Поколения и по требованию начало деятельности острый приступ в грызунов и тканей человека

Резюме

Острый захват модели имеют важное значение для изучения механизмов лежащие в основе эпилептиформный события. Кроме того способность генерировать эпилептиформный события по запросу предоставляет весьма эффективный метод для изучения точную последовательность событий, лежащие в основе их начала. Здесь мы описываем модели корковых захват острый 4-aminopyridine, создан в ткани человека и мыши.

Аннотация

Контроль изъятий остается сложной проблемой для медицинского сообщества. Чтобы добиться прогресса, исследователи нужен способ широко изучать динамику захват и расследовать его основополагающих механизмов. Острый захват модели удобны, предлагают возможность выполнять электрофизиологических записей и может генерировать большой объем электрографические захват как (во) событий. Многообещающие результаты от острой захват модели можно затем передовые модели хронической эпилепсии и клинических испытаний. Таким образом изучая изъятий в острый модели, которые точно повторяют электрографические и динамические подписи клинических конфискации будет необходимо для изготовления клинически значимых выводов. Изучение во события в моделях острый захват, приготовленный из тканей человека также имеет важное значение для создания результатов, которые клинически значимых. Основное внимание в настоящем документе уделяется корковых модель 4-AP благодаря своей универсальности в генерации противоречивых событий, как в естественных условиях , так и в пробирке исследования, а также в мышь и тканей человека. Методы в этом документе будет также описать альтернативный метод индукции захват с помощью нуль-мг^{2 +} модели и предоставляют подробный обзор преимуществ и ограничений эпилептиформный как деятельности, созданных в различных острых захват модели. Кроме того воспользовавшись коммерчески доступных optogenetic мыши штаммов, Бриф (30 мс) светового импульса может использоваться для запуска противоречивых событий, идентичны тем, которые происходят спонтанно. Аналогичным образом 30-100 мс затяжек нейромедиаторов (гамма-амино-масляная кислота или глутамата) может применяться к человеческой ткани, чтобы спровоцировать приступ события, которые идентичны происходит спонтанно. Возможность вызвать приступ события по требованию в модели острого захват предлагает новообретенным способность соблюдать точную последовательность событий, которые лежат в основе динамики инициации захвата и эффективно оценить потенциальные Антиконфискации терапии.

Введение

Острый захват модели можно успешно воспроизвести электрографические подписей напоминает противоречивых событий, наблюдаемые в электроэнцефалограммы (ЭЭГ) лиц, испытывающих захват. Исследователи используют эти приступ как события (далее именуемая «приступ события») как суррогаты для захвата событий¹. Клинически приступ события служат в качестве надежного прокси для захвата событий после изъятия являются неврологическое расстройство, которое исходит от мозга. В группе контроля эпилепсии неврологи полагаться при обнаружении противоречивых событий для подтверждения эпилептогенных область мозга и изолировать его резекции². В отделение интенсивной терапии врачи контролировать приступ активность оценить если любой захват активность сохраняется в седативных больных³. Управление изъятий остается сложным вопросом для медицинского сообщества, как 30% больных эпилепсией лекарственно доступных лекарств^4,5, и 10% медицинских случаев, связанных с наркотиками индуцированной изъятий не реагируют на стандартное лечение³. Это представляет серьезную озабоченность для общества, как 3% ожидается разработка эпилепсией⁶и 10% американского населения разведано испытать один захват события в их жизни.

Изучая изъятий в хронической эпилепсии модели дорого, трудоемкий и часто принимают месяцев подготовить⁷. Это также трудно выполнить электрофизиологических записей в свободно перемещающихся животных. Клинические испытания на человеке сталкиваются с аналогичными вопросами, а также дополнительных сложностей, связанных с согласия пациента, изменчивость в участников стола и нравственные и этические соображения участвуют⁸. Острый захват модели, с другой стороны, являются благоприятными, потому что они являются относительно удобно готовить, экономически эффективным и способны генерировать большие объемы противоречивых событий для изучения⁹. Кроме того ткань фиксируется в устойчивом положении, поэтому условия являются идеальными для выполнения электрофизиологических записи, необходимые для изучения динамики захват и соответствующих базовых патофизиологии. Острый захват модели остаются благоприятное течение в silico (компьютер) модели, потому что они основаны на биологический материал, состоящий из мозга составляющих нейронной сети со всеми его присущи факторы и синаптическую подключения, которые не могут быть захвачены даже самые подробные компьютер моделирует¹⁰. Эти особенности делают острым захват модели poised для того чтобы быть эффективным на скрининг для потенциальных терапий Антиконфискации и сделать предварительные выводы до продвижения их для дальнейшего расследования в модели хронической эпилепсии и клинические испытания.

Как правило острый захват модели являются производными от нормальной ткани мозга, был подвергнут гипер возбудимых условий. Чтобы побудить клинически значимых приступ события в здоровых мозговой ткани, важно понимать, что мозг функционирует оптимально в критическом состоянии¹¹ где возбуждения (E) и ингибирование (I) являются сбалансированным¹². Срыв E-я баланса может привести к гипер возбудимых захват государства, в котором осадок во события. Соответственно, в рамках этой концептуальной основы, существуют две основные стратегии для создания противоречивых событий в срезах головного мозга (в пробирке) или в целом мозг (в естественных условиях) препараты: либо уменьшилась ингибирование («растормаживания») или увеличить возбуждение («не расторможенность»). Однако приступ события высоко приказал и синхронизировать события, которые требуют влияние ГАМК интернейронов оркестровать нейронной сети деятельность^13,14. По этой причине не расторможенность модели являются наиболее эффективными для генерации противоречивых событий в изолированных нейронных сетей, таких, как в в vitro мозга ломтик¹⁵, тогда как в vitro расторможенность модели обычно приводят к пики активности напоминает межприступная как пики. Кроме того в рамках этой концептуальной основы, мгновенный синхронизации событий также надежно может вызвать приступ событий¹⁶. В самом деле приступ события могут быть вызваны любые незначительные возмущения, применяется к нервной системы¹⁷ , когда она находится в критическом состоянии перехода («раздвоения») точки¹⁸. Традиционно эти возмущения были вызваны электрической стимуляции. Однако, недавнее развитие Оптогенетика в неврологии, теперь предлагает стратегию более элегантный побудить критическое состояние переходов¹⁶.

Методы, описанные в этой статье демонстрируют, как генерировать приступ события по требованию в модели острого захват в пробирке (шаг 1 из протокола) и в vivo исследований (шаг 2 из протокола). Они включают в себя выбор области мозга, захват индукционного метода, тип исследования и видов; Однако основное внимание будет уделяться рекомендуется выбор модели острого 4-AP корковых захват из-за своей универсальности в самые разнообразные типы изучения. 4-AP захват острой в vitro модель основана на стандартный протокол подготовить срезы мозга высокого качества для электрофизиологических записей и томографии исследования¹⁹. Эти протоколы уже использовались сделать в vitro корональных мозга кусочка от соматосенсорные моторной коры мышей^16,людей и^{20 21}. Модификации для создания противоречивых событий в этих типах срезы мозга были ранее продемонстрировали¹⁶ и все детали описаны в протоколе ниже. 4-AP корковых захват острой в vivo модель основана на стандартный протокол подготовить краниотомии для изображений исследования²². Модификация является, что окно не (стеклянное скольжение) установлена после краниотомии. Вместо этого proconvulsant агентами (4-AP) местно применяются к воздействию коры побудить противоречивых событий, в то время как животное находится под общей анестезией. Насколько нам известно наша группа была первым, чтобы развивать этот острый в vivo корковых захват модели в мышей^16,23. Острой в естественных условиях 4-AP корковых изъятия из взрослых мышей была разработана модель для дополнить модель в vitro фрагментов из несовершеннолетних ткани. Репликации выводов взрослых в vivo захват модели позволяет обобщить результаты срез модели, присущие озабоченностей относительно-физиологических условиях ломтиком 2D мозга (по сравнению с объемной целом мозг структура) и физиологические различия между несовершеннолетних и взрослых ткани.

Метод по требованию противоречивых событий посвящения подтверждается с помощью либо затяжек нейротрансмиттеров с picospritzer или optogenetic стратегии. В меру наших знаний наша группа является первым, чтобы инициировать приступ события в тканях человека с помощью нейротрансмиттеров через picospritzer¹⁶. Для optogenetic стратегии штамм мышей C57BL/6 является обычным штамм используется для выражения трансгенов. Выражение channelrhodopsin-2 (ChR2) в ГАМК интернейронов или пирамидальных клеток глутаматергические обеспечит Факультативный способность генерировать противоречивых событий по запросу с кратким световых импульсов. Подходит optogenetic мышей штаммов включают коммерчески доступных вариант C57BL/6, который выражает ChR2 в любом интернейронов, с помощью мыши везикулярного ГАМК транспортер активаторных (VGAT)²⁴, или пирамидальных клеток, с помощью мыши вилочковой железы клетки антиген 1 Promotor (Thy1)²⁵. Эти коммерчески доступных VGAT-ChR2 и Thy1-ChR2 мышей предлагают возможность активации ГАМК нейронов или глутаматергические нейронов, соответственно, в коры головного мозга с синим (470 Нм) свет. Способность генерировать противоречивых событий по требованию в модели острого захват может предложить новые возможности для изучения динамики инициации захвата и эффективно оценить потенциальные Антиконфискации терапии.

протокол

Все исследования, с участием пациентов была выполнена под протоколом, утвержденным Советом университета здравоохранения сети исследований этики, в соответствии с Хельсинкской декларации. Процедуры с участием животных были в соответствии с принципами, Канадского совета по лечению животных и утвержденных Комитетом Krembil исследовательский институт животное уход.

1. Протокол I: острые в vitro захват модель

1. Подготовка решений диссекции и искусственных спинномозговой жидкости
   1. Carbogenate ультрачистая вода (вода фильтруется с удельным сопротивлением 18.2 MΩ·cm) с Карбоген (95% O₂/5% CO₂) за 5 минут с помощью воздуха камень пузыря диффузоры (аэраторы для аквариумов).
      Примечание: Air камней может подключаться к Карбоген танк регулятор через Стандартный Силиконовая трубка. Если воздух камни не доступны, печать закрыть к концу трубки силиконовые и совать небольшие отверстия в уплотнении разрешить Карбоген газ в пузырь и carbogenate решения.
   2. Приготовляют раствор рассечение, растворяя растворенных веществ из таблицы 1 в ультрачистая вода. CaCl₂ добавьте в решение, которое было carbogenated по крайней мере 5 минут, чтобы помочь ей раствориться.
      Примечание: Кроме того, добавьте CaCl₂ первых, так что он может легко растворяются в ненасыщенных решения. Решение, в жидкой форме, должны быть 300-320 мОсм/Л и имеют рН 7,4 после насыщения с Карбоген.
      1. Холод решение рассечение 0 - 4 ° C. Оставьте раствор в холодильнике на ночь или поместите решение в морозилке 1 h и постоянно контролировать температуру.
         Примечание: Рассечение раствор может храниться до 3 ночи; После отмены.
      2. Carbogenate вскрытие решение для 5-10 мин перед использованием.
         Примечание: В идеале, решение либо должен отображаться как слякоть или переходит в слякоть до использования.
   3. Подготовьте грызунов искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО), растворяя растворенных веществ из таблицы 2 (или 3 таблицы для человека фаго) в ультрачистая вода. Carbogenate фаго решение пока он находится в ванне с водой, нагретой до 35 ° C до использования. CaCl₂ добавьте в решение, которое было carbogenated по крайней мере 5 минут, чтобы помочь ей раствориться.
      Примечание: в качестве альтернативы, сначала добавьте CaCl₂ так, что он может распустить легче в ненасыщенных решения. Решение, в жидкой форме, должны быть 290-320 мОсм/Л и имеют рН 7,4 после насыщения с Карбоген. Решения должны производиться в тома 1, 2 или 4 Л в зависимости от продолжительности экспериментов. Сделайте 4 L на полный день (8 h) экспериментов. ФАГО следует включить свежие каждый день; не хранить его для дольше чем 1 d.
2. Рассечение мышь для сбора ткани мозга
   Примечание: Для человеческой ткани, переходите к следующему шагу (шаг 1.3) на делать срезы мозга с vibratome. Куб образные блоки (1 см³) мозговой ткани должны быть получены от нейрохирург, с помощью процедуры описано^26,27.
   1. Соберите все инструменты и материалы, необходимые для животных вскрытия. Настройка рабочей области для подготовки к анатомирование животных.
      1. Проверьте танк Карбоген (95 %O₂/5%CO₂), чтобы убедиться, что он не пуст. Замените газовый баллон перед эксперименты, если есть меньше, чем 500 psi остаточное давление.
      2. Калибровка vibratome (вибрирующих резки ткани лезвие) согласно инструкции производителя. Отрегулируйте vibratome, установка для резки амплитуда 1 мм и скорости резки 0.12 мм/сек.
         Примечание: Оптимальные настройки могут отличаться для каждого индивидуального вибрирующий ткани лезвие резак; Однако в целом, амплитуда должен быть высоким и скорость резки должны быть низкими.
      3. Заполните срез мозга инкубации палата (то есть, хранитель срез мозга) с фаго и пузырь с Карбоген. Затем поместите камеру инкубации в водяной бане на 35 ° C.
         Примечание: Используйте грызунов фаго для грызунов мозга ломтиками и человека фаго фрагментов человеческого мозга.
   2. Получите мышь несовершеннолетних обоего пола, в возрасте 13 d (p13) до 21 d (p21, где Р0 — Дата рождения).
   3. Анестезировать мыши с внутрибрюшинного введения Пентобарбитал натрия (55 мг/кг веса тела). После того, как мышь глубоко под наркозом, как свидетельствует отсутствие мыс щепотку рефлекс, оперативно используйте инструмент ветеринар утвержденного гильотинные обезглавить мыши одним быстрым движением.
      Примечание: Подготовьте инъекции Пентобарбитал натрия согласно процедурам, рекомендованным институциональных руководящих принципов.
   4. Держите нос мыши стабилизировать обезглавленное голову и осторожно сделать срединной линии разреза, начиная между глазами мыши и по всей длине головы, чтобы разоблачить черепа. Убедитесь, что череп не сжимается, давление бритвы. Используйте углу лезвие бритвы для повышения точности резки.
   5. Раскрывайте закрылки мыши головы с помощью пальцев подвергать черепа. Затем используйте свежие угол лезвие бритвы для надрезают вдоль средней линии черепа; Обратите особое внимание, чтобы избежать каких-либо контактов с коры головного мозга.
   6. Вставить заноза щипцами в мыши глазницами стабилизировать обезглавленное головы и поместите его в чашку Петри, наполненный холодной (0 - 4 ° C) рассечение решения. Убедитесь, что глава полностью погружен в раствор рассечение.
   7. Использовать второй набор заноза щипцами осторожно удаляйте мыши волосистой части головы, удалить кости носа, пилинг его и снимите заднюю (хвостовой части) черепа.
      Примечание: Кости носа несовершеннолетних мышей очень мягкие и легко ломаются.
   8. Лопаточкой микро вырезать зрительных нервов, тройничного нервов и спинного мозга. Затем используйте микро лопаткой осторожно отделить мозг от черепа. Оставьте мозг, полностью погружен в Петри, заполненные раствором рассечение.
3. Подготовка корковых фрагменты из соматосенсорные моторной коры
   1. Заполните vibratome буфер лоток с ~ 150 мл холодной (0 - 4° C) рассечение решения.
      Примечание: При необходимости, держите лоток буфера в морозильник до тех пор, пока требуется для поддержания низкой температуры во время нарезки процедуры.
   2. Клей ткани мозга от мыши или человека на vibratome сцену (образец держатель/лоток) с помощью мгновенного клея клей. Для мышей отрезать небольшой хвостовой части мозга (то есть, мозжечка) так, что она может быть легко наклеиваются плоский держатель образца (позволяя ростральной стороне мозга грозит потолок).
      Примечание: в качестве альтернативы, срезы мозга горизонтальные мыши можно приготовить путем склеивания спинной стороне мозга на держатель образца (вентральной стороне мозга следует лицо потолок)²⁸.
   3. Осторожно поместите держатель образца (с ткани мозга) в панели буфера. Убедитесь, что спинная часть мозга сталкивается с vibratome лезвие.
      Примечание: Очень важно, чтобы свести к минимуму количество времени, что мозг подвергается воздействию воздуха.
4. Секционирование ткани мозга и коллекции
   1. Срез мозга ломтиками 450 мкм толщиной с использованием vibratome в спинной вентральной направлении. Убедитесь, что мозг остается полностью якорь трей образца при нарезке его.
      1. Сделайте первый разрез в мозг мыши, чтобы удалить обонятельные луковицы. Затем сделайте последующее сокращение до тех пор, пока соматосенсорные мотор области наблюдается (расположена примерно на полпути между обонятельные луковицы и bregma).
         Примечание: При необходимости, срез мозга в тонкие ломтики (200 мкм) до тех пор, пока мозолистого появляется в представлении корональных мозга, который указывает, что области соматосенсорные мотор близко.
   2. Использование пипетки широкий родила передачи для сбора корональные срезы (450 мкм), которые содержат области соматосенсорные мотор и погрузить их в чашке Петри, содержащие холодной (0 - 4 ° C) рассечение решения.
   3. Используйте новые лезвия бритвы и отрезать любые излишки ткани из кусочков. Для корональные срезы от мышей выполните поперечный, вырезать чуть ниже кортикальное спайки (то есть, мозолистого тела). Не режьте распиловки движения; просто применять давление на лезвии в ткани и использовать подробным кисть осторожно отделить ткани. Убедитесь, что для сведения к минимуму движения корональных фрагмента.
   4. Использование пипетки широкий родила передачи для передачи спинную часть корональных фрагментов, которые содержат коры головного мозга (слой 1-6) для второй Петри наполнен теплой (35 ° C) фаго на мгновение (~ 1 s). Затем оперативно Перенесите ломтики инкубации камеру, содержащую carbogenated фаго теплой (35 ° C).
      Примечание: Перевод на Петри блюдо с фаго предназначен для сведения к минимуму передачи рассечение решения палаты инкубации при передаче срезы мозга с пипеткой широкий родила. Использование инкубации палата организовала несколько скважин держать различные мозга ломтиками.
   5. Отказаться от остальной части мозга и туш животных согласно институциональных руководящих принципов.
5. Инкубация и техническое обслуживание
   1. Оставьте срезы мозга, слегка погруженным в зале инкубации при 35 ° C за 30 мин. Затем удалите зале инкубации из водяной бани и позволить ей вернуться к комнатной температуре (20-25 ° C). Подождите 1 час на срезах мозга для восстановления перед выполнением электрофизиологических записей.
      Примечание: Убедитесь, что нет пузырьков воздуха, которые собирают под срезы мозга в зале инкубации. Пузырьки воздуха, воздуха интерфейсы, которые вызывают повреждение тканей. Срезы мозга мыши может поддерживаться для 6-8 ч, в то время как ткани человеческого мозга может храниться до 24 ч в камере инкубации хорошо carbogenated с соответствующим фаго.
6. Электрофизиологические записи поверхностного слоя коры головного мозга
   Примечание: Приступ события наблюдаются в внеклеточной местах потенциал (LFP) записи из кусочков мозга. LFP срез мозга может быть наблюдается и записал с интерфейса типа камеры²⁹ или системы глубинного несколькими электродами массив (MEA)¹⁶. Процедура была ранее описанных¹⁶ и дополнительные детали описаны ниже.
   1. Используйте широкий родила передачи пипетки или подробным кисти для перемещения кусок мозга на немного больше нарезанные объектив бумагу, которая проводится на месте с помощью стоматологический пинцет. Передать запись камеры объектив бумаги (что ломтик мозг отдыхает после) и зафиксируйте её в положении с экраном арфы.
   2. Выполнения тепло (35 ° C), carbogenated фаго perfusate через запись камеры над срез мозга со скоростью 3 мл/мин (~ 1 поддон/сек). Используйте цифровой термометр, чтобы убедиться, что Камера запись является 33-36 ° C.
   3. Тянуть стеклянных электродов с импеданс 1-3 MΩ от трубки боросиликатное стекло (с наружным диаметром 1,5 мм) с помощью съемника. Засыпки стеклянных электродов с Фаго (~ 10 мкл) с помощью шприца Гамильтон. Если кончик поврежден немедленно отказаться от электрода.
      Примечание: Bleach серебряной проволоки (5 мин) и разрешить только минимальная часть (т.е., кончик) серебряной проволоки в фаго обратно заполнены стеклянных электродов для минимизации шума и дрейф во время записи. Удалите любые излишки фаго из Стеклянный электрод с Гамильтон шприц при необходимости.
   4. Использование 20 X стерео Микроскоп, чтобы точно руководство записи Стеклянный электрод в поверхностных корковых слоев (2/3) с помощью ручного манипуляторов. Запись/вид электрической активности мозга срез на компьютере со стандартным программным обеспечением.
      Примечание: Фрагменты жизнеспособных мозга (высокое качество) представят надежные вызванных потенциалов в ответ на прикладной электрические стимулы (100 МКС, 30-300 МКА) или световых импульсов (30 мс, 10 МВт/мм²) для optogenetic ткани.
7. Индукция захват подобных мероприятий
   1. Perfuse фаго, содержащие 100 мкм 4-aminopyrimidine (4-AP) над срез мозга. Растворите 80 мг 4-ап в 8,5 мл воды, чтобы сделать Стоковый раствор 100 мм 4-AP. 100 мкл 100 мм 4-AP Стоковый раствор 100 мл фаго для достижения фаго perfusate с 100 мкм 4-AP.
      Примечание: в качестве альтернативы, используйте нуль-мг^{2 +} Фаго (Таблица 4), измененные фаго раствор, содержащий не добавлен мг^{2 +}, чтобы perfuse срез мозга. Для тканей человека используйте комбинацию 100 мкм 4-ап в ноль-Mg^{2 +} человека Фаго (Таблица 5) для достижения оптимальных результатов. Среднее время для противоречивых событий появится составляет 15 мин; Однако это может занять до 40 минут для некоторых срезов мозга.
8. По требованию захват поколение: стратегия optogenetic для optogenetic мышей
   1. Применить Бриф (30 мс) пульс синего (470 Нм) свет (с интенсивностью вывода минимум 1 МВт/мм² ) инициировать событие приступ. Используйте ручной манипулятор для размещения 1000 мкм ядро Диаметр оптического волокна (0.39 NA) непосредственно над регионом записи.
      Примечание: Установить скорость фото стимуляции для соответствия желаемой скорости приступ случая (т.е., 1 импульс каждые 50 s). Однако стоимость невозможно переоценить чрезмерно от внутренней скорости, на которой происходят события во.
9. По требованию захват поколение: не optogenetic стратегия для тканей человека
   1. Расположите срез мозга поверхностных слоев вверх по течению, и глубокие слои вниз по течению потока perfusate через запись камеры.
   2. Вытяните Стеклянный электрод (тот же тип используется для записи LFP) и нежно коснуться его кончик с стеклоочистителя деликатную задачу создать небольшое отверстие. Засыпки электрод с ~ 25 мкл 100 мм ГАМК (растворимые в воде) и прикрепить его к picospritzer. Кроме того засыпки электрод с 200 мкм глутамата (растворимые в воде).
      Примечание: Для оценки объема пыхтел от picospritzer (~ 50 мкл), примените слоеного теста на пластиковую пластину (предпочтительно сетчатая). Затем Нанесите капельку известных томов (то есть, 10 мкл, 20 мкл, 50 мкл или 100 мкл) с пипетки для сравнения с слоеного теста.
   3. Применить затяжек нейротрансмиттера (ГАМК или глутамата) к человеческой ткани с picospritzer (10-20 psi для 30-100 мс) инициировать событие во. Применить один слойка 100 мм ГАМК на глубокий слой (5) ткани мозга для создания противоречивых событий в поверхностный слой (2/3). Можно также примените один слойка 200 мкм глутамата непосредственно на поверхностный слой для создания противоречивых событий в поверхностном слое.
      Примечание: Установить скорость picospritzer слоеного соответствует желаемой скорости приступ случая (т.е., 1 импульс каждые 50 s). Однако стоимость невозможно переоценить чрезмерно от внутренней скорости, на которой происходят события во.

2. Протокол II: Острый, в естественных условиях изъятия модель

1. Хирургии и хирургической подготовки
   1. Получите взрослых мышь (p35 - p60) любого пола.
   2. Глубоко анестезировать мышь с кетамин (95 мг/кг) и ксилазина (5 мг/кг). Выполните мыс щепотка рефлекс тест, чтобы убедиться, что седативные мыши. Кроме того используйте изофлюрановая (4% для индукции, 1,5-2% для хирургии) чтобы анестезировать мыши.
      Примечание: Выбор анестетиков может повлиять на захват активность^30,31.
   3. Установите мышь в Стереотаксическая рама, обеспечив ее голову с уха баров. Место подогреваемый коврик под мышь на время операции.
   4. Бритья в верхней части головы мыши с помощью грызунов триммер подвергать кожу головы. Inject 0,3 мл лидокаина с 25 G 5/8 в иглу в надкостницы, чтобы избежать чрезмерного кровотечения или боль. Применять мазь глаз к мыши глаза, чтобы предотвратить их от пересыхания во время эксперимента.
   5. Пинч и поднимите центр мыши головы, чтобы оценить, если его рефлексы ушли. Впоследствии выполните горизонтальную Вырезать подвергать bregma лямбда регион черепа. Аккуратно почистить весь подвергаются области черепа с ватным тампоном для создания сухой поверхности.
   6. Выполните краниотомии 4 мм в диаметре на rostrocaudal -2,0 мм и lateromedial координаты 2,0 мм подвергать соматосенсорной коры. Марк местоположение с круга (4 мм в диаметре) с помощью постоянного маркера. Сверло вокруг круга с отбойным молотком зубов до тех пор, пока оставшиеся слой кости краниотомии легко сменяется когда толкнул вниз. Применить физиологический раствор на слой кости перед удалением краниотомии пинцетом заноза. Впоследствии применить теплым физраствором к воздействию региона.
2. Методы записи и химической индукции изъятий
   1. Тянуть стеклянных электродов с импеданс 1-3 MΩ от трубки боросиликатное стекло (с наружным диаметром 1,5 мм) с помощью съемника. Засыпки стеклянных электродов с ~ 10 мкл фаго или физиологического раствора с помощью Гамильтон шприц. Если кончик поврежден немедленно отказаться от электрода.
      Примечание: Bleach серебряной проволоки (5 мин) и разрешить только минимальная часть (т.е., кончик) серебряной проволоки в фаго обратно заполнены стеклянных электродов для минимизации шума и дрейф во время записи. Удалите любые излишки фаго из Стеклянный электрод с Гамильтон шприц при необходимости.
   2. Используйте ручной манипулятор для руководства Стеклянный электрод в поверхностных корковых слоев (2/3) в районе соматосенсорные мотор. Запись/вид электрической активности мозга срез на компьютере со стандартным программным обеспечением.
      Примечание: Layer 2/3 составляет примерно 0,3 мм в глубину от поверхности³².
   3. Местно применяют ~0.5 мл 1,5 мм 4-AP saline на подвергается коры мыши с помощью шприца до тех пор, пока она полностью покрывает краниотомии. Растворите 14 мг 4-ап в 100 мл изотонический солевой раствор сделать Стоковый раствор 1,5 мм 4-AP физиологического раствора.
      Примечание: Подготовьте 4-AP засолены до начала эксперимента. В среднем приступ события появляются 15-30 мин после местного применения.
3. По требованию поколение изъятий в optogenetic мышей
   1. Применить Бриф (30 мс) пульс синего (470 Нм) свет (с интенсивностью вывода менее 10 МВт/мм² ) инициировать событие приступ. Используйте ручной манипулятор для размещения 1000 мкм ядро Диаметр оптического волокна (0.39 NA) непосредственно над регионом записи.
      Примечание: Установить скорость фото стимуляции для соответствия желаемой скорости приступ случая (т.е., 1 импульс каждые 300 s). Однако стоимость невозможно переоценить чрезмерно от внутренней скорости, на которой происходят события во.

Результаты

Применение 100 мкм 4-AP для хорошего качества (неповрежденные) 450 мкм размера коры мозга фрагменты из несовершеннолетних VGAT-ChR2 надежно индуцированной повторяющихся приступ событий мыши (s > 5) в течение 15 мин (Рисунок 1АИ). Применение 100 мкм 4-AP к фрагментам низ...

Обсуждение

Срезы мозга относятся с proconvulsant наркотиков или изменены фаго perfusate увеличить нейросеть в возбудимости и содействовать осадков во события (электрографические захват подобных). Для мышей предпочтительным корональных ломтики области соматосенсорные Мотор должен содержать поясной коры, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium pentobarbital	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Lens paper	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0	N/A	N/A	Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital)	N/A	N/A	Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome	Leica	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)	Scientific Systems Design Inc	N/A
Sodium Chloride (NaCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dextrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sucrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store