망막의 어두운 반 될 것입니다. 그러나, Retistruct에 지 망막 표시 아니다 "등"의 표시가이 단계에서 임의의 수는 망막의 등 절반을 식별 하는 신뢰할 수 있는 방법.
15. 화면 (그림 5B)의 왼쪽 상단에 "재구성 망막" 버튼을 클릭 하 여 망막을 재구성 합니다. 재건축된 망막의 극 작 인하 개요 (그림 5C)와 같은 색상에 표시와 함께 표시 됩니다.
16. 재건축된 망막과 관련 된 데이터의 모든 "Retina1" 폴더 디렉터리 (그림 5D)에 저장 되도록 화면의 오른쪽에 있는 "저장" 버튼을 클릭 합니다.
17. 오른쪽 패널 (그림 5D)의 "PDF" 버튼을 클릭 하 여 복원된 망막을 저장 합니다. 상자 크기 사양에 대 한 묻는 나타납니다. 기본 크기는 다음 단계에 대 한 허용. 이 작업은 "Retina1" 폴더 디렉터리에 "image.polar.pdf"로 재건된 망막을 저장 됩니다.
18. 그림판 프로그램 (또는 기타 이미지 처리 프로그램)에서 "image.polar.pdf"를 열고 "페인트 통" 도구를 사용 하 여 (또는 유사한) 검정 재건된 망막의 배경을 변경 하려면. "Retina1_reconstructed.tif" "Retina1" 폴더 디렉터리에 같은.tif 파일로 복원된 망막을 저장 합니다.
    참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
19. 회전 하는 "Retina_Rotator.m" (보충 자료 참조) 라고 하는 망막에 대 한 MATLAB 코드를 다운로드 합니다. 폴더에 다른 파일 코드 파일을 자체 폴더에 놓습니다.
20. MATLAB, 버전 2007b 열 이상. MATLAB에서 그것을 여는 코드 파일에 더블 클릭. 명령 창에서 "Retina_Rotator"를 입력 한 다음 enter 키를 누르십시오. 검색 창이 나타납니다.
    참고:이 코드는 특정.tif 파일에 대 한. 회전 파일 올바른 형식에 없는 경우 코드는 회전 하지 망막 올바르게. 4.17-4.18 단계를 참조 하십시오. 위해 적절 한 형태로 복원 된 망막을 저장.
21. 회전을 파일을 엽니다. 예를 들어 "Retina1_reconstructed.tif"를 선택 하십시오. 코드 다음 복원된 망막 분석 하 고 자동으로 원본 파일이 있는 폴더에 "Retina1_reconstructed_rotated.tif"로 회전된 망막을 저장 합니다.
22. 망막 분석 코드가 완료 된 후 창이 나타납니다 이전과 비교 (그림 3B 와 3 C;에 대 한 회전 후 망막의 이미지를 보여주는 3E 피 규 어 및 3 층).
    참고:이 코드는 바닥에 복 부 (밝은) 절반은 고 등 (흐릿한) 절반은 따라서 정확 하 게 방향을 s opsin 그라데이션¹에 따라 망막 위에 재건된 망막을 회전 합니다. 만약 여부 망막에서 오른쪽 눈은 왼쪽된 눈 문서화 되었습니다, 비 강 및 일시적인 극의 위치는 또한 방향 (그림 3)의이 방법에서 추정 수 있습니다.

결과

정확 하 고 확실 하 게 우수한 곧바로 근육을 양분 하는 하나의 구호 컷 등 쪽 망막 (그림 1)를 식별 합니다. 맥락 막 게 정확 하 고 안정적으로 시간적 및 비 강 맥락 막 균열 (그림 2)에 따라 깊은 구호 상처와 비 강 및 일시적인 망막을 식별합니다. 이 예제에서는 구호 컷도 했다 등 망막에 식별 (그림 2D, 수직 화살표) 망막의 등/복 부 축. 이 프로세스의 단계는 미래 dissectors에 의해 복제의 목적을 위해 표시 됩니다. S-opsin immunohistochemistry의 조합 (그림 3A 및 3D), Retistruct 소프트웨어 (3B, 3E)와 개조와 사용자 지정 MATLAB 코드 (3 C, 3 층)와 함께 정확한 회전 수는 비 강 및 일시적인 극 알려져 있다 (그림 3) 오른쪽 또는 왼쪽 눈에서 망막 인지 하는 경우는 망막의 복 부와 등 쪽으로 식별. 우리는 또한 라벨 s opsin 콘 (그림 4A-D)에 효과 대 한 두 가지 일반적으로 사용 되는 s opsin 기본 항 체 비교: 두 염소 안티-s-opsin 기본 항 체와 토끼 안티-s-opsin 1 차적인 항 체 효과적으로 라벨 동일한 마우스에서 s opsin 콘 (그림 4E)

덜어 컷 s opsin immunostained 재건 망막에 발견 했다 하 고 그들의 위치 s opsin 그라데이션에 의해 결정 하는 방향으로 비교 했다. 우리의 사용자 정의 MATLAB를 사용 하 여 코드 ( 보충 자료참조), 망막 s opsin 얼룩의 높은 농도 ventrally, 따라서 진정한 배치 되도록 회전 정확 하 게 했다 (대 한 우수한 곧바로) 90 °, 0 ° (코에서 진정한 코 등 맥락 막 게) 180 ° (시간적 맥락 막 게)에서 임시 진정한. 각도 잘라 덜어 각각의 값은 후 망막 s opsin 그라데이션에 따라 회전 했다 ImageJ의 각 도구를 사용 하 결정 했다. 각 구호 컷 유형 평균 각도 계산 하 고 각 구호 컷된 타입의 평균 값 다음 극좌표 플롯 (그림 6)에 표시 했다. 평균적으로, 우수한 곧바로 근육 상처 확인 96.3 ± 4.3 °에 지 극 (n = 11) (그림 6). 비 강 맥락 막 게 식별 6.7 ± 5.8 °에서 비 강 극 하 고 시간적 맥락 막 게 식별 172.0 ± 4.4 °에 측 두 엽 극 (n = 9; 그림 6)입니다.

그림 1: 우수한 곧바로 근육을 사용 하 여 정확 하 게 식별 하는 오른쪽 눈의 등 쪽 망막에. (A)로 팁 펜 (흰색 화살표)로 만든 scleral 각 막 국경 근처 등 각 막 화상의 예. 우수한 곧바로 근육이이 보기 (흰색 화살표)에 표시 이기도합니다. (B)는 전체 예는 구호와 함께 탑재 된 망막 잘라 우수한 곧바로 근육을 양분 하 여 등 쪽 망막에 만든. 화살표 등 망막에 우수한 곧바로 근육을 양분 하 여 만든 컷을 덜어 깊은 묘사. 망막은 1 차적인 항 체 염소 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조) 및 이차 항 체 당나귀 안티 염소 알 렉 사 594 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 여기: 590 nm; 방출: 620 nm) (청록색). 망막은 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데 (595 nm). (C) A 망막 Retistruct 재건축 및 MATLAB 코드를 사용자 정의 회전 ( 보충 자료참조)는 우수한 곧바로 근육을 덜어 볼 수 컷 (흰색 화살표)와 함께. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2: 오른쪽 눈의 망막의 비 강 및 시간 폴란드를 정확 하 게 식별 하는 맥락 막 게를 사용 하 여. (A)로 팁 펜으로 만든 scleral 각 막 국경 근처 등 각 막 화상의 예. (B)는 맥락 막 게 sclera (흰색 화살표)에 눈의 뒤에 보이는. 등 각 막 화상 또한 시간적 맥락 막 균열에서 약 90 °에 위치한이 보기에 표시 됩니다. Scleral 각 막 경계에 시 신경에서 여행 sclera 눈의 뒷면에 표시 (C) 맥락 막의 균열. (D) A 망막 염소 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조) 및 이차 항 체 당나귀 안티 염소 알 렉 사 594 ( 테이블의 자료를 참조 하십시오 여기: 590 nm; 방출: 620 nm) 맥락 막 게 인하 (가로 (녹청) 화살표) (수직 화살표)를 잘라 등 완화. 망막은 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데 (595 nm). (E)는 망막 Retistruct에 재건 된 고 등 구호 컷와 비 강 및 시간적 맥락 막 게 컷 표시 (흰색 화살표) 사용자 지정 MATLAB 코드 (보충 자료 참조)와 함께 회전. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3: s-opsin 그라디언트를 사용 하 여 망막의 모든 4 개의 기둥을 식별 하. (A)는 망막의 예는 오른쪽 눈 immunostained s opsin 레이블이 되었으며 텍사스 레드 필터 epifluorescent 현미경으로 몇 군데에서 해 부 (595 nm). 이 망막에 상처는 임의 지형 방향 s opsin 그라데이션에 의해 결정 됩니다. (B) Retistruct와 A에 망막을 재구성의 결과. 그 s opsin 그라데이션 올바르게 정렬 되지 망막 사용자 지정 MATLAB 코드 ( 보충 자료참조)를 통해 실행 하지 않은 때문에 알 수 있습니다. (C) 회전 하는 사용자 지정 코드 A에서 망막의 결과. 망막은 s opsin 얼룩의 높은 농도 하단에 회전 하 고 복 부 망막으로 식별. 오른쪽 눈에서 망막 이므로 일시적인 극은 지 느 러 미 극에서 시계 반대 방향으로 위치 90 ° 이며 비 극 위치 90 ° 등 극에서 시계 방향으로. (D)는 망막의 예 s opsin 라벨 immunostained 되었으며 텍사스 레드 필터 몇 군데 왼쪽된 눈에서 해 부 (595 nm). 이 망막에 상처는 임의 지형 방향 s opsin 그라데이션에 의해 결정 됩니다. (E) 디지털 d Retistruct와 망막을 재구성의 결과. 그 s opsin 그라데이션 올바르게 정렬 되지 때문에 망막에는 사용자 지정 코드에 의해 회전 되지 알 수 있습니다. (F) 사용자 지정 코드와 함께 d에서 망막 회전의 결과. 망막은 s opsin 얼룩의 높은 농도 하단에 회전 하 고 복 부 망막으로 식별. 왼쪽된 눈에서 망막 이므로 코 극 위치 90도 시계 반대 방향으로 지 느 러 미 극에서 이며 일시적인 극 등 극에서 시계 방향으로 위치한 90 ° 이다. D: 등, v: 복 부, t: 시간, n: 비음. 스케일 바 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4: 라벨 s opsin 콘에서 두 개의 기본 s opsin 항 체의 비교. (A) A 망막 염소 안티-s-opsin 1 차적인 항 체 물 ( 재료의 표참조). (B) 같은 마우스의 다른 망막 토끼 항 체 안티-s-opsin 기본으로 물 ( 재료의 표참조). (C) A 대표 지역 (0.1 x 0.1 m m²) 염소 안티-s-opsin 1 차 항 체로 얼룩진 망막에서. 40 X 확대 epifluorescent 현미경에 찍은 이미지. (D) A 대표 지역 (0.1 x 0.1 m m²)는 망막에서 토끼 안티-s-opsin 물 ( 재료의 표참조), 기본 항 체 대체. 이미지는 40 X 확대 epifluorescent 현미경에서 촬영 됐다. (E) 두 항 체의 콘 외부 세그먼트의 동일한 수 라벨 immunopositive s-콘은 염소 안티-s-opsin와 토끼 안티-s-opsin 테스트 망막에서 스테인드 수에 상당한 차이가 있기 때문에 기발 (n = 2; ANOVA와 임시 게시 Bonferroni 테스트; p > 0.05). 스케일 바 = 1 mm (A-B); 25 µ m (C-D) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 5: 망막 immunostained s opsin로 재구성 하는 Retistruct 소프트웨어를 사용 하는 비주얼 가이드. (A) A 망막 표시 개요 Retistruct에 열 하 고는 "눈물" 추가. "눈물"의 포인트는 겹쳐 흰색 화살표와 함께 표시 됩니다. 이 망막에 모든 상처는 임의 아니 특정 랜드마크 해 부 동안 망막 방향을 표시 하는 데 사용 되었다 있습니다. 중요 한 버튼은 빨간색으로 설명 되어 있습니다. 모든 "눈물" 추가 (B) 망막 그리고 망막의 가장자리에 "D"로 식별 하는 등 망막. "재구성 망막" 버튼 표시는 알. 중요 한 버튼은 빨간색으로 설명 되어 있습니다. (C)는 망막을 재구성 하는 과정. 재건축된 망막의 극 작 녹청 (파란색 화살표 컷된 위치를 명확 하 게 겹쳐)에 상처를 덜어 표시 오른쪽에 표시 됩니다. (D)는 망막 Retistruct 통해 실행의 최종 결과. 원래 wholemount 망막 왼쪽에 남아 있고 재건된 망막 오른쪽에 나타납니다. 덜어 삭감 녹청 (흰색 화살표 컷된 위치를 명확 하 게 겹쳐)에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 6: 우수한 곧바로 근육 및 맥락 막 게 마우스 망막 하 정확 하 게 사용할 수 있습니다. 어느 우수한 곧바로 근육 상처를 덜어에서 얻은 각도의 극좌표 플롯 또는 Retistruct로 재구성 된 망막에 맥락 막 게 인하. 덜어 컷 s opsin immunostained 재건 망막에 발견 했다 하 고 그들의 위치 s opsin 그라데이션의 위치를 비교 했다. 코 (비 강 맥락 막 균열에 대 한 0 °)를 true와 시간적 (180 ° 시간적 맥락 막에 대 한 진정한 s opsin 얼룩의 높은 농도 ventrally 위치, 진정한 지 (90 ° 우수한 곧바로)는 망막을 정확 하 게 회전을 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용 하 여, 게) 각 망막에 대 한 결정 했다. 각 개별 덜어 컷된 각도 ImageJ에 평균 각도 결정 했다의 값 형식 잘라 덜어 각 산출 되었다. 우수한 곧바로 근육 상처 확인 96.3 ± 4.3 °에 지 극 (n = 11). 비 강 맥락 막 게 식별 6.7 ± 5.8 °에서 비 강 극 하 고 시간적 맥락 막 게 식별 172.0 ± 4.5 °에 측 두 엽 극 (n = 9). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

깊은 랜드마크	각 막 화상 위치	식별 하는 망막의 극	실험적인 응용 프로그램
탁월한 곧바로	지 느 러 미	지 느 러 미	라이브 또는 고정
비 강 맥락 막 게	지 느 러 미	코	라이브 또는 고정
시간적 맥락 막 게	지 느 러 미	임시	라이브 또는 고정
S-opsin 그라데이션	없음	등, 복 부, 비 강, 시간적	고정

표 1: 깊은 랜드마크, 망막의 극 그들은 식별, 그리고 여부 그들은 라이브 또는 고정 조직의 응용 프로그램에 사용할 수 있습니다.

토론

확인 하 고 해 부 공간에서 격리 된 마우스 망막의 방향을 라벨 없음, 표준화 된 프로토콜이 되었습니다. 프로토콜 상세 표준화 함으로써이 공 허를 채우기 위해 시도 여기 고 깊은 해부학 적 랜드마크를 사용 하는 방법을 자세히 참조 포인트를 안정적으로 망막 방향을 식별 합니다. 그것은이 프로토콜에서 깊은 해 부 랜드마크 방향을 마우스 망막 각 막 화상²²같은 피상적인 랜드마크 보다 더 정확 하 고 안정적인 방법을 제공 표시 되었습니다. 따라서, 망막 방향에 대 한 각 막 화상에 의존 해야 하는 연구 방향 곧바로 근육, 맥락 막 균열 등 랜드마크에 의존 해야 하는 연구 보다 큰 오류 했다가지고 수 있습니다. 이 불일치에 대 한 필요성 및 결과 해석 하 고 연구 된 정확한 망막 오리엔테이션 사이 비교에 관하여이 표준화 된 프로토콜의 중요성을 강조 표시 합니다. 전반적으로, 표준화 된 프로토콜 제공할 것입니다 비전 연구자에 따라, 일반적인 방법은 망막을 식별 하기 위한 비 표준화 된 방법의 사용으로 발생할 수 있는 데이터 수집에 혼란 변수의 존재 없다 방향입니다.

여기에 제시 된 방법 쉽게 반복 하 고 실험 프로토콜의 많은 종류에 적용할 수 있습니다. 사실,이 프로토콜의 가장 큰 장점 중 하나는 그것의 적응성입니다. 맥락 막의 균열, s opsin 표현과 곧바로 근육 랜드마크 모든 발견 되었습니다 안정적으로 망막 방향²² 를 식별 하기 때문에 랜드마크 실험적인 매개 변수에 가장 적합 한 데이터 수집 (테이블을 최적화 하기 위해 선택 될 수 있다 1). 또한, 해 부의 방법을 더 망막의 방향을 명확히 하기 위하여 결합 될 수 있다. 예를 들어 맥락 막 게 인하 결합 될 수 있다 s opsin immunohistochemistry 망막의 모든 4 개의 극의 방향을 위해: 맥락 막 게 상처, 비 강 및 일시적인 반구를 식별할 수 있습니다 및 s opsin immunohistochemistry 식별할 수 복 부와 등 쪽 반구입니다. 그러나,이 프로토콜의 적응성 생리학 실험의 시간-민감한 성격에 의해 제한 될 수 있습니다. 랜드마크를 식별, 각 막 화상, 고 구호 컷을 실행 하는 데 걸리는 시간 ex vivo 실험에서 중요 한 조직의 죽음 귀 착될 수 있었다, 때문에 일부 이러한 절 개 방법의 최적의 수 있습니다. 다행히도, 깊은 랜드마크를 식별 하 고를 완화 하는 것 맥락 막 균열 또는 우수한 곧바로 근육 해 부 방법, 익숙한 되고있다 일단 인하 해 부 루틴의 일부가 빠르고 크게 추가 하지 마십시오 해 부의 길이입니다. 우리는 여기서 설명 하는 단계 시간에 매우 민감한 실험 시간에 추가할 수 없습니다 인정 할 조직의 생존 능력은 더 이상 문제 (그림 3 때 망막 방향 특별 게시물 에 대 한 s opsin 그라디언트를 사용 하 여 것이 좋습니다. ). S opsin로 모든 4 개의 극을 식별할 수 있는 망막, 하는 효과적인 방법에 대 한 망막을 얼룩이 지기: s opsin 얼룩 망막 등 쪽과 복 부 극으로 나누고 비 강 및 임시의 식별 여부에 따라 기둥을 허용 망막 오른쪽 또는 왼쪽 눈 (그림 3)에서 이다. 따라서, 우리는이 프로토콜 실험적인 매개 변수를 충족 수 있습니다 정확 하 게 망막 방향에 대 한 방법의 안정적이 고 반복 가능한 집합을 제공 믿습니다.

어떤 수정 된 망막 해 부 해 부 방법의 타당성은는 것과 고립 된 조직의 품질의 정확도 의해 제한 됩니다. 어떤 조직을 절 개 하는 동안 손실 됩니다 경우는 망막은 너무 정확한 재건에 대 한 손상, Retistruct 및 MATLAB 프로그램 되지 않습니다 안정적으로 재구성 하거나 망막의 방향을. 그것은 따라서 실험 데이터를 수집 하기 위해 그것을 사용 하 여 전에 절 개 방법을 연습 하는 것이 중요입니다. 해의 종류 설명 여기 어려운 되지 않습니다, 하는 동안 그들은 특정 랜드마크 망막 방향 식별의 반복성을 보장 하기 위해 연습 해야 합니다. 또한, 올바른 랜드마크 특정 게 데이터 수집을 시작 하기 전에 해부학 적 랜드마크를 시각적으로 식별 하는 것 연습 사용이 필수적입니다. 특정 것의 정확성을 확인 하는 방법 중 하나는 어느 맥락 막 균열 수 있도록 인하 또는 우수한 곧바로 근육 하 고 고정된 표식 이며 따라서 dissectio의 정확도에 의존 하지 않습니다 이후 s opsin 그라데이션을 상처의 위치 비교 명. 잠재적인 dissectors 또한 인하는 그림 1 에 표시 된 정확한 랜드마크와 재건된 망막의 예에 그들의 재건된 망막을 비교할 수 있습니다 및 그림 2. 본질적으로, 잠재적인 것 특정 해 부 형식에 대해이 프로토콜에서 설명 하는 단계를 수행 해야 합니다, 여부 우수한 곧바로 근육 또는 맥락 막 균열 방법, 및 s opsin 그라데이션 설정의 유효성을 결과 비교할 수는 특정 것입니다. 것은 랜드마크의 위치에 대해 확실 하지 않으면 망막의 부정확 한 방향으로 될 수 있기 때문에 것입니다 기본적으로 영향을 데이터 수집 및 해석.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5244
Axioplan2 Epifluorescent Microscope	Zeiss	N/A
Clear Nailpolish	N/A	N/A
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker	Sigma-Aldrich	CLS6780FP
Costar TC-Treated 24-well Plates	Sigma-Aldrich	CLS3524
Dissection Microscope	Olympus	SZ51
Donkey anti-Goat Alexa 594	Life Technologies	A11058
Donkey anti-Rabbit Alexa 594	Life Technologies	A21207
Donkey Normal Serum	Millipore	566460	Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Goat anti-s-opsin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-14363	Not commerically available as of 2017
Graefe Curved Forceps	Fine Science Tools	11052-10
ImageJ or FIJI	National Institute of Health	N/A	Freely available software
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer	Bovie Medical Corporation	AA00
MATLAB	MathWorks	N/A	At least version 2007b or later
Micro Cover Glasses	VWR International	48393-241
Micro Slide Trays	VWR International	82020-913
Moira Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40
Nitrocellulose membrane	Millipore	HAWP04700
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)
PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm)	BD PrecisionGlide	305175
Pyrex Glass Petri Dish	Sigma-Aldrich	CLS3160152
R	The R Project for Statistical Computing	N/A	Freely available software; version 3.4.3 or later
Rabbit anti-s-opsin	Millipore	ABN1660
Retiga R3 Microscope Camera	Qimaging	01-RET-R3-R-CLR-14-C
Retistruct	N/A	N/A	Freely available software  compatiable with Windows 7 or Windows 10
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media	Fisher Scientific	14-390-5
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)
Vannas Spring Dissection Scissors	Fine Science Tools	15000-03
5MP USB Microscope Digital Camera	AmScope	MU500	To be used with the Olympus Dissection Microscope