설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

요약

급성 발작 모델은 epileptiform 이벤트를 기본 메커니즘을 공부 하 고 중요 합니다. 또한, epileptiform 이벤트에 수요를 생성 하는 기능에는 그들의 개시를 기본 이벤트의 정확한 순서를 공부 하 매우 효율적인 방법을 제공 한다. 여기, 우리가 마우스 및 인간의 조직에 급성 4-aminopyridine 대뇌 피 질의 발작 모델을 설명 합니다.

초록

발작을 제어 의료 사회에 대 한 도전적인 문제에 남아 있다. 진행을 하려면 연구원은 광범위 하 게 발작 역학을 연구 하 고 그것의 근본적인 메커니즘을 조사 하는 방법이 필요 합니다. 급성 발작 모델 편리, electrophysiological 녹음을 수행 하는 기능을 제공 하 고 electrographic 발작 같은 (ictal) 이벤트의 큰 볼륨을 생성할 수 있습니다. 급성 발작 모델에서 유망한 결과 만성 간 질 모델 및 임상 시험을 다음 고급 수 있습니다. 따라서, 급성 모델을 충실 하 게 복제 한 임상의 electrographic 및 동적 서명에서 발작을 공부 하 고 임상 관련 연구 결과 만들기 위한 필수적인 것. 인간 조직에서 준비 하는 급성 발작 모델에서 ictal 이벤트 공부도 임상적으로 관련 된 연구 결과 만들기 위한 중요 하다. 이 문서의 주요 초점이 이다 vivo에서 그리고 생체 외에서 연구 뿐만 아니라 마우스 및 인간의 조직 ictal 이벤트 생성에 그것의 다양성으로 인해 대뇌 피 질 4 AP 모델에. 이 문서에 메서드 또한 0 Mg^{2 +} 모델을 사용 하 여 나포 유도의 다른 방법에 설명 하 고 제공 하는 장점에 대 한 자세한 개요와 다른 생성 된 epileptiform 같은 활동의 한계 급성 발작 모델입니다. 또한, 이용 하 여 상업적으로 이용 가능한 optogenetic의 마우스 긴장, 짧은 (30 ms) 빛 펄스 ictal 이벤트 저절로 발생 동일 하 사용할 수 있습니다. 마찬가지로, 감마 아미노 버터 산 (조미료) 신경 전달 물질의 30-100 ms 퍼프 ictal 이벤트를 동일 저절로 발생 하는 트리거를 인간의 조직에 적용할 수 있습니다. Ictal 이벤트 요청 시 급성 발작 모델에 트리거 수 발작 개시 역학 기초 및 잠재적인 안티 발작 치료를 효율적으로 평가 하는 이벤트의 정확한 순서를 관찰 하는 새로운 기능을 제공 합니다.

서문

급성 발작 모델 성공적으로 electrographic 서명 ictal 이벤트 발작을 경험 하는 개인의 뇌 파 (EEG)에의 연상을 재현할 수 있습니다. 연구원은 대리 모 알선으로 이러한 ictal 같은 이벤트 (여기 'ictal 이벤트' 라고 함)을 사용 하 여 발작 이벤트¹. 임상, ictal 이벤트 발작 이벤트에 대 한 신뢰할 수 있는 프록시 이후 발작 신경 장애는 뇌에서 발생 하는 역할. 간 질 모니터링 장치, 신경과 두뇌의 epileptogenic 영역을 확인 하 고 절제²격리 ictal 이벤트 감지 시 의존 합니다. 집중 치료 단위에 의사 ictal 활동 평가 진정 환자³에서 지속 되는 발작 활동을 모니터링 합니다. 간 질 환자의 30%는 사용 가능한 약물^4,5, 저항 하는 마약 및 약물 유발 발작을 포함 하는 의학 케이스의 10%는 의료 사회에 대 한 도전적인 문제 될 남아 발작을 제어 ³표준 치료 응답 하지 않는. 이 미국 인구의 10%는 prospected 그들의 일생에서 한 발작 이벤트를 경험 하 고 3%는 간 질⁶를 개발 것으로 예상 된다, 사회에 대 한 심각한 우려를 제공 합니다.

만성 간 질 모델에서 발작을 공부 하 고 비싼, 힘 드는, 이며 종종 준비⁷개월 걸릴. 또한 자유롭게 이동 하는 동물에 electrophysiological 녹음을 수행 하기가 어렵습니다. 인간 임상 시험 추가 복잡 한 환자 동의 참가자 들의 배경과 도덕적이 고 윤리적인 고려 사항 관련된⁸에 변화에 관련 된로 서 비슷한 문제, 직면 한다. 급성 발작 모델, 다른 한편으로은 유리한 그들은 상대적으로 비용 효율적인 준비를 편리 하 고 많은 양의 연구⁹ictal 이벤트를 생성할 수 있기 때문에. 또한, 그래서 조건이 발작 역학과 관련 된 기본 이상 공부 하는 데 필요한 electrophysiological 녹음을 수행 하기 위한 이상적인 조직 안정 된 위치에 고정 됩니다. 그들은 생물 학적 재료 모든 고유한 요소 및 캡처할 수 있는 시 냅 스 연결 두뇌의 구성 신경 네트워크의 구성에 기반으로 하기 때문에 급성 발작 모델에 철에 (컴퓨터) 모델을 통해 유리한 유지 심지어는 가장 상세한 컴퓨터에 의해¹⁰모델. 이러한 기능을 효율적으로 잠재적인 안티 발작 치료에 대 한 검사 및 만성 간 질 모델 및 임상 시험에서 추가 조사를 위해 그들을 전진 하기 전에 예비 결과 만드는 것을 급성 발작 모델 있습니다.

일반적으로 급성 발작 모델 하이퍼 고르기 조건에 복종 된 정상 뇌 조직에서 파생 됩니다. 건강 한 뇌 조직에 임상 관련 ictal 이벤트를 유도, 그것은 두뇌 위험 상태¹¹ 에서 최적으로 기능을 이해 하는 것이 중요 여기 (E)와 (I) 억제 있는 균형된¹². E의 중단-내가 균형 ictal 이벤트 침전 하이퍼 고르기 발작 상태로 이어질 수 있습니다. 따라서,이 개념 프레임 워크 내에서 두 가지 주요 전략 두뇌에서 분할 영역 (생체 외에서) 또는 (vivo에서) 모든 두뇌 준비 ictal 이벤트를 생성: 억제 ("disinhibition") 감소 또는 증가 여기 ("비-disinhibition")입니다. 그러나, ictal 이벤트는 매우 주문 하 고 이벤트를 통합 하는 신경 네트워크 활동^13,14GABAergic 수의 영향을 필요로 하는 동기화. 이러한 이유로 비 disinhibition 모델은 격리 된 신경 네트워크에서 생성 ictal 이벤트에 대 한 가장 효과적인 생체 외에서 두뇌 슬라이스¹⁵, disinhibition 모델 체 외에 일반적으로 활동 급상승으로 이어질 반면 같은 interictal 처럼 급상승의 연상. 또한,이 개념적 프레임 워크 내에서 순간 동기화 이벤트를 트리거할 수 있습니다 또한 안정적으로 ictal 이벤트¹⁶. 사실, ictal 이벤트 때 위험 상태 전환 (이 하 "분기") 포인트¹⁸¹⁷ 신경 시스템 적용 된 어떤 작은 섭 동에 의해 트리거될 수 있습니다. 전통적으로,이 물결은 전기 자극에 의해 유도 했다. 그러나 신경 과학, optogenetics의 최근 개발, 지금 위험 상태 전환¹⁶유도 하 더 우아한 전략을 제공 합니다.

이 문서에서 설명 하는 방법 둘 다 생체 외에서 ( 프로토콜의 1 단계) 및 연구를 위한 vivo에서 ( 프로토콜의 2 단계) 급성 발작 모델에 주문형 ictal 이벤트를 생성 하는 방법을 보여 줍니다. 그들은 포함 하는 뇌 영역, 발작 유도 방법, 연구 유형, 및 종;의 선택 그러나, 초점은 학문 종류의 다양 한에 그 다양성으로 인해 급성 4-AP 대뇌 피 질의 발작 모델의 권장된 선택에 있을 것입니다. 급성 체 외에 4 AP 발작 모델 electrophysiological 녹음에 대 한 높은-품질 두뇌 분할 영역을 준비 하는 표준 프로토콜에 기반 하 고 이미징 연구¹⁹. 이러한 프로토콜 이미 체 외에 코로나 두뇌 분할 영역 somatosensory 모터 피 질에서 마우스^16,20 와 인간²¹수 있도록 사용 되었습니다. 수정 이러한 유형의 뇌 조각 ictal 이벤트를 생성 하는 이전 증명¹⁶ 및 상세 프로토콜 아래에 설명 되어 있습니다. 급성 vivo에서 4 AP 대뇌 피 질의 발작 모델 연구²²이미징에 대 한 한 craniotomy를 준비 하는 표준 프로토콜을 기반으로 합니다. 수정 없음 (유리 슬라이드) 창에서 craniotomy를 다음 설치입니다. 대신, proconvulsant 에이전트 (4-ap = 연합 뉴스) 동물 일반 마 취는 하는 동안 ictal 이벤트를 유발 하는 노출된 피 질에 몸에 붙이기도 적용 됩니다. 우리의 지식, 우리의 그룹이 급성 vivo에서 대뇌 피 질의 발작 모델 마우스^16,23에서 개발을 먼저 했다. 급성 vivo에서 4 AP 대뇌 피 질의 발작 모델 성인 쥐에서 준비 청소년 조직에서 생체 외에서 의 조각 모델을 보완 하기 위해 개발 되었다. 성인 vivo에서 발작 모델 결과의 복제 2D 두뇌 슬라이스 (대 3 차원 전체-뇌의 비 생리 적 조건에 대하여 고유한 문제를 해결 하 여 슬라이스 모델에서 연구 결과 일반화 하는 데 도움이 구조)와 청소년 및 성인 조직 간의 생리 적인 차이.

온-디맨드 ictal 이벤트 개시의 메서드는 picospritzer 또는 optogenetic 전략으로 신경 전달 물질의 어느 퍼프를 사용 하 여 보여 줍니다. 우리의 지식 최선을 다 해 우리의 그룹 사용 하 여 신경 전달 물질을 통해 picospritzer¹⁶인간의 조직에 ictal 이벤트 시작 하 처음 이다. Optogenetic 전략, C57BL/6 쥐 긴장 transgenes 표현 사용 기존의 변형이입니다. Channelrhodopsin-2 (ChR2) GABAergic 수 또는 glutamatergic 피라미드 세포의 표현 ictal 이벤트 요청 시 짧은 광 펄스를 생성 하는 옵션 기능을 제공 합니다. 적합 한 optogenetic 쥐 긴장 마우스 기공을 GABA 전송 promotor (VGAT)²⁴또는 마우스 thymus 세포 항 원 1를 사용 하 여 피라미드 세포를 사용 하 여 두 수에 ChR2을 표현 하는 상용 C57BL/6 변형 포함 promotor (Thy1)²⁵. 블루와 피 질에 각각 GABAergic 신경 또는 glutamatergic 뉴런을 활성화 하는 기회를 제공 하는 이러한 상용 VGAT ChR2 및 Thy1 ChR2 마우스 (470 nm) 빛. 급성 발작 모델에 주문형 ictal 이벤트를 생성 하는 기능 발작 개시 역학을 연구 하 고 효율적으로 평가 하는 잠재적인 안티 발작 치료에 새로운 기회를 제공할 수 있습니다.

프로토콜

환자와 관련 된 모든 연구는 헬싱키의 선언에 따라 대학 건강 네트워크 연구 윤리 위원회에 의해 승인 프로토콜에서 수행 되었다. 절차와 관련 된 동물 동물 관리에 캐나다 위원회 지침에 따라 되었고 Krembil 연구 연구소 동물 관리 위원회에 의해 승인.

1. 프로토콜 i: 급성 발작 모델 체 외에

1. 해 부 솔루션 및 인공 중추의 준비
   1. Carbogenate 초순 (이 물 18.2 ㏁의 저항으로 필터링) carbogen (95% O₂/5% CO₂) 5 분을 돌 거품 디퓨저 (수족관 통풍 장치) 공기를 사용 하 여.
      참고: 공기 돌 carbogen 탱크의 레 귤 레이 터를 통해 표준 실리콘 튜브에 연결 수 있습니다. 공기 돌, 사용할 수 없는 경우 인감 실리콘 튜브의 끝을 종료 하 고 밖으로 거품 carbogen 가스 carbogenate 솔루션을 허용 하도록 물개에 있는 작은 구멍을 찌 르 지.
   2. 초순의 표 1 용액을 용 해 하 여 절 개 솔루션을 준비 합니다. CaCl₂ 그것을 분해 수 있도록 적어도 5 분 carbogenated 되어 솔루션에 추가 합니다.
      참고: 또는, 추가 CaCl₂ 먼저, 불포화 용액에 쉽게 녹 일 수 있다. 액체 형태로 솔루션 300-320 mOsm/L와 carbogen 포화 되 고 후 7.4의 산도가지고 있어야 합니다.
      1. 0-4 ° c.를 해 부 솔루션을 진정 하룻밤 냉장고에서 솔루션을 두고 또는 솔루션 1 시간 냉동 실에 놓고 지속적으로 온도 모니터링 합니다.
         주: 해 부 솔루션은 최대 3 박; 저장 될 수 있다 나중에 삭제 합니다.
      2. Carbogenate 사용 하기 전에 5-10 분에 대 한 해 부 솔루션.
         참고: 이상적으로, 솔루션 비 자금으로 표시 하거나 또는 사용 하기 전에 비 자금으로 전환.
   3. 초순에 표 2 (또는 표 3 인간의 실제) 용액을 용 해 하 여 설치류 인공 척수 (실제)을 준비 합니다. Carbogenate 사용까지 35 ° C에가 열 물 욕조에 그것을 동안 실제 솔루션이입니다. CaCl₂ 그것을 분해 수 있도록 적어도 5 분 carbogenated 되어 솔루션에 추가 합니다.
      참고: 또는, 추가 CaCl₂ 먼저 불포화 용액에 쉽게 녹 일 수 있다. 액체 형태로 솔루션 290-320 mOsm/L와 carbogen 포화 되 고 후 7.4의 산도가지고 있어야 합니다. 솔루션에 실험의 기간에 따라 1, 2, 또는 4 L 볼륨 여야 한다. 4 하루 종일 (8 h) 실험에 대 한 확인 합니다. 실제 여야 한다 신선한 각 하루; 1 일 이상 보관 하지 마십시오.
2. 마우스 해 부 뇌 조직 수집 하
   참고: 인간의 조직에 대 한 다음 단계 (단계 1.3)는 vibratome와 함께 두뇌 분할 영역 만들기를 진행 합니다. 뇌 조직의 큐브 모양의 블록 (1 c m³) 프로시저 앞에서 설명한^26,27을 사용 하 여 신경 외과에서 얻을 수 한다.
   1. 모든 도구와 동물 해에 필요한 자료를 수집 합니다. 동물 해 준비 하는 작업 영역을 설정 합니다.
      1. 비어 있지 않은 있도록 carbogen 탱크 (95% O₂/5%CO₂)를 확인 하십시오. 미만 500 psi 압력 남아의 경우 실험 전에 가스 실린더를 교체 합니다.
      2. 제조업체의 설명서에 따라 vibratome (진동 블레이드 조직 slicer) 보정. 1 m m의 절단 진폭과 0.12 m m/s의 절삭 속도를 설정 하는 vibratome를 조정 합니다.
         참고: 최적의 설정은 각 개별 진동 조직 블레이드 커터;에 대 한 다를 수 있습니다. 그러나, 일반적으로 진폭 높은 해야 하 고 절삭 속도 낮은 되어야 합니다.
      3. 실제와 뇌 조각 인큐베이션 챔버 (즉, 뇌 조각 골키퍼)와 carbogen와 거품. 35 ° c.에 설정 물 욕조에 부 화 챔버 장소
         참고: 설치류 뇌 조각 및 인간 두뇌 분할 영역에 대 한 인간의 실제 쥐 실제 사용 합니다.
   2. 어느 섹스 13 d (p13) 21 d (p21, p0은 출생의 날짜)의 나이 사이 소년 마우스를 가져옵니다.
   3. Sodium pentobarbital (체중의 55 mg/kg)의 복 주사와 마우스 anesthetize 마우스는 마 취 깊이 발가락 핀치 반사의 결핍에 의해 표시 된 대로, 일단 목을 벨 한 빠른 움직임에 마우스를 즉시 수 의사 승인 단두대 악기를 사용 합니다.
      참고: 나트륨 pentobarbital 주입 기관 지침에서 권장 하는 절차에 따라 준비 합니다.
   4. 잘린된 머리를 안정 하 고 부드럽게 시작 마우스의 눈 사이 두개골을 노출로 두 피의 전체 길이 따라 절 개를 중간에 마우스의 코를 잡으십시오. 두개골은 면도칼으로 적용 하는 압력에 의해 압축 되지 않습니다 확인 하십시오. 면도기의 가장자리의 모서리를 사용 하 여 절단된 정밀도 증가.
   5. 손가락을 사용 하 여 두개골을 노출 하는 마우스의 피의 날개 떨어져 확산. 를 사용 하 여 면도기의 가장자리의 신선한 코너 두개골;의 중간 선 따라 절 개 대뇌 피 질과 어떤 접촉을 피하기 위해 주의 지불 합니다.
   6. 마우스의 잘린된 머리를 안정화 하는 페 트리 접시에 눈 소켓으로 삽입 가시 집게 감기 (0-4 ° C)로 가득 해 부 솔루션. 머리 해 부 솔루션에 빠져들 완벽 하 게 확인 하십시오.
   7. 스프린터 집게의 두 번째 세트를 사용 하 여 부드럽게 벗 겨 마우스의 두 피, 그것을 박 리 하 여 코 뼈를 제거 하 고 두개골의 뒤로 (꼬리 쪽)를 제거 합니다.
      참고: 청소년 마우스의 코 뼈는 매우 부드럽고 쉽게 깨지지.
   8. 마이크로 주걱을 사용 하 여 시 신경, trigeminal 신경, 척수를 잘라. 그런 다음, 마이크로 주걱을 사용 하 여 부드럽게는 두개골에서 뇌를 분리. 뇌 해 부 솔루션으로 가득 페 트리 접시에 완전히 빠져들 둡니다.
3. 대뇌 피 질의 조각 somatosensory 모터 피 질에서의 준비
   1. 감기 (0-4 ° C)의 ~ 150 mL vibratome의 버퍼 트레이 채우기 해 부 솔루션.
      참고: 필요에 따라 조각화 절차 동안 낮은 온도 유지 하는 데 필요한 때까지 냉동 실에 버퍼 트레이 유지.
   2. 마우스 또는 인스턴트 접착제 접착제를 사용 하 여 vibratome 단계 (견본 홀더/트레이)에 인간의 뇌 조직 접착제. 마우스에 대 한 (즉, 소 뇌) 두뇌의 작은 부분을 꼬리를 잘라 편평한 견본 홀더 (얼굴을 천장에 두뇌의 rostral 측면 허용)에 쉽게 붙어 있을 수 있도록.
      참고: 또는 수평 마우스 뇌 조각 준비 될 수 있다 (뇌의 복 부 측 천장 직면 한다) 견본 홀더에 뇌의 등 쪽 측을 접착제로 하 여²⁸.
   3. 부드럽게 버퍼 트레이에 (뇌 조직)와 견본 홀더를 놓습니다. 뇌의 등 쪽 부분 vibratome의 블레이드를 직면 하고있다 확인 하십시오.
      참고: 그것은 뇌 공기에 노출 되는 시간을 최소화 하기 위해 중요 한입니다.
4. 뇌 조직의 구분 및 수집
   1. 복 부 방향으로 등 쪽에 vibratome를 사용 하 여 450 μ m 두꺼운 조각으로 두뇌를 슬라이스. 그것은 조각화 하는 동안 두뇌 남아 견본 쟁반에 완전히 고정 된 확인 하십시오.
      1. 후 각 전구를 제거 하는 쥐의 뇌에서 첫 번째 컷을 확인 합니다. 그런 다음 할 후속 상처 somatosensory 모터 지역 (嗅와 bregma 사이 대략 중간에 위치한) 관찰 때까지.
         참고: 필요에 따라 슬라이스 얇은 (200 μ m) 조각 신체 callosum somatosensory 모터 지역에는 두뇌의 코로나 보기에 나타날 때까지 두뇌는 가까운.
   2. 넓은 구멍 전송 피 펫을 사용 하 여 코로나 조각 (450 μ m)와 추위 (0-4 ° C)를 포함 하는 페 트리 접시에 잠수함 somatosensory 모터 영역을 포함 하는 수집 해 부 솔루션.
   3. 새로운 면도날을 사용 하 고 조각에서 어떤 과잉 조직을 잘라. 쥐에서 코로나 조각에 대 한 (즉, 신체 callosum) neocortical commissure 바로 아래를 잘라 가로 수행 합니다. 톱 모션; 잘라 하지 마십시오 단순히 조직에 잎에 압력을 적용 하 고 부드럽게 조직을 세부 브러시를 사용 하 여. 코로나 조각의 움직임을 최소화 해야 합니다.
   4. 사용 순간 따뜻한 (35 ° C) 실제가 가득한 두 번째 페 트리 접시 (레이어 1-6) 피 질을 포함 하는 코로나 조각의 지 느 러 미 부분을 전송 하는 넓은 구멍 전송 피 펫 (~ 1 s). 다음, 신속 하 게 따뜻한 (35 ° C) carbogenated 실제를 포함 하는 인큐베이션 챔버 슬라이스 전송.
      참고: 실제와 페 트리 접시에 전송 목적 넓은 구멍 피 펫과 두뇌 분할 영역을 전송 하는 동안 보육 실 해 부 솔루션의 이전을 최소화 하는. 인큐베이션 챔버의 다른 뇌 조각 계속 여러 우물 조직 활용 합니다.
   5. 두뇌와 기관 지침에 따라 동물 시체의 나머지 부분을 삭제 합니다.
5. 보육 및 유지 보수
   1. 30 분 동안 35 ° C에 외피 상공에 약간 빠져들 뇌 조각을 두십시오. 그런 다음, 물 목욕에서 인큐베이션 챔버를 제거 하 고 실내 온도 (20-25 ° C)로 돌아갈 수 있도록. 1 h electrophysiological 녹음을 수행 하기 전에 복구 두뇌 분할 영역에 대 한 기다립니다.
      주: 아래 보육 실에서 뇌 조각 수집 없습니다 기포는 확인 하십시오. 기포는 조직 손상을 공기 인터페이스. 인간의 뇌 조직의 적절 한 실제와 잘 carbogenated 보육 실에서 24 시간까지 저장할 수 있습니다 하는 동안 마우스 뇌 조각 6-8 시간, 유지할 수 있습니다.
6. 표면 외피 층의 electrophysiological 녹음
   참고: Ictal 이벤트 extracellular 로컬 필드 가능성 (LFP) 녹음 두뇌 조각에서 관찰 된다. 뇌 조각의 LFP 관찰 하 고 인터페이스 형식 챔버²⁹ 또는 침수 다중 전극 배열 (MEA) 시스템¹⁶기록 수 있습니다. 절차는 앞에서 설명한¹⁶ 되었으며 추가 세부 정보는 아래에서 설명 합니다.
   1. 넓은 구멍 전송 피 펫 또는 세부 브러시 사용 하 여 치과 족집게를 사용 하는 장소에서 개최 되는 약간 큰 미리 잘라 렌즈 종이에 두뇌 슬라이스를 이동. 녹음 실에는 렌즈 종이 (뇌 조각에 휴식 하 고)를 전송 하 고 하프 화면 위치에 그것을 확보.
   2. 실행된 따뜻한 (35 ° C), carbogenated (~ 1 물방울/s) 3 mL/min의 속도로 뇌 조각을 통해 녹음 챔버를 통해 실제 perfusate. 디지털 온도계를 사용 하 여 녹음 실 한지 33-36 ° c.
   3. 당겨 유리 전극 (1.5 m m의 외부 직경)와 붕 규 산 유리 배관에서 1-3 m ω의 임피던스를 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 백필 실제와 유리 전극 (~ 10 µ L) 해밀턴 주사기를 사용 하 여. 팁 손상 되 면 전극을 즉시 삭제 합니다.
      참고: Bleach 실버 와이어 (5 분) 그리고 녹음 시 잡음과 드리프트를 최소화 하기 위해 실제 다시 채워진 유리 전극에 빠져들 수 실버 와이어의 최소한의 부분 (즉, 팁) 허용. 해밀턴 주사기 필요한 경우 유리 전극에서 어떤 과잉 실제를 제거 합니다.
   4. 사용 20 X 스테레오 현미경 정확 하 게 가이드 녹음 유리 전극은 표면에 대뇌 피 질의 레이어 (2/3)를 사용 하 여 수동 조작. 기록/보기 뇌 조각의 전기 활동 표준 소프트웨어와 컴퓨터에.
      참고: 실행 가능한 (고품질) 뇌 조각 적용된 전기 자극 (100 µs, 30-300 µ A) 또는 광 펄스 (30 ms, 10 mW/m m²) optogenetic 조직에 대 한 응답으로 강력한 갖는 잠재력을 전시할 것 이다.
7. 발작 같은 활동의 유도
   1. 실제 뇌 조각 이상 포함 하는 100 µ M 4-aminopyrimidine (4-AP) perfuse 4-4-AP 100 µ M와 실제 perfusate를 달성 하는 실제의 100 mL를 100 µ L 100 m m 4 AP 재고 솔루션의 추가 100 m m 4-AP.의 재고 솔루션으로 만들기 위해 물 8.5 mL에 AP의 80 mg을 디졸브.
      참고: 또는 사용 0 Mg^{2 +} 실제 (표 4), 포함 된 없음 추가 Mg^{2 +}, 수정된 실제 솔루션 perfuse 뇌 조각에. 인간의 조직에 대 한 0 Mg^{2 +} 인간의 실제 (표 5) 100 µ M 4-ap 통신의 결합을 사용 하 여 최적의 결과 달성 하기 위해. 나타나는 ictal 이벤트에 대 한 평균 시간은 15 분; 그러나, 그것은 일부 뇌 조각에 대 한 최대 40 분까지 걸릴 수 있습니다.
8. 주문형 발작 세대: optogenetic 마우스에 대 한 optogenetic 전략
   1. 파란색의 개요 (30 ms) 펄스를 적용 (470 nm) 빛 (최소 1 mW/m m² 출력 강도) ictal 이벤트 시작. 수동 조작 기를 사용 하 여 녹화 영역 바로 위에 1000 µ m 코어 직경 광섬유 (0.39 없음) 위치.
      참고: 설정 ictal 이벤트 발생의 원하는 속도 맞게 사진 자극의 속도 (즉, 1 펄스 마다 50 s). 그러나, 속도 ictal 이벤트 발생 기본 속도에서 지나치게 과장 될 수 없다.
9. 주문형 발작 세대: 인간의 조직에 대 한 비 optogenetic 전략
   1. 되도록 표면 레이어는 업스트림, 그리고 깊은 층 녹음 챔버를 통해 perfusate의 흐름에 다운스트림 두뇌 슬라이스를 놓습니다.
   2. 작은 개통을 만들려고 섬세 한 작업와이 퍼와 함께 끝을 부드럽게 터치를 유리 전극 LFP 녹음에 대 한 사용 (같은 종류)를 당기고. 백필 100mm GABA (물에 녹아 있는)의 25 µ L와 전극에는 picospritzer. 또는, 백필 200 µ M 조미료 (물에 녹는)와 전극.
      참고: picospritzer (~ 50 µ L)에서 부풀어 되 고 볼륨을 추정, 테스트 퍼프 플라스틱 플레이트 (선호 gridded)에 적용 됩니다. 다음, 테스트 퍼프와 비교에 대 한 피 펫으로 알려진된 볼륨 (즉, 10 µ L, 20 µ L, 50 µ L, 또는 100 µ L)의 방울을 적용 합니다.
   3. Ictal 이벤트를 시작 하는 picospritzer (30-100 ms에 대 한 10-20 psi)와 인간의 조직에 신경 전달 물질 (GABA 또는 글루타민 산 염)의 퍼프를 적용. 표면 층에 ictal 이벤트를 생성 하는 뇌 조직의 깊은 레이어에 (5) 100 mM GABA의 단일 퍼프를 적용 (2/3). 또는 이벤트를 생성 하 ictal 표면 층에서 표면 층에 직접 200 µ M 조미료의 단일 퍼프를 적용 됩니다.
      참고: ictal 이벤트 발생의 원하는 속도 맞게 퍼프는 picospritzer의 속도 설정 (즉, 1 펄스 마다 50 s). 그러나, 속도 ictal 이벤트 발생 기본 속도에서 지나치게 과장 될 수 없다.

2. 프로토콜 II: 급성 vivo에서 발작 모델

1. 수술 준비와 수술
   1. 어느 섹스 성인 마우스를 (p35-p60)를 가져옵니다.
   2. 깊이 anesthetize 마우스 마 취 제 (95 mg/kg)와 Xylazine (5 mg/kg). 마우스 진정 되도록 발가락 핀치 반사 테스트를 수행 합니다. 또는, isoflurane 유도, 수술에 대 한 1.5-2% (4%)을 사용 하 여 마우스를 anesthetize.
      참고: 마 취약의 선택 발작 활동^30,31영향을 줄 수 있습니다.
   3. 귀 바의 머리를 보호 stereotaxic 프레임에 마우스를 탑재 합니다. 수술 하는 동안 마우스 아래 온수 패드를 놓습니다.
   4. 두 피를 폭로 하는 설치류 트리머를 사용 하 여 마우스의 머리의 면도. 과도 한 출혈이 나 통증을 피하기 위해과에 lidocaine의 0.3 mL와 25 G 5/8 바늘에서을 삽입할. 실험 기간 동안 밖으로 건조에서 그들을 방지 하기 위해 마우스의 눈에 눈 연 고를 적용 합니다.
   5. 꼬 집 고 들어 서 마우스의 두 피에는 반사는 사라 졌 어 요 경우 평가의 중심. 그 후, 두개골의 람다 지역 bregma 노출 잘라 가로 수행 합니다. 부드럽게 건조 표면을 만들 면봉으로 두개골의 전체 노출된 영역을 긁어.
   6. Somatosensory 피 폭로 좌표 2.0 m m-2.0 m m와 lateromedial rostrocaudal에서 직경에서 4mm의 craniotomy를 수행 합니다. 영구 마커를 사용 하 여 원형 (4 mm에 직경)를 가진 위치를 표시 합니다. 와 함께 공 압 치과 craniotomy 뼈의 나머지 계층까지 주위 드릴에는 쉽게 다운할 때 방법을 제공 합니다. 뼈의 레이어에 염 가시 집게와는 craniotomy를 제거 하기 전에 적용 됩니다. 그 후, 노출 된 지역에 따뜻한 식 염 수 솔루션 적용.
2. 녹음 방법 및 발작의 화학 유도
   1. 당겨 유리 전극 (1.5 m m의 외부 직경)와 붕 규 산 유리 배관에서 1-3 m ω의 임피던스를 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 백필 실제 또는 식 염 수 사용 하는 해밀턴의 ~ 10 µ L와 유리 전극 주사기. 팁 손상 되 면 전극을 즉시 삭제 합니다.
      참고: Bleach 실버 와이어 (5 분) 그리고 녹음 시 잡음과 드리프트를 최소화 하기 위해 실제 다시 채워진 유리 전극에 빠져들 수 실버 와이어의 최소한의 부분 (즉, 팁) 허용. 해밀턴 주사기 필요한 경우 유리 전극에서 어떤 과잉 실제를 제거 합니다.
   2. 수동 조작 기를 사용 하 여 유리 전극은 표면에 대뇌 피 질의 안내 somatosensory 모터 지역에 레이어 (2/3). 기록/보기 뇌 조각의 전기 활동 표준 소프트웨어와 컴퓨터에.
      참고: 레이어 2/3는 약 0.3 m m³²의 표면 깊은 곳에서.
   3. 몸에 붙이기도 적용 ~0.5 mL 1.5 m m 4 AP는 마우스의 노출된 피에 염 분 주사기까지 완전히에서 craniotomy를 다루고. 4-1.5 m m 4 AP 염 분의 재고 솔루션 isotonic 식 염 수 100 mL에 AP의 14 mg을 디졸브.
      참고: 실험 시작 하기 전에 4 AP 염 분을 준비 합니다. 평균, ictal 이벤트 국 소 응용 프로그램 후 15-30 분 나타납니다.
3. Optogenetic 마우스에 발작의 온-디맨드 세대
   1. 파란색의 개요 (30 ms) 펄스를 적용 (470 nm) 빛 (최소 10 mW/m m² 출력 강도) ictal 이벤트 시작. 수동 조작 기를 사용 하 여 녹화 영역 바로 위에 1000 µ m 코어 직경 광섬유 (0.39 없음) 위치.
      참고: 설정 ictal 이벤트 발생의 원하는 속도 맞게 사진 자극의 속도 (즉, 1 펄스 마다 300 s). 그러나, 속도 ictal 이벤트 발생 기본 속도에서 지나치게 과장 될 수 없다.

결과

100 µ M 4-AP의 좋은-품질 (손상된) 450 µ m 크기의 대뇌 피 질의 뇌 조각 하는 청소년 VGAT ChR2 안정적으로 유도 된 마우스 재발 ictal 이벤트에서 (> 5 s) 15 분 (1Ai 그림) 내에서 응용 프로그램. 100 µ M 4-AP의 가난한 품질의 조각에 응용 프로그램 이벤트를 파열 또는 활동 (그림 1Aii) 급상승 귀착되는. 평균, 각 해 부 쥐의 뇌에서 조각의 40%?...

토론

뇌 조각 proconvulsant 약물 또는 신경 네트워크의 흥분 성 증가 ictal 이벤트 (electrographic 발작 같은 이벤트)의 강 수를 홍보 하는 변경 된 실제 perfusate와 함께 처리 됩니다. 마우스 모터 somatosensory 영역의 기본 코로나 조각 있어야 대상 피 질, 지역 2 (CG), 그러나 retrosplenial 지역 (RS); 하지 이 해 부 마커 ictal 이벤트 유도 적합은 코로나 조각의 범위를 식별할. 두 개의 반구는 거의 동일 (비슷한 실험 단위)?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium pentobarbital	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Lens paper	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0	N/A	N/A	Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital)	N/A	N/A	Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome	Leica	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)	Scientific Systems Design Inc	N/A
Sodium Chloride (NaCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dextrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sucrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store