Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Resumo

Modelos de convulsão aguda são importantes para estudar os mecanismos subjacentes epileptiforme eventos. Além disso, a capacidade de gerar eventos epileptiforme sob demanda fornece um método altamente eficiente para estudar a sequência exata de eventos subjacentes a sua iniciação. Aqui, descrevemos os modelos de apreensão cortical aguda 4-aminopiridina estabelecidos em mouse e tecido humano.

Resumo

Controlar convulsões permanece uma questão desafiadora para a comunidade médica. Para progredir, pesquisadores precisam de uma maneira extensivamente estudar a dinâmica de apreensão e investigar seus mecanismos subjacentes. Modelos de convulsão aguda são convenientes, oferecem a capacidade de realizar gravações eletrofisiológicas e podem gerar um grande volume de electrographic apreensão, como de eventos (estável). Os resultados promissores de modelos de convulsão aguda então podem ser avançados para modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos. Assim, estudar convulsões em modelos agudas que reproduzem fielmente as assinaturas electrographic e dinâmicas de uma convulsão clínica será essencial para fazer achados clinicamente relevantes. Estudar eventos estável em convulsão aguda modelos preparados a partir de tecido humano também é importante para fazer descobertas que são clinicamente relevantes. O foco principal deste artigo é sobre o modelo 4-AP cortical devido a sua versatilidade em gerar eventos estável em estudos tanto in vivo e in vitro , bem como em rato e tecido humano. Os métodos neste artigo também irão descrever um método alternativo de indução de convulsões, usando o modelo^{2 +} Zero-Mg e fornecer uma visão geral detalhada das vantagens e limitações da atividade epileptiforme semelhantes gerados em diferentes aguda modelos de apreensão. Além disso, aproveitando comercialmente disponível optogenetic cepas de rato, um pulso de luz breve (30 ms) pode ser usado para acionar um evento estável idêntico àqueles que ocorrem espontaneamente. Da mesma forma, 30-100 ms sopros de neurotransmissores (ácido gama-Amino butírico ou glutamato) podem ser aplicados para o tecido humano para acionar eventos estável que são idênticos aos que ocorrem espontaneamente. A capacidade de desencadear eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda oferece a recém-descoberta capacidade de observar a sequência exata dos eventos que dão suporte à dinâmica de iniciação de apreensão e com eficiência, avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

Introdução

Modelos de convulsão aguda com êxito podem reproduzir electrographic assinaturas reminiscentes de eventos estável observados no eletroencefalograma (EEG) de indivíduos tendo uma convulsão. Os pesquisadores utilizam esses eventos como estável (aqui referidos como 'eventos estável') como substitutos para a apreensão de evento¹. Clinicamente, estável eventos servem como um proxy confiável para eventos de apreensão desde convulsões são um transtorno neurológico que se origina no cérebro. Na unidade de monitorização de epilepsia, neurologistas dependem a detecção de eventos estável para confirmar eletrofisiolà região do cérebro e isolá-lo para ressecção². Em unidade de terapia intensiva, os médicos monitoram atividade estável para avaliar se alguma atividade de apreensão persiste em pacientes sedado³. Controlar convulsões continua a ser uma questão desafiadora para a comunidade médica, como 30% dos pacientes de epilepsia são resistentes aos medicamentos, a medicação disponível^4,5, e 10% dos casos médicos envolvendo convulsões induzidas por drogas são Não responde ao tratamento padrão³. Isto apresenta uma preocupação séria para a sociedade, como 10% da população americana é prospectado para experimentar um evento de apreensão em sua vida e 3% são esperados para desenvolver epilepsia⁶.

Estudando as apreensões em modelos de epilepsia crônica é caro, trabalhoso e muitas vezes levar meses para preparar a⁷. É também difícil de executar gravações eletrofisiológicas em animais movimentando-se livremente. Ensaios clínicos humanos enfrentam problemas semelhantes, bem como as complexidades adicionais relacionadas com o consentimento do paciente, variabilidade nas origens dos participantes e as considerações morais e éticas envolvidas⁸. Modelos de convulsão aguda, por outro lado, são favoráveis, porque eles são relativamente conveniente para preparar, custo-eficiente e capaz de gerar grandes volumes de eventos estável para estudo⁹. Além disso, o tecido é fixo em uma posição estável, assim que as condições são ideais para a realização das gravações eletrofisiológicas necessárias para estudar a dinâmica de apreensão e a fisiopatologia subjacente relacionada. Modelos de convulsão aguda permanecem favoráveis sobre modelos em silico (computador), porque eles são baseados no material biológico composto de rede neuronal constituintes do cérebro com todos os seus factores inerentes e conectividade sináptica, que não pode ser capturada por computador até os mais detalhado modelos¹⁰. Estas características fazem modelos de convulsão aguda preparados para ser eficiente na triagem para potenciais anti-apreensão terapias e fazer conclusões preliminares antes de avançá-los para maiores investigações em modelos de epilepsia crônica e ensaios clínicos.

Normalmente, modelos de convulsão aguda são derivados do tecido cerebral normal que tenha sido submetido a condições hiperexcitável. Para induzir eventos estável clinicamente relevantes no tecido cerebral saudável, é importante compreender que o cérebro funciona otimamente em um estado crítico¹¹ onde (E) de excitação e inibição (I) são equilibradas¹². Uma interrupção do E-eu balanço pode levar ao estado de hiperexcitável apreensão em que precipitam eventos estável. Da mesma forma, dentro deste quadro conceptual, há duas estratégias principais para gerar eventos estável em fatias de cérebro (em vitro) ou em preparações todo-cérebro (na vivo): diminuição da inibição ("desinibição") ou aumentada excitação ("não-desinibição"). No entanto, eventos estável são altamente ordenados e sincronizado eventos que exigem a influência dos interneurônios gabaérgica para orquestrar a rede neural atividade^13,14. Por esta razão, não-desinibição modelos são os mais eficazes para gerar eventos estável em redes neurais isolados, como em um em vitro cérebro fatia¹⁵, Considerando que em vitro modelos desinibição comumente levam a picos de atividade reminiscência de interictais como cravação. Além disso, dentro deste quadro conceptual, um evento de sincronização momentâneo confiável também pode desencadear um evento estável¹⁶. Na verdade, um evento estável pode ser desencadeado por qualquer pequena perturbação aplicada ao sistema neural¹⁷ quando está em um estado crítico de transição ("bifurcação") ponto¹⁸. Tradicionalmente, estas perturbações foram induzidas por estimulação elétrica. No entanto, o recente desenvolvimento de optogenetics em neurociência, oferece agora uma estratégia mais elegante para induzir transições de estado crítico¹⁶.

Os métodos descritos neste artigo demonstram como gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda para tanto in vitro (etapa 1 do protocolo) e na vivo estudos (etapa 2 do protocolo). Eles envolvem a escolha da região do cérebro, método de indução de convulsões, tipo de estudo e espécie; no entanto, o foco será sobre a escolha recomendada de um modelo de apreensão de cortical aguda 4-AP devido à sua versatilidade em uma grande variedade de tipos de estudo. O modelo 4-AP convulsão aguda em vitro é baseado no protocolo padrão para preparar fatias de cérebro de alta qualidade para gravações eletrofisiológicas e¹⁹estudos de imagiologia. Esses protocolos já tem sido usados para fazer em vitro coronal do cérebro fatias de córtex somatossensorial-motor de ratos^16,20 e humanos²¹. Modificações para gerar eventos estável nestes tipos de fatias do cérebro tenham sido demonstradas anteriormente¹⁶ e os detalhes são descritos no protocolo abaixo. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo é baseado no protocolo padrão para preparar uma craniotomia para estudos²²de imagem. A modificação é que nenhuma janela (lâmina de vidro) é instalada após a craniotomia. Em vez disso, agentes proconvulsant (4-AP) são topicamente aplicados ao córtex exposto para induzir eventos estável, enquanto o animal está sob anestesia geral. A nosso conhecimento, nosso grupo foi o primeiro a desenvolver este modelo de apreensão cortical aguda na vivo em camundongos^16,23. O modelo 4-AP cortical convulsão aguda na vivo preparado a partir de ratos adultos foi desenvolvido para complementar o modelo in vitro fatia do tecido juvenil. A replicação das conclusões no modelo de apreensão adulto na vivo contribui para generalizar os resultados de modelos de fatia, abordando as preocupações inerentes sobre as condições de não-fisiológica de uma fatia do cérebro 2D (contra um 3D todo-cérebro estrutura) e as diferenças fisiológicas entre jovens e adulto de tecido.

O método de início de evento estável sob demanda é demonstrado usando ou sopros de neurotransmissores com uma estratégias de picospritzer ou optogenetic. O melhor de nosso conhecimento, nosso grupo é a primeira a iniciar eventos estável em tecido humano usando neurotransmissores através de um picospritzer¹⁶. Estratégias de optogenetic, a cepa de camundongos C57BL/6 é a tensão convencional usada para expressar transgenes. A expressão de channelrhodopsin-2 (ChR2) em interneurônios gabaérgica ou células piramidais glutamatérgico irá fornecer a capacidade opcional para gerar eventos estável on-demand com breves pulsos de luz. Cepas de ratos optogenetic adequado incluem a variante C57BL/6 comercialmente disponível que expressa ChR2 em qualquer interneurônios, usando o rato vesicular GABA transportador promotor (VGAT)²⁴, ou células piramidais, usando o antígeno da pilha do mouse Timo 1 promotor (Thy1)²⁵. Estes ratos VGAT-ChR2 e Thy1-ChR2 comercialmente disponíveis oferecem a oportunidade de ativar os neurônios gabaérgica ou neurônios glutamatérgico, respectivamente, no neocórtex com azul (470 nm) luz. A capacidade de gerar eventos estável sob demanda em modelos de convulsão aguda pode oferecer novas oportunidades para estudar a dinâmica de iniciação de apreensão e eficientemente avaliar potenciais terapias anti-apreensão.

Protocolo

Toda pesquisa envolvendo pacientes foi realizada sob um protocolo aprovado pelo Conselho de ética da Universidade saúde rede pesquisa em conformidade com a declaração de Helsinque. Procedimentos que envolvam animais estavam em conformidade com as diretrizes do Conselho canadense no cuidado Animal e aprovaram pelo Krembil Research Institute Animal conta Comité.

1. protocolo i: aguda com base no modelo In vitro apreensão

1. Preparação de soluções de dissecação e artificial líquido cefalorraquidiano
   1. Carbogenate água ultrapura (que é água filtrada com uma resistividade de 18,2 MΩ·cm) com carbogênio (95% O₂5% CO₂) por 5 min usando ar difusores de bolha pedra (aeradores para aquários).
      Nota: As pedras de ar podem ser conectadas para o tanque carbogênio regulador através do silicone padrão tubulação. Se pedras de ar não estão disponíveis, selo feche a extremidade do tubo do silicone e picar furos pequenos no selo para permitir que o gás carbogen a bolha para fora e carbogenate a solução.
   2. Prepare uma solução de dissecação, dissolvendo os solutos da tabela 1 em água ultrapura. Adicione o CaCl₂ para uma solução que tem sido carbogenated pelo menos 5 min ajudar a dissolver.
      Nota: Como alternativa, adicione o CaCl₂ primeiro, assim que pode dissolver facilmente em uma solução insaturada. A solução, na forma líquida, deve ser de 300-320 mOsm/L e tem um pH de 7.4 após ser saturado com carbogênio.
      1. Esfriar a solução de dissecação para 0 - 4 ° C. Deixe a solução na geladeira durante a noite ou coloque a solução no congelador por 1h e monitorar continuamente a temperatura.
         Nota: A solução de dissecação pode ser armazenada por até 3 noites; Descarte depois.
      2. Carbogenate a solução de dissecação por 5-10 min antes de usar.
         Nota: Idealmente, a solução também deve aparecer como lama ou estar em transição para lama antes da utilização.
   3. Prepare-se roedores artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF), dissolvendo os solutos da tabela 2 (ou 3 tabela para humano ACSF) em água ultrapura. Carbogenate a solução ACSF enquanto ele está em um banho de água aquecido a 35 ° C até o uso. Adicione o CaCl₂ para uma solução que tem sido carbogenated pelo menos 5 min ajudar a dissolver.
      Nota: Como alternativa, adicione CaCl₂ primeiro, assim que pode dissolver mais fácil em uma solução insaturada. A solução, na forma líquida, deve ser 290-320 mOsm/L e tem um pH de 7.4 após ser saturado com carbogênio. Soluções devem ser feitas em volumes 1, 2 ou 4 L, dependendo da duração dos experimentos. Fazer 4 L por um dia completo (8 h) de experimentos. A ACSF deve ser feito fresco cada dia; não armazená-lo por mais de 1 d.
2. Dissecação de mouse para coletar o tecido cerebral
   Nota: Para o tecido humano, prossiga para a próxima etapa (etapa 1.3) em fazer fatias do cérebro com o vibratome. Os blocos em forma de cubo (³de 1 cm) de tecido cerebral devem ser obtidos com o neurocirurgião usando os procedimentos descritos anteriormente^26,27.
   1. Recolha todas as ferramentas e materiais necessários para as dissecções de animais. Configure o espaço de trabalho para se preparar para as dissecções de animais.
      1. Verifique se o tanque de carbogênio (95 %O₂/5%CO₂) para garantir que não está vazio. Substitua o cilindro de gás antes de experiências se houver menos de 500 psi de pressão restante.
      2. Calibre o vibratome (cortador de lâmina tecido de vibração) de acordo com o manual de instruções do fabricante. Ajuste o vibratome de configuração para uma amplitude de corte de 1 mm e uma velocidade de corte de 0.12 mm/s.
         Nota: As configurações ideais podem ser diferentes para cada cortador de lâmina de tecido vibração individual; no entanto, em geral, a amplitude deve ser alta e a velocidade de corte deve ser baixa.
      3. Encha a câmara de incubação de fatia de cérebro (ou seja, o guardião de fatia do cérebro) com ACSF e bolha-lo com carbogênio. Em seguida, coloque a câmara de incubação num banho de água a 35 ° C.
         Nota: Utilize o roedor ACSF para fatias de cérebro de roedor e ACSF humano para fatias do cérebro humano.
   2. Obter um rato juvenil de ambos os sexos, entre a idade de 13 d (p13) para 21 d (p21, onde p0 é a data de nascimento).
   3. Anestesia o rato com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (55 mg/kg de peso corporal). Uma vez que o mouse é profundamente anestesiado, conforme indicado pela ausência de reflexo de pitada do dedo do pé, prontamente, use um instrumento de guilhotina veterinário aprovado para decapitar o mouse em um movimento rápido.
      Nota: Prepare a injeção de pentobarbital de sódio de acordo com os procedimentos recomendados pelas diretrizes institucionais.
   4. Segura o nariz do rato para estabilizar a cabeça decapitada e suavemente faça uma incisão começando entre os olhos do rato e ao longo do comprimento inteiro do couro cabeludo para expor o crânio. Garantir que o crânio não é comprimido pela pressão aplicada pela navalha. Use o canto da navalha para aumentar a precisão do corte.
   5. Afastados os retalhos de couro cabeludo do mouse usando os dedos para expor o crânio. Em seguida, use o canto fresco de uma navalha para fazer uma incisão ao longo da linha média do crânio; Preste muita atenção para evitar qualquer contato com o córtex cerebral.
   6. Fórceps de lasca de inserção em soquetes do olho do rato para estabilizar a cabeça decapitada e colocá-lo em uma placa de Petri cheia de frio (0 - 4 ° C) solução de dissecação. Certifique-se de que a cabeça é totalmente imersa na solução de dissecação.
   7. Use um segundo conjunto de pinças de lasca suavemente descascar o couro cabeludo do rato, remova o osso do nariz descascando-lo e remover a parte de trás (lado caudal) do crânio.
      Nota: O osso do nariz dos ratos juvenis é muito macio e facilmente quebrados.
   8. Use uma micro espátula para cortar a medula espinhal, nervos trigêmeo e nervos ópticos. Em seguida, use a micro espátula delicadamente separar o cérebro o crânio. Deixa o cérebro totalmente submergido na prato de Petri preenchida com solução de dissecação.
3. Preparação de corticais fatias de córtex somatossensorial-motor
   1. Encha a bandeja de tampão com do vibratome com ~ 150 mL de frio (0 - 4° C) solução de dissecação.
      Nota: Opcionalmente, mantenha a bandeja de tampão no congelador até que seja necessário manter a temperatura baixa durante o procedimento de corte.
   2. Cole o tecido de cérebro de rato ou humanos para o palco vibratome (espécime titular/bandeja) usando cola adesiva instantânea. Para os ratos, corte uma pequena porção caudal do cérebro (ou seja, o cerebelo) para que pode ser facilmente colada horizontalmente sobre o suporte de amostra (permitindo o lado rostral do cérebro para enfrentar o teto).
      Nota: Como alternativa, fatias de cérebro de rato horizontal podem ser preparadas pela colagem do lado dorsal do cérebro para o suporte de amostra (o lado ventral do cérebro deve enfrentar o teto)²⁸.
   3. Coloque suavemente o suporte de amostra (com tecido cerebral) no bandeja de tampão. Certifique-se de que a porção dorsal do cérebro está enfrentando a lâmina do vibratome.
      Nota: É fundamental para minimizar a quantidade de tempo que o cérebro é exposto ao ar.
4. Corte de tecido de cérebro e coleção
   1. Corte o cérebro em 450 μm de espessura usando o vibratome no dorsal para direção ventral. Certifique-se de que o cérebro permanece completamente ancorado na bandeja do espécime enquanto corta.
      1. Fazer o primeiro corte no cérebro do rato para remover o bulbo olfativo. Em seguida, fazer cortes subsequentes até a área somatossensorial-motor é observada (localizado aproximadamente no meio do caminho entre o bulbo olfativo e bregma).
         Nota: Opcionalmente, fatia do cérebro mais finas fatias (200 μm) até o corpo caloso aparece na exibição coronal do cérebro, que indica que a área somatossensorial-motor está perto.
   2. Usar uma pipeta de transferência largo-furo para coletar fatias coronais (450 μm) que contêm a área somatossensorial-motor e mergulhe-os em um prato de Petri contendo frio (0 - 4 ° C) solução de dissecação.
   3. Usar uma nova lâmina e corte qualquer excesso de tecido do rodelas. Para fatias coronais de ratos, execute um corte logo abaixo da comissura neocortical (ou seja, corpo caloso) transverso. Não corte num movimento de serrar; simplesmente aplicar pressão sobre a lâmina no tecido e um pincel de detalhamento para separar suavemente o tecido. Certifique-se de minimizar o movimento da fatia coronal.
   4. Utilização de uma pipeta de transferência largo-furo para transferir a porção dorsal das fatias coronais que contêm o neocórtex (camada 1-6), para uma segunda placa de Petri cheia de morna (35 ° C) ACSF por um momento (~ 1 s). Então, prontamente transfira as fatias para uma câmara de incubação contendo morna (35 ° C) carbogenated ACSF.
      Nota: A finalidade da transferência para o prato de Petri com ACSF é minimizar a transferência de solução de dissecação para a câmara de incubação enquanto transfere fatias do cérebro com a pipeta de largo diâmetro. Utilize a câmara úmida organizaram vários poços para manter fatias diferentes do cérebro.
   5. Descarte o resto do cérebro e carcaça de animais de acordo com as orientações institucionais.
5. Incubação e manutenção
   1. Deixe as fatias de cérebro ligeiramente submergidas na câmara de incubação a 35 ° C por 30 min. Em seguida, remova a câmara de incubação do banho de água e deixe-o voltar à temperatura ambiente (20-25 ° C). Espere 1h para as fatias de cérebro para se recuperar antes de realizar gravações eletrofisiológicas.
      Nota: Certifique-se há nenhuma bolha de ar que recolhem por baixo as fatias de cérebro em câmara úmida. Bolhas de ar são interfaces de ar que causam danos aos tecidos. As fatias de cérebro de rato podem ser mantidas por 6-8 h, enquanto o tecido do cérebro humano pode ser armazenado por até 24 h em uma câmara de incubação bem-carbogenated com a ACSF apropriado.
6. Eletrofisiológicas gravações da camada cortical superficial
   Nota: Eventos estável são observados nas gravações (LFP) potenciais extracelular campo local de fatias de cérebro. A LFP da fatia cerebral pode ser observada e gravada com uma interface tipo câmara²⁹ ou um sistema de matriz de multi eletrodo submerso (MEA)¹⁶. O procedimento tem sido descrito anteriormente¹⁶ e detalhes adicionais são descritos abaixo.
   1. Use uma pipeta de transferência de calibre largo ou uma escova de detalhamento para mover uma fatia do cérebro para o papel de lente pré-cortada ligeiramente maior que é realizada utilizando uma pinça odontológica. Transferir o papel de lente (que a fatia do cérebro está descansando em cima) para a câmara de gravação e fixá-lo em posição com uma tela de harpa.
   2. Executar quente (35 ° C), carbogenated ACSF perfusato através da câmara de gravação sobre a fatia do cérebro a uma taxa de 3 mL/min (~ 1 gotejamento/s). Use um termômetro digital para garantir que a câmara de gravação é 33-36° C.
   3. Puxe os eletrodos de vidro com uma impedância de 1-3 MΩ de tubos de vidro de borosilicato (com um diâmetro exterior de 1,5 mm) usando um extrator. Aterre os eletrodos de vidro com ACSF (~ 10 µ l) utilizando uma seringa de Hamilton. Descarte imediatamente o eletrodo se a ponta estiver danificada.
      Nota: Bleach o fio de prata (5 min) e permitir apenas uma parcela mínima (ou seja, a ponta) do fio de prata para ser submersa os eletrodos de vidro cheio de volta ACSF para minimizar o ruído e a deriva durante as gravações. Remova qualquer excesso ACSF o eléctrodo de vidro com uma seringa de Hamilton, se necessário.
   4. Uso de microscópio estéreo X 20 com precisão guia o gravação eléctrodo de vidro para o superficial cortical da camada (2/3) usando manipuladores manuais. / Modo de registro da atividade elétrica da fatia cerebral em um computador com software padrão.
      Nota: Fatias viável (alta qualidade) cérebro irão expor um robusto potencial evocado em resposta aos estímulos elétricos aplicados (100 µs, 30-300 μA) ou pulsos de luz (30 ms, 10 mW/mm²) para o tecido optogenetic.
7. Indução de convulsão, como atividades
   1. Perfundir ACSF contendo 100 µM 4-aminopyrimidine (4-AP) sobre a fatia de cérebro. Dissolva a 80 mg de 4-AP em 8,5 mL de água para fazer uma solução stock de 100 mM 4-AP. Adicionar 100 µ l de solução-mãe de 100 mM 4-AP para 100 mL de ACSF para alcançar um perfusato ACSF com 100 µM 4-AP.
      Observação: Como alternativa, use Zero-Mg^{2 +} ACSF (tabela 4), uma solução ACSF modificada contendo nenhum adicionado Mg^{2 +}, para perfundir a fatia do cérebro. Para o tecido humano, use uma combinação de 100 µM 4-AP em Zero-Mg^{2 +} ACSF humano (tabela 5) para alcançar melhores resultados. O tempo médio para eventos estável aparecer é de 15 min; no entanto, pode demorar até 40 min para algumas fatias de cérebro.
8. Geração de demanda apreensão: uma estratégia de optogenetic para optogenetic de ratos
   1. Aplicar um pulso de breves (30 ms) de azul (470 nm) luz (com uma intensidade de saída mínimo 1 mW/mm² ) para iniciar um evento estável. Use um manipulação manual para posicionar um núcleo de fibra 1.000 µm de diâmetro ótica (0,39 NA) diretamente acima da região de gravação.
      Nota: Definir a taxa da foto-estimulação para coincidir com a taxa desejada da ocorrência do evento estável (ou seja, 1 pulso a cada 50 s). No entanto, a taxa não pode ser excessivamente exagerada da taxa intrínseca em que ocorrem eventos estável.
9. Geração de demanda apreensão: uma estratégia de não-optogenetic de tecido humano
   1. Posicione a fatia do cérebro para que as camadas superficiais são rio acima, e nas camadas profundas são a jusante para o fluxo do perfusato através da câmara de gravação.
   2. Puxe um eléctrodo de vidro (mesmo tipo usado para as gravações de LFP) e toque levemente sua ponta com um limpador de delicada tarefa de criar uma pequena abertura. Aterramento do eletrodo com ~ 25 µ l de 100mm GABA (dissolvido em água) e anexá-lo para o picospritzer. Alternativamente, o aterramento do eletrodo com 200 µM glutamato (dissolvido em água).
      Nota: Para estimar o volume sendo inchado da picospritzer (~ 50 µ l), aplique uma baforada de teste em uma placa de plástico (de preferência quadriculada). Em seguida, aplica uma gota de volumes conhecidos (ou seja, 10 µ l, 20 µ l, 50 µ l ou 100 µ l), com uma pipeta para uma comparação com o sopro de teste.
   3. Aplica os sopros do neurotransmissor (GABA ou glutamato) para o tecido humano com um picospritzer (10-20 psi para 30-100 ms) para iniciar um evento estável. Aplicar um único sopro de 100mm GABA na camada profunda (5) do tecido cerebral para gerar eventos estável na camada superficial (2/3). Como alternativa, aplica um único sopro de 200 µM glutamato diretamente sobre a camada superficial para gerar eventos estável na camada superficial.
      Nota: Definir a taxa de picospritzer o sopro para coincidir com a taxa desejada da ocorrência do evento estável (ou seja, 1 pulso a cada 50 s). No entanto, a taxa não pode ser excessivamente exagerada da taxa intrínseca em que ocorrem eventos estável.

2. Protocolo II: Aguda In vivo modelo de apreensão

1. Cirurgia e preparação cirúrgica
   1. Obter um rato adulto (p35 - p60) de ambos os sexos.
   2. Anestesia profundamente mouse com cetamina (95 mg/kg) e xilazina (5 mg/kg). Realize o teste de reflexo de dedo-pinch para garantir que o rato está sedado. Como alternativa, use o isoflurano (4% para indução, 1.5-2% para a cirurgia) para anestesiar o mouse.
      Nota: A escolha dos anestésicos pode afetar a atividade de apreensão^30,31.
   3. Monte o mouse em uma armação estereotáxica fixando sua cabeça com barras de orelha. Coloque uma almofada aquecida sob o mouse para a duração da cirurgia.
   4. Raspe a parte superior da cabeça do rato usando um trimmer de roedor para expor o couro cabeludo. Injete 0,3 mL de lidocaína com um 25 5/8 na agulha o periósteo para evitar sangramento excessivo ou dor. Aplica a pomada para os olhos do rato para evitar que sequem durante o experimento.
   5. Beliscar e levantar o centro do couro cabeludo do rato para avaliar se seus reflexos desapareceram. Posteriormente, realize uma horizontal de corte para expor o bregma a região de lambda do crânio. Delicadamente, raspe toda a área exposta do crânio com um cotonete de algodão para criar uma superfície seca.
   6. Execute uma craniotomia de 4 mm de diâmetro na coordenadas 2,0 mm rostrocaudal lateromedial e-2,00 mm para expor o córtex somatossensorial. Marca o local com um círculo (4 milímetros no diâmetro) usando um marcador permanente. Broca ao redor do círculo com uma broca pneumática dental até a camada restante do osso craniotomia facilmente cede quando empurrado para baixo. Aplica solução salina sobre a camada de osso antes de remover a craniotomia com fórceps de lasca. Posteriormente, aplica a solução salina tépida à região exposta.
2. Métodos de gravação e química indução de convulsões
   1. Puxe os eletrodos de vidro com uma impedância de 1-3 MΩ de tubos de vidro de borosilicato (com um diâmetro exterior de 1,5 mm) usando um extrator. Aterre os eletrodos de vidro com ~ 10 µ l de ACSF ou soro fisiológico usando um Hamilton de seringa. Descarte imediatamente o eletrodo se a ponta estiver danificada.
      Nota: Bleach o fio de prata (5 min) e permitir apenas uma parcela mínima (ou seja, a ponta) do fio de prata para ser submersa os eletrodos de vidro cheio de volta ACSF para minimizar o ruído e a deriva durante as gravações. Remova qualquer excesso ACSF o eléctrodo de vidro com uma seringa de Hamilton, se necessário.
   2. Usar um manipulador manual para guiar o eletrodo de vidro para o superficial cortical (2/3) da camada na área somatossensorial-motor. / Modo de registro da atividade elétrica da fatia cerebral em um computador com software padrão.
      Nota: Camada 2/3 é aproximadamente de 0,3 mm de profundidade da superfície³².
   3. Topicamente, aplica ~0.5 mL 1,5 mM 4-AP soro fisiológico para o córtex exposto do rato com uma seringa até cobrir completamente a craniotomia. Dissolva a 14 mg de 4-AP em 100 mL de solução salina isotônica, tornar-se uma solução de soro fisiológico 4-AP 1,5 mM.
      Nota: Prepare o soro fisiológico 4-AP antes de começa o experimento. Em média, estável eventos aparecem 15 a 30 min após aplicação tópica.
3. Geração de demanda de convulsões em ratos optogenetic
   1. Aplicar um pulso de breves (30 ms) de azul (470 nm) luz (com uma intensidade de saída mínimo 10 mW/mm² ) para iniciar um evento estável. Use um manipulação manual para posicionar um núcleo de fibra 1.000 µm de diâmetro ótica (0,39 NA) diretamente acima da região de gravação.
      Nota: Definir a taxa da foto-estimulação para coincidir com a taxa desejada da ocorrência do evento estável (ou seja, 1 pulso a cada 300 s). No entanto, a taxa não pode ser excessivamente exagerada da taxa intrínseca em que ocorrem eventos estável.

Resultados

A aplicação de 100 µM 4-AP para (sem danos) 450 fatias de cérebro cortical µm de tamanho boa qualidade de um juvenil VGAT-ChR2 rato induzido confiável estável eventos recorrentes (> 5 s) dentro de 15 min (Figura 1Ai). A aplicação de 100 µM 4-AP para fatias de má qualidade resultou na ruptura eventos ou spiking atividade (Figura 1Aii). Em média, 40% das fatias de cada cérebro de rato dissecado gerado com êxito evento...

Discussão

As fatias do cérebro são tratadas com uma droga proconvulsant ou um perfusato ACSF alterado para aumentar a excitabilidade da rede neural e promover uma precipitação de estável eventos (electrographic apreensão-como). Para os ratos, as fatias coronais preferenciais da área somatossensorial-motor devem conter o córtex cingulado, área 2 (CG), mas não a área de retrosplenial (RS); estes marcadores anatômicos ajudam a identificar a gama de fatias coronais que são melhores para induzir eventos estável. Uma modif...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium pentobarbital	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringe	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needle	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Instant adhesive glue	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Lens paper	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
PVC handle micro spatula	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Micro spoon with flat end	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0	N/A	N/A	Purcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipette	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dental Tweezer	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Thermometer (digital)	N/A	N/A	Purchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2)	N/A	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
Vibratome	Leica	N/A	Purchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper)	Scientific Systems Design Inc	N/A
Sodium Chloride (NaCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium Bicarbonate	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Dextrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store
Sucrose	N/A	N/A	Purchased through UT Med Store