Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نماذج الاستيلاء الحادة هامة لدراسة الآليات الكامنة وراء الأحداث صرعية. وعلاوة على ذلك، يوفر القدرة على توليد أحداث صرعية عند الطلب طريقة ذات كفاءة عالية لدراسة تسلسل الأحداث الكامنة وراء مبادرتهم. وهنا يصف لنا نماذج الاستيلاء القشرية 4-أمينوبيريديني الحاد في الماوس والأنسجة البشرية.

Abstract

السيطرة على المضبوطات لا تزال قضية تمثل تحديا للمجتمع الطبي. لإحراز تقدم، يحتاج الباحثون طريقة لدراسة ديناميات الاستيلاء على نطاق واسع والتحقيق في آلياتها الأساسية. نماذج الاستيلاء الحادة هي مريحة وتوفر القدرة على إجراء التسجيلات الكهربية ويمكن أن تولد كمية كبيرة من اليكتروجرافيك مثل الاستيلاء على الأحداث (إيكتال). ثم يمكن أن تكون متقدمة نتائج واعدة من نماذج الاستيلاء على حدة نماذج الصرع المزمن والتجارب السريرية. وهكذا، ستكون ضرورية لجعل النتائج ذات الصلة سريرياً دراسة المضبوطات في نماذج الحادة التي تحاكي إخلاص توقيعات الاستيلاء على السريرية اليكتروجرافيك والديناميكية. دراسة الأحداث إيكتال في نماذج الحادة مصادرة إعداد من الأنسجة البشرية مهم أيضا لجعل النتائج ذات الصلة سريرياً. التركيز الرئيسي في هذه الورقة في النموذج 4-AP القشرية بسبب متعددة الاستعمالات في توليد الأحداث إيكتال في الدراسات في فيفو و في المختبر وكذلك في الماوس والأنسجة البشرية. كما وصف طريقة بديلة للاستيلاء على الاستقراء باستخدام نموذج2 + صفر-مغ الطرق الواردة في هذه الورقة ويقدم عرضاً مفصلاً للمزايا والقيود المفروضة على النشاط مثل صرعية التي تم إنشاؤها في مختلف الحادة نماذج الاستيلاء. وعلاوة على ذلك، بالاستفادة من أوبتوجينيتيك المتاحة تجارياً في سلالات الماوس، يمكن استخدام نبضة خفيفة قصيرة (30 مللي ثانية) لتشغيل حدث ictal مماثلة لتلك التي تحدث تلقائياً. وبالمثل، يمكن تطبيق نفث العصبية (زبدي حمض غاما الأمينية أو غلوتامات) 30-100 مللي ثانية للأنسجة البشرية لتحريك الأحداث إيكتال التي تكون مماثلة لتلك التي تحدث تلقائياً. القدرة على تحريك الأحداث إيكتال على الطلب في نماذج الاستيلاء الحادة يوفر القدرة المكتشف حديثا لمراقبة تسلسل الأحداث التي تكمن وراء الاستيلاء على الشروع في ديناميات وتقييم كفاءة العلاجات المضادة الاستيلاء المحتملة.

Introduction

يمكنك استخراج نماذج الاستيلاء على حدة بنجاح تذكرنا الأحداث إيكتال التي لوحظت في للالكهربائي (EEG) للأفراد التي تعاني من الاستيلاء على اليكتروجرافيك التواقيع. الباحثين استخدام هذه الأحداث مثل إيكتال (يشار إليها هنا 'أحداث ictal') كالأمهات البديلات للاستيلاء على حدث1. سريرياً، كأحداث ictal وكيل موثوق بها للاستيلاء على الأحداث منذ المضبوطات هي اضطراب عصبي التي تنشأ من الدماغ. في وحدة مراقبة الصرع، أطباء الأعصاب تعتمد على الكشف عن الأحداث ictal للتأكد من منطقة ابيليبتوجينيك في الدماغ وعزلها لاستئصال2. في وحدة العناية المركزة، رصد الأطباء النشاط ictal تقييم ما إذا كان أي نشاط حجز تصر على المرضى مخدراً3. السيطرة على المضبوطات لا يزال يتعين قضية التي تمثل تحديا للمجتمع الطبي، كما أن 30% مرضى الصرع المقاومة للأدوية لأن الأدوية المتوفرة4،5، و 10 في المائة من الحالات الطبية التي تنطوي على مضبوطات المخدرات التي يسببها لا يستجيب ل العلاج القياسي3. وهذا يعرض يشكل مصدر قلق للمجتمع، كما المنظورة هو 10 في المائة سكان أمريكا تعاني من الاستيلاء على الأحداث في حياتهم و 3% ومن المتوقع وضع الصرع6.

دراسة المضبوطات في نماذج الصرع المزمن هو مكلفة وشاقة، وغالباً ما يستغرق شهورا لإعداد7. كما أن من الصعب إجراء التسجيلات الكهربية في الانتقال بحرية الحيوانات. التجارب السريرية البشرية تواجه قضايا مماثلة، فضلا عن تعقيدات إضافية تتصل بموافقة المريض، تقلب في خلفيات المشاركين و اعتبارات أخلاقية وتشارك8. من ناحية أخرى، نماذج الاستيلاء على حدة، مواتية لأنها ملائمة لإعداد نسبيا وفعالة من حيث التكلفة، وقادرة على توليد كميات كبيرة من الأحداث ictal لدراسة9. بالإضافة إلى ذلك، تم إصلاح الأنسجة في وضع مستقر، حتى الظروف تعتبر مثالية لإجراء التسجيلات الكهربية اللازمة لدراسة ديناميات الاستيلاء والفسيولوجيا المرضية الأساسية ذات الصلة. نماذج الاستيلاء على حدة تظل مواتية أكثر من نماذج في السيليكون (الكمبيوتر) نظراً لأنها تعتمد على المواد البيولوجية ويتألف من شبكة الخلايا العصبية المكونة للدماغ مع جميع العوامل الكامنة والربط متشابك، وأن لم يتم القبض على باستخدام الكمبيوتر حتى أكثر تفصيلاً ونماذج10. هذه الميزات لجعل نماذج الحادة الاستيلاء على وشك أن تكون فعالة في الكشف عن العلاجات المضادة مصادرة المحتملة وجعل النتائج الأولية قبل دفع لهم لإجراء مزيد من التحقيقات في نماذج الصرع المزمن والتجارب السريرية.

بشكل عام، نماذج الاستيلاء الحادة مستمدة من أنسجة المخ المعتادة التي قد تعرض لظروف فرط منفعل. للحث على أحداث ictal ذات الصلة سريرياً في أنسجة المخ السليمة، من المهم أن نفهم أن الدماغ يعمل على النحو الأمثل في حالة حرجة11 متوازنة12فيها الإثارة (ه) وتثبيط (ط). حدوث اضطراب في ه--أنا التوازن يمكن أن يؤدي إلى فرط منفعل الاستيلاء على الدولة التي تتسبب في أحداث إيكتال. وبناء على ذلك، ضمن هذا الإطار المفاهيمي، هناك اثنين من الاستراتيجيات الرئيسية لتوليد أحداث ictal شرائح المخ (في المختبر) أو في الأعمال التحضيرية للجامعة في الدماغ (في فيفو): زادت أو انخفضت تثبيط ("إزالة التثبيط") الإثارة ("غير-إزالة التثبيط"). بيد أن الأحداث ictal مرتبة عالية وتزامن الأحداث التي تتطلب تأثير إينتيرنيورونس جابايرجيك الانسجام في نشاط شبكات عصبونية13،14. ولهذا السبب، نماذج غير إزالة التثبيط هي الأكثر فعالية لتوليد الأحداث إيكتال في الشبكات العصبية معزولة، مثل في في المختبر شريحة الدماغ15، بينما في المختبر نماذج إزالة التثبيط يؤدي عادة إلى النتوءات النشاط تذكر النتوءات الشبيهة إينتيريكتال. وعلاوة على ذلك، ضمن هذا الإطار المفاهيمي، حدث أثناء مزامنة لحظة يمكن أن تؤدي إلى أيضا موثوق حدث إيكتال16. وفي الواقع، حدث ictal يمكن أن تحدثها أي اضطراب طفيف المطبقة على الجهاز العصبي17 عندما يكون في نقطة انتقال ("التشعب") حالة حرجة18. تقليديا، كانت هذه الاضطرابات الناجمة عن التحفيز الكهربائي. لكن التطورات الأخيرة التي أوبتوجينيتيكس في علم الأعصاب، يوفر الآن استراتيجية أكثر أناقة لحمل الدولة الحيوية انتقالات16.

الطرق الموضحة في هذه الورقة لشرح كيفية توليد أحداث ictal على الطلب في نماذج الاستيلاء الحادة في المختبر (الخطوة 1 من البروتوكول) ودراسات في فيفو (الخطوة 2 من البروتوكول). أنها تنطوي على اختيار منطقة الدماغ والاستيلاء على أسلوب الحث ونوع الدراسة والأنواع؛ ومع ذلك، سينصب على اختيار نموذج حادة 4-AP القشرية الاستيلاء الموصى بها بسبب متعددة الاستعمالات في مجموعة متنوعة واسعة من أنواع الدراسة. يقوم نموذج الاستيلاء على 4-AP الحادة في المختبر على بروتوكول قياسي لإعداد شرائح الدماغ عالية الجودة للتسجيلات الكهربية وتصوير الدراسات19. قد استخدمت فعلا هذه البروتوكولات لجعل الشرائح في المختبر الدماغ الاكليلية من قشرة سوماتوسينسوري والحركية للفئران16،البشر و20 21. تعديلات لتوليد الأحداث إيكتال في هذه الأنواع من شرائح المخ سابقا ثبتت16 والتفاصيل الكاملة موصوفة في بروتوكول أدناه. نموذج 4-AP القشرية الاستيلاء الحادة في فيفو يستند إلى بروتوكول قياسي لإعداد اوديما للتصوير الدراسات22. التعديل أن أي إطار (الشريحة الزجاجية) مثبت بعد اوديما. بدلاً من ذلك، وكلاء بروكونفولسانت (4-أ فب) تطبق موضعياً على قشرة المكشوفة للحث على أحداث ictal بينما الحيوان تحت التخدير العام. على حد علمنا، كان لدينا فريق الأول من وضع هذا الحاد في فيفو الاستيلاء القشرية النموذجي في الفئران16،23. الحاد في فيفو الاستيلاء القشرية 4-AP نموذج إعداد من الفئران الكبار وضعت استكمالا لنموذج شريحة في المختبر من نسيج الأحداث. النسخ المتماثل للنتائج التي توصل إليها في نموذج الحجز الكبار في فيفو يساعد على تعميم النتائج المستخلصة من نماذج شريحة بمعالجة الشواغل الكامنة فيما يتعلق بالشروط غير الفسيولوجية شريحة الدماغ 2D (مقابل ثلاثي الجامعة في الدماغ الهيكل) والاختلافات الفسيولوجية بين الأحداث والبالغين الأنسجة.

ويتضح طريقة بدء الحدث إيكتال عند الطلب باستخدام أما نفث العصبية مع استراتيجيات بيكوسبريتزير أو أوبتوجينيتيك. على حد علمنا، مجموعتنا هو الأول من بدء الأحداث إيكتال في الأنسجة البشرية باستخدام أجهزة الإرسال العصبية عبر بيكوسبريتزير16. استراتيجيات أوبتوجينيتيك، من سلالة الفئران C57BL/6 سلالة التقليدية المستخدمة للتعبير عن المتسلسلات. التعبير عن تشانيلرهودوبسين-2 (ChR2) في إينتيرنيورونس جابايرجيك أو جلوتاماتيرجيك الخلايا الهرمية سيوفر القدرة الاختيارية على توليد أحداث ictal على الطلب مع نبضات خفيفة قصيرة. سلالات الفئران أوبتوجينيتيك مناسبة تشمل متغير C57BL/6 المتاحة تجارياً التي تعرب عن ChR2 في إينتيرنيورونس، أما باستخدام الماوس حويصلية غابا الناقل بروموتور (فجأت)24، أو الخلايا الهرمية، باستخدام مستضد خلايا الغدة الصعترية الماوس 1 مروج (Thy1)25. هذه الفئران ChR2 فجأت و Thy1-ChR2 المتاحة تجارياً تتيح الفرصة لتنشيط الخلايا العصبية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك، على التوالي، في اللحاء الجديد مع الأزرق (470 nm) الضوء. القدرة على توليد أحداث ictal على الطلب في نماذج الاستيلاء الحاد يمكن أن تقدم فرصاً جديدة دراسة ديناميات الشروع في ضبط وتقييم كفاءة العلاجات المضادة الاستيلاء المحتملة.

Protocol

وأجرى جميع البحوث التي تنطوي على المرضى تحت بروتوكول التي وافق عليها "المجلس أخلاقيات جامعة الصحة شبكة البحوث" وفقا "إعلان هلسنكي". الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية من قبل "المجلس الكندي للعناية بالحيوان" ووافقت عليها "اللجنة رعاية الحيوان كريمبيل بحوث المعهد".

1-البروتوكول الأول: الحادة في المختبر "النموذجي الاستيلاء"

  1. إعداد الحلول التشريح والسائل الدماغي النخاعي اصطناعية
    1. كاربوجيناتي الماء عالي النقاوة (وهو المياه التي تمت تصفيتها مع أومه 18.2 MΩ·cm) مع كاربوجين (95% O25% CO2) لمدة 5 دقائق باستخدام الهواء حجر الفقاقيع (أجهزة التهوية لأحواض السمك).
      ملاحظة: يمكن توصيل الأحجار الهواء إلى منظم عبر أنابيب خزان كاربوجين سيليكون القياسية. إذا لم تتوفر الحجارة الهواء، ختم إغلاق نهاية الأنبوب سيليكون وكزه الثقوب الصغيرة في الختم للسماح بالغاز كاربوجين إلى فقاعة بها وكاربوجيناتي الحل.
    2. تحضير حلاً تشريح بتذويب الذوائب من الجدول 1 في الماء عالي النقاوة. إضافة كاكل2 إلى حل الذي تم كاربوجيناتيد لمدة 5 دقائق على الأقل لمساعدته على حل.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، أضف كاكل2 أولاً، ذلك لأنه يمكن أن يحل بسهولة في إيجاد حل غير المشبعة. الحل في شكل سائل، ينبغي أن يكون موسم 300-320/L والرقم الهيدروجيني 7.4 بعد يجري مشبعة كاربوجين.
      1. البرد حل تشريح 0-4 درجة مئوية. اترك الحل في الثلاجة بين عشية وضحاها أو وضع الحل في الثلاجة ح 1 ومراقبة درجة الحرارة بشكل مستمر.
        ملاحظة: يمكن تخزين الحل تشريح لمدة تصل إلى ثلاث ليال؛ تجاهل بعد ذلك.
      2. كاربوجيناتي الحل تشريح لمدة 5-10 دقيقة قبل الاستخدام.
        ملاحظة: من الناحية المثالية، الحل يجب أن تظهر أما كطين أو يكون الانتقال إلى طين قبل الاستخدام.
    3. إعداد القوارض من السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) بإذابة الذوائب من الجدول 2 (أو الجدول 3 لقام البشرية) في الماء عالي النقاوة. كاربوجيناتي الحل قام في حين أنها في حمام مياه ساخنة إلى 35 درجة مئوية حتى الاستخدام. إضافة كاكل2 إلى حل الذي تم كاربوجيناتيد لمدة 5 دقائق على الأقل لمساعدته على حل.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، إضافة كاكل2 أولاً حيث أنه يمكن حل أسهل في إيجاد حل غير المشبعة. الحل في شكل سائل، ينبغي أن يكون موسم 290-320/L والرقم الهيدروجيني 7.4 بعد يجري مشبعة كاربوجين. وينبغي بذل الحلول في وحدات التخزين 1 أو 2 أو 4 لتر حسب مدة التجارب. جعل 4 L لمدة يوم كامل (8 ساعات) للتجارب. قام ينبغي أن الطازجة كل يوم؛ لا تقم بتخزينها لفترة أطول من 1 د.
  2. تشريح الماوس لجمع أنسجة المخ
    ملاحظة: للأنسجة البشرية، انتقل إلى الخطوة التالية (الخطوة 1، 3) على جعل شرائح الدماغ مع فيبرتوم. ينبغي الحصول على القطع على شكل مكعبات (1 سم3) من أنسجة المخ من الأعصاب استخدام الإجراءات الموصوفة سابقا26،27.
    1. جمع جميع الأدوات والمواد اللازمة لتشريح الحيوان. قم بإعداد مساحة العمل للتحضير لتشريح الحيوان.
      1. تحقق في خزان كاربوجين (95 ٪ س2/5%CO2) للتأكد من أنه ليس فارغاً. استبدال اسطوانة غاز قبل التجارب إذا كان هناك أقل من 500 رطل ضغط المتبقية.
      2. معايرة فيبرتوم (تهتز بتقطيع اللحم والأنسجة بليد) وفقا لدليل إرشادات الشركة المصنعة. ضبط فيبرتوم تعيين سعة قطع من 1 ملم وسرعة قطع 0.12 mm/s.
        ملاحظة: قد تختلف الإعدادات المثلى لكل الفردية تهتز أنسجة النصل القاطع؛ ومع ذلك، بشكل عام، ينبغي أن تكون السعة العالية وسرعة القطع يجب أن يكون منخفضا.
      3. ملء قاعة حضانة شريحة الدماغ (أي، حارس شريحة الدماغ) مع قام وفقاعة أنه مع كاربوجين. ثم وضع في غرفة الحضانة في حمام مائي في 35 درجة مئوية.
        ملاحظة: استخدم القوارض قام لشرائح الدماغ القوارض وقام البشرية لشرائح المخ البشري.
    2. الحصول على ماوس الأحداث من أي من الجنسين، بين سن 13 د (p13) إلى د 21 (p21، حيث p0 هو تاريخ الميلاد).
    3. تخدير الماوس مع حقن داخل من الصوديوم بينتوباربيتال (55 مغ/كغ وزن الجسم). بمجرد عميق تخديره الماوس، كما يتبين من غياب منعكس قرصه أخمص القدمين، على الفور استخدام أداة مقصلة الموافقة على التعليم والتدريب المهني لقطع رأس الماوس في حركة سريعة واحدة.
      ملاحظة: يعد الحقن بينتوباربيتال الصوديوم وفقا للإجراءات التي أوصت بها المبادئ التوجيهية المؤسسية.
    4. عقد الآنف الماوس على استقرار مقطوعة الرأس وجعل شق خط الوسط ابتداء من بين العيون للماوس وعلى طول فروة الرأس لفضح الجمجمة بلطف. ضمان لم يتم ضغط الجمجمة بالضغوط التي مورست قبل الحلاقة. استخدام زاوية حافة الشفرة لزيادة دقة قطع.
    5. انتشار عدا اللوحات لفروة الرأس الماوس باستخدام الأصابع لفضح الجمجمة. ثم، استخدم الزاوية الطازجة من الحافة الشائكة جعل شق على طول خط الوسط من الجمجمة؛ إيلاء اهتمام دقيق لتجنب أي اتصال مع قشرة الدماغ.
    6. إدراج منشقة الملقط إلى مأخذ العين الماوس على استقرار مقطوعة الرأس ووضعه في طبق بتري مليئة الباردة (0-4 درجة مئوية) الحل التشريح. تأكد من أن الرأس هو مغمورة تماما في الحل تشريح.
    7. استخدام مجموعة ثانية من الملقط منشقة للطف قشر فروة الرأس الماوس بعيداً، إزالة عظم الآنف تقشير أنه، وإزالة الجزء الخلفي (الجانب والذيلية) للجمجمة.
      ملاحظة: عظم الآنف من الفئران الأحداث لينة جداً وكسر بسهولة.
    8. استخدام ملعقة صغيرة لقص الأعصاب البصرية، تريجيمينال الأعصاب، والحبل الشوكي. ثم، استخدم ملعقة صغيرة بلطف فصل الدماغ الجمجمة. ترك الدماغ مغمورة تماما في طبق بتري مليئة بتشريح الحل.
  3. إعداد شرائح القشرية من قشرة سوماتوسينسوري موتور
    1. ملء علبة المخزن المؤقت فيبرتوم مع ~ 150 مل البرد (0-4 درجة مئوية) الحل التشريح.
      ملاحظة: بشكل اختياري، إبقاء علبة المخزن المؤقت في الثلاجة حتى الحاجة للحفاظ على درجة حرارة منخفضة أثناء إجراء تشريح.
    2. الصق أنسجة المخ من الماوس أو الإنسان على خشبة المسرح فيبرتوم (العينة حامل/صينية) استخدام الغراء لاصق الفورية. للفئران، قطع والذيلية جزء صغير من الدماغ (أي، المخيخ) حيث أنه يمكن أن يتم لصقها بسهولة شقة على صاحب العينة (السماح للجانب روسترال من الدماغ لمواجهة الحد الأقصى).
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، شرائح المخ الماوس الأفقي يمكن أن تعده الالتصاق الجهة الظهرية من الدماغ على صاحب العينة (الجانب البطني للمخ ينبغي أن يواجه السقف)28.
    3. بلطف ضع صاحب العينة (مع أنسجة المخ) داخل علبة المخزن المؤقت. التأكد من أن يواجه الجزء الظهرية الدماغ الشفرة فيبرتوم.
      ملاحظة: من المهم لتقليل مقدار الوقت يتعرض الدماغ للهواء.
  4. تقطيع أنسجة المخ وجمع
    1. شريحة الدماغ إلى شرائح سميكة ميكرومترات 450 استخدام في فيبرتوم في الظهرية إلى اتجاه البطني. ضمان بقاء الدماغ مرتبط تماما بعلبة العينة بينما تشريح ذلك.
      1. جعل في أول خطوة من نوعها في الدماغ الماوس لإزالة لمبة شمي. ثم، وجعل التخفيضات اللاحقة حتى يتم ملاحظة منطقة موتور somatosensory (تقع في منتصف الطريق تقريبا بين لمبة شمي وبريجما).
        ملاحظة: بشكل اختياري، شريحة الدماغ في أرق (200 ميكرومتر) شرائح حتى يظهر كلثوم الإحضار في رأي الاكليلية من الدماغ، والذي يشير إلى أن منطقة somatosensory موتور الوثيق.
    2. استخدام ماصة نقل تحمل على نطاق لجمع شرائح الاكليلية (450 ميكرو) التي تحتوي على منطقة سوماتوسينسوري والحركية وتغرق منها في طبق بتري يحتوي على الباردة (0-4 درجة مئوية) الحل التشريح.
    3. استخدام شفرة حلاقة جديدة وقطع الأنسجة الزائدة أي من الشرائح. للحصول على شرائح الاكليلية من الفئران، أداء عرضية قص أسفل كوميسوري نيوكورتيكال (أي، كلثوم الإحضار). لا تقطع في حركة ساوينج؛ ببساطة تطبيق الضغط على الشفرة الأنسجة واستخدام فرشاة تعرض بالتفصيل لفصل الأنسجة بلطف. تأكد من تقليل حركة الشريحة الاكليلية.
    4. استخدام ماصة نقل تحمل على نطاق لنقل الجزء الظهرية الاكليلية الشرائح التي تحتوي على اللحاء الجديد (طبقة 1-6) إلى طبق بتري ثاني مليئة بالدفء (35 درجة مئوية) قام للحظة (~ 1 s). ثم، على الفور نقل الشرائح إلى غرفة حضانة التي تحتوي على كاربوجيناتيد الحارة (35 درجة مئوية) قام.
      ملاحظة: غرض نقل إلى طبق بتري مع قام لتقليل نقل الحل التشريح إلى غرفة الحضانة بينما نقل شرائح المخ مع ماصة واسعة-تتحمل. تستخدم الدائرة حضانة آبار متعددة للحفاظ على شرائح مختلفة من الدماغ ونظم.
    5. تجاهل بقية الدماغ والذبيحة الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  5. الاحتضان وصيانتها
    1. تترك شرائح المخ مغمورة قليلاً في غرفة الحضانة عند 35 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم إزالة غرفة الحضانة من حمام المياه والسماح لها بالعودة إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية). انتظر ح 1 لشرائح المخ لاسترداد قبل إجراء التسجيلات الكهربية.
      ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات الهواء التي تجمع تحت شرائح الدماغ في غرفة الحضانة. فقاعات الهواء هي واجهات الجوية التي تتسبب في تلف الأنسجة. يمكن الحفاظ على شرائح المخ الماوس ح 6-8، بينما يمكن تخزين أنسجة المخ البشري ليصل إلى 24 ساعة في غرفة حضانة كاربوجيناتيد جيدا مع قام المناسبة.
  6. التسجيلات الكهربية للطبقة القشرية سطحية
    ملاحظة: يلاحظ الأحداث إيكتال في التسجيلات الميدانية المحلية خارج الخلية (طابعات الحجم الكبير) المحتملة من شرائح المخ. يمكن ملاحظة طابعات الحجم الكبير شريحة الدماغ وتسجل مع نوع واجهة دائرة29 أو نظام مغمورة صفيف متعدد قطب (طيران الشرق الأوسط)16. الإجراء الذي تم وصفه سابقا16 ويرد أدناه وصف تفاصيل إضافية.
    1. استخدام ماصة نقل تحمل على نطاق أو فرشاة تعرض بالتفصيل لنقل شريحة الدماغ على أكبر قليلاً العدسة قبل قطع الورق الذي يقام في مكان استخدام الملاقط طب أسنان. نقل الورق العدسة (الذي هو يستريح شريحة الدماغ على) إلى دائرة التسجيل وتأمينه في الموقف مع شاشة القيثارة.
    2. تشغيل الحار (35 درجة مئوية)، كاربوجيناتيد قام بيرفوساتي من خلال دائرة التسجيل عبر شريحة الدماغ بمعدل 3 مل/دقيقة (~ 1 بالتنقيط/s). استخدام مقياس حرارة رقمي لضمان الدائرة تسجيل 33-36 درجة مئوية.
    3. سحب الزجاج كهربائي مع مقاومة MΩ 1-3 من أنابيب زجاج البورسليكات (مع قطر خارجي من 1.5 مم) باستخدام ساحبة. الردم أقطاب الزجاج مع قام (~ 10 ميليلتر) استخدام المحاقن هاملتون. تجاهل مسرى فورا إذا كان التلميح معطوب.
      ملاحظة: التبييض سلك الفضة (5 دقائق) والسماح فقط لجزء الحد أدنى (أي، في التلميح) الأسلاك الفضية تكون غارقة في الأقطاب قام الزجاج مملوءة بالعودة لتقليل الضوضاء والانجراف خلال التسجيلات. إزالة أي قام الزائدة من الزجاج الكهربائي مع حقنه هاملتون إذا لزم الأمر.
    4. استخدام مجهر ستيريو 20 X بدقة دليل تسجيل الزجاج الكهربائي إلى سطحية القشرية الطبقة (2/3) باستخدام دليل المتلاعبين. سجل/عرض النشاط الكهربائي للمخ الشريحة على جهاز كمبيوتر مع البرامج القياسية.
      ملاحظة: سوف يحمل شرائح قابلة للتطبيق (عالية الجودة) الدماغ محتملة مقولة قوية في الاستجابة للمحفزات الكهربائية التطبيقية (المايكروثانيه 100، 30-300 μA) أو نبضات الضوء (30 مللي ثانية، 10 ميغاواط/مم2) للأنسجة أوبتوجينيتيك.
  7. أنشطة مثل الاستيلاء
    1. نتخلل قام تحتوي على 100 ميكرومتر 4-أمينوبيريميديني (4-AP) على شريحة الدماغ. حل 80 ملغ 4-AP في 8.5 مل من الماء لجعل حل أسهم من 100 ملم 4-آب إضافة 100 ميليلتر حل الأسهم 4-AP 100 مم إلى 100 مل قام لتحقيق بيرفوساتي قام مع 100 ميكرومتر 4-AP.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، استخدم صفر-Mg2 + قام (الجدول 4)، حلاً قام معدلة تتضمن لا المضافة Mg2 +, نتخلل شريحة الدماغ. للأنسجة البشرية، واستخدام تركيبة من 100 ميكرومتر 4-أ فب في صفر-Mg2 + "قام البشرية" (الجدول 5) إلى تحقيق النتائج المثلى. متوسط الوقت اللازم لإحداث إيكتال أن يظهر 15 دقيقة؛ ومع ذلك، قد يستغرق مدة تصل إلى 40 دقيقة لبعض شرائح المخ.
  8. جيل الاستيلاء على الطلب: استراتيجية أوبتوجينيتيك للفئران أوبتوجينيتيك
    1. تطبيق نبضة قصيرة (30 مللي ثانية) الأزرق (470 nm) خفيفة (بكثافة إنتاج2 ميغاواط 1 الحد أدنى/مم) الشروع في حدث إيكتال. استخدم مناور يدوي لوضع مكم 1,000 أساسية قطرها ألياف ضوئية (0.39 نا) مباشرة فوق منطقة التسجيل.
      ملاحظة: تعيين معدل الصور--تحفيز لمطابقة المعدل المنشود لوقوع الحدث إيكتال (أي1 نبض كل 50 ثانية). بيد أن معدل لا يمكن المبالغة مفرط من معدل الجوهرية التي تحدث الأحداث ictal.
  9. جيل الاستيلاء على الطلب: استراتيجية غير أوبتوجينيتيك للأنسجة البشرية
    1. ضع شريحة الدماغ حيث أن الطبقات السطحية من المنبع، والطبقات العميقة المصب لتدفق بيرفوساتي من خلال دائرة التسجيل.
    2. سحب من زجاج كهربائي (نفس النوع كالمستخدمة للتسجيلات طابعات الحجم الكبير) واللمس بلطف طرفها مع ممسحة مهمة حساسة لإنشاء فتحه صغيرة. الردم مسرى مع ~ 25 ميليلتر من 100 ملم غابا (يذوب في الماء) وإرفاقه بيكوسبريتزير. وبدلاً من ذلك، الردم مسرى مع 200 ميكرومتر غلوتامات (يذوب في الماء).
      ملاحظة: لتقدير حجم يجري ينفخ من بيكوسبريتزير (~ 50 ميليلتر)، تنطبق نفخة اختبار على صفيحة بلاستيكية (يفضل أن تكون الشبكية). ثم قم بتطبيق معالجة تجميعية لوحدات التخزين المعروفة (أي10 ميليلتر، 20 ميليلتر، ميليلتر 50 أو 100 ميليلتر) مع ماصة لمقارنة مع نفخة الاختبار.
    3. تطبيق نفث العصبي (GABA أو غلوتامات) على الأنسجة البشرية مع بيكوسبريتزير (10-20 psi مدة 30-100 مللي ثانية) الشروع في حدث إيكتال. تطبيق نفخة واحدة من 100 ملم GABA إلى الطبقة العميقة (5) من أنسجة المخ لتوليد الأحداث إيكتال في طبقة سطحية (2/3). وبدلاً من ذلك، تنطبق نفخة واحدة من 200 ميكرومتر غلوتامات مباشرة على الطبقة السطحية لتوليد الأحداث إيكتال في طبقة سطحية.
      ملاحظة: تعيين معدل بيكوسبريتزير نفخة لمطابقة المعدل المنشود لوقوع الحدث إيكتال (أي1 نبض كل 50 ثانية). بيد أن معدل لا يمكن المبالغة مفرط من معدل الجوهرية التي تحدث الأحداث ictal.

2-البروتوكول الثاني: الحاد في فيفو "نموذج الحجز"

  1. إعداد العمليات الجراحية وجراحة
    1. الحصول على ماوس الكبار (p35-p60) من أي من الجنسين.
    2. تخدير عميق الماوس مع الكيتامين (95 مغ/كغ) وإكسيلازيني (5 ملغ/كغ). إجراء اختبار تو-رشة منعكس لضمان هو مخدراً الماوس. بدلاً من ذلك، استخدم إيسوفلوراني (4% لتحريض، 1.5-2% للجراحة) لتخدير الماوس.
      ملاحظة: يمكن أن يؤثر اختيار المسكنات في30،النشاط الاستيلاء على31.
    3. جبل الماوس في إطار ستيريوتاكسيك بتأمين رئيسها مع أشرطة الإذن. ضع وسادة ساخنة تحت الماوس لمدة الجراحة.
    4. الجزء العلوي من الرأس الماوس استخدام المتقلب القوارض تعريض فروة الرأس للحلاقة. حقن 0.3 مل يدوكائين مع 25 5/8 في إبرة في السمحاق لتجنب النزيف أو الألم. تطبيق مرهم العين لعيون الماوس لمنعها من الجفاف خلال التجربة.
    5. قرصه ورفع مركز فروة الرأس الماوس تقييم ما إذا كانت ردود الفعل، قد ولت. وفي وقت لاحق، أداء أفقي قص لفضح بريجما للمنطقة لامدا للجمجمة. بلطف كشط كامل المنطقة المعرضة للجمجمة مع مسحه القطن إنشاء سطح جاف.
    6. أداء اوديما 4 مم في القطر في الإحداثيات روستروكودال لاتيروميديال ومم-2.00 مم 2.0 لفضح قشرة somatosensory. وضع علامة على موقع مع دائرة (4 ملم في القطر) باستخدام علامة دائمة. حفر حولها الدائرة مع حفر أسنان هوائي حتى يعطي الطبقة المتبقية من عظم اوديما بسهولة طريقة عند الضغط باستمرار. تطبيق المحلول الملحي على طبقة العظام قبل إزالة اوديما مع الملقط منشقة. وفي وقت لاحق، تطبيق المحلول الملحي الدافئ إلى منطقة مكشوفة.
  2. أساليب التسجيل وتحريض مضبوطات المواد الكيميائية
    1. سحب الزجاج كهربائي مع مقاومة MΩ 1-3 من أنابيب زجاج البورسليكات (مع قطر خارجي من 1.5 مم) باستخدام ساحبة. الردم أقطاب الزجاج مع ~ 10 ميليلتر من قام أو المحلول الملحي هاملتون باستخدام المحاقن. تجاهل مسرى فورا إذا كان التلميح معطوب.
      ملاحظة: التبييض سلك الفضة (5 دقائق) والسماح فقط لجزء الحد أدنى (أي، في التلميح) الأسلاك الفضية تكون غارقة في الأقطاب قام الزجاج مملوءة بالعودة لتقليل الضوضاء والانجراف خلال التسجيلات. إزالة أي قام الزائدة من الزجاج الكهربائي مع حقنه هاملتون إذا لزم الأمر.
    2. استخدام مناور يدوي لتوجيه مسرى الزجاج إلى سطحية القشرية الطبقة (2/3) في منطقة سوماتوسينسوري والحركية. سجل/عرض النشاط الكهربائي للمخ الشريحة على جهاز كمبيوتر مع البرامج القياسية.
      ملاحظة: الطبقة 2/3 عميق من السطح32حوالي 0.3 مم.
    3. تطبيق موضعياً المحلول الملحي 1.5 مم 4-AP مل ~0.5 على قشرة المكشوفة للماوس مع حقنه حتى يغطي تماما اوديما. حل ملغ 14 من AP 4 في 100 مل من المحلول الملحي متساوي التوتر لجعل حل أسهم من 1.5 مم 4-AP المالحة.
      ملاحظة: تعد المياه المالحة 4-AP قبل بدء التجربة. وفي المتوسط، تظهر الأحداث إيكتال 15-30 دقيقة بعد التطبيق الموضعي.
  3. توليد الطلب على المضبوطات في الفئران أوبتوجينيتيك
    1. تطبيق نبضة قصيرة (30 مللي ثانية) الأزرق (470 nm) خفيفة (بحد أدنى 10 ميغاواط/مم2 كثافة إخراج) الشروع في حدث إيكتال. استخدم مناور يدوي لوضع مكم 1,000 أساسية قطرها ألياف ضوئية (0.39 نا) مباشرة فوق منطقة التسجيل.
      ملاحظة: تعيين معدل الصور--تحفيز لمطابقة المعدل المنشود لوقوع الحدث إيكتال (أي1 نبض كل 300 ثانية). بيد أن معدل لا يمكن المبالغة مفرط من معدل الجوهرية التي تحدث الأحداث ictal.

النتائج

تطبيق 100 ميكرومتر 4-AP إلى شرائح الدماغ القشرية ميكرومتر الحجم 450 (التالفة) ذات النوعية الجيدة من الأحداث ChR2 فجأت موثوق بها التي يسببها متكررة ictal أحداث ماوس (> 5 ق) ضمن 15 دقيقة (الشكل 1Ai). تطبيق 100 ميكرومتر 4-وكالة اسوشييتد برس لشرائح من رداءة أسفر انفجار الأحداث ...

Discussion

شرائح المخ يعالجون بدواء بروكونفولسانت أو تغيير بيرفوساتي قام زيادة استثارة الشبكة العصبية والنهوض هطول الأمطار لإحداث إيكتال (أحداث شبيهة بالاستيلاء على اليكتروجرافيك). للفئران، ينبغي أن تحتوي على شرائح الاكليلية المفضل من منطقة somatosensory موتور القشرة cingulate، المنطقة 2 (CG)، ولكن ليس في منط?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (119603 باتاكا بيتر لام كارلين وتوفيق فلينت ألف)، ومعهد الدماغ أونتاريو (لتوفيق فلينت ألف)، ومنح البحوث الطلابية ميتش (لمايكل تشانغ). نود أن نشكر ليام طويلة لمساعدته في تصوير المخطوطة الفيديو. ونود أن نعترف باهاريخوب باريا، سيلفاباسكاران أبيشان، وشاديني الملاصقتين لمساعدتها في تجميع الأرقام والجداول في هذه المخطوطة. هي الأرقام 1A 3A, 4Aو 6A جميع الأرقام الأصلية من البيانات المنشورة في تشانغ et al. 16.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium pentobarbitalN/AN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringeN/AN/APurchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needleN/AN/APurchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
Instant adhesive glueN/AN/APurchased through UT Med Store
Lens paperN/AN/APurchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
PVC handle micro spatulaN/AN/APurchased through UT Med Store
Micro spoon with flat endN/AN/APurchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0N/AN/APurcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipetteN/AN/APurchased through UT Med Store
Dental TweezerN/AN/APurchased through UT Med Store
Thermometer (digital)N/AN/APurchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) N/AN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
VibratomeLeicaN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) Scientific Systems Design IncN/A
Sodium Chloride (NaCl)N/AN/APurchased through UT Med Store
Sodium BicarbonateN/AN/APurchased through UT Med Store
DextroseN/AN/APurchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)N/AN/APurchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
SucroseN/AN/APurchased through UT Med Store

References

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. , 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. . Seizures and epilepsy. , (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. , 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. , 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143 ictal 4 ChR2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved