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要約

急性発作モデル、てんかんイベントの基になるメカニズムを研究するために重要です。さらに、てんかんイベント オンデマンドを生成する能力は彼らの開始の基になるイベントの正確なシーケンスを調査する非常に効率的な手法を提供します。ここでは、マウスやヒトの組織に設立された急性 4-アミノピリジン皮質発作モデルについて述べる。

要約

医療界の挑戦的な問題のまま発作を制御します。進歩をするためには、研究者は広く研究して発作とその基になるメカニズムを調査する方法必要があります。急性発作モデル便利、電気生理学的記録を実行する能力を提供して、アノキシア発作様 (発作時) イベントの大規模な量を生成することができます。急性発作モデルの有望な結果は慢性てんかんモデルや臨床試験にして高度なことができます。したがって、臨床発作のエレクトロ グラフと動的署名を忠実に再現するモデルが急性の発作を勉強して、ある臨床的に関連性の高い結果を作るために不可欠。急性発作モデル人間のティッシュから準備で発作時のイベントを勉強しても、臨床的に関連する所見を作るため重要です。本稿の重要な焦点は、体内と体外の研究だけでなく、マウスやヒトの組織で発作時のイベントの生成の多様性のための皮質 4 AP モデルです。本稿のメソッドも 0 Mg2 +モデルを用いた発作誘導の代替方法について説明し、利点の詳細な概要と別の生成されたてんかんのような活動の制限を提供する急性発作モデル。また、マウス系統に市販の光を利用して短い (30 ms) の光パルスが自発的に発生しているものと同じ発作時イベントをトリガーする使用できます。同様に、神経伝達物質 (γ-アミノ酪酸、グルタミン酸) の 30-100 ms パフは、自発的に発生しているものと同じです発作時のイベントをトリガーする人体の組織に適用できます。急性発作モデルでオンデマンドに発作時のイベントをトリガーする機能は、発作開始ダイナミクスの根底にある、潜在的な抗けいれん療法を効率的に評価するイベントの正確なシーケンスを観察する新たな能力を提供しています。

概要

急性発作モデルは正常に発作を経験する人の脳波 (EEG) にみられる発作時のイベントを連想させるエレクトロ グラフ署名を再現できます。研究者は、代理として奪取イベント1(ここの発作時のイベント' と呼ばれる) これらの発作のようなイベントを使用します。臨床的に発作時のイベントは、以来、発作が脳から発する神経疾患発作イベントの信頼性の高いプロキシとして機能します。てんかんモニタリング ユニット、神経科医はてんかんの脳の領域を確認し、切除2に分離する発作時イベントの検出に依存します。集中治療室では、医師はどんな発作活動が鎮静患者3に固執する場合を評価する発作時のアクティビティを監視します。てんかん患者の 30% は使用可能な薬4、5、薬剤耐性と薬剤誘発性発作を含む医学の場合の 10% が医療界の挑戦的な問題であることのまま発作を制御します。3標準治療に応答しません。これはアメリカの人口の 10% は彼らの一生の間に 1 つの発作イベントを体験する見込し、3% のてんかん6の発展が予想される社会にとって深刻な懸念を提示します。

発作慢性てんかんモデルでの勉強は、高価な骨の折れるとしばしば7の準備に数ヶ月をかかります。また、動物を自由に移動で電気生理学的記録を行うことは困難です。ひと臨床試験患者の同意、参加者の背景や道徳的、倫理的な考慮事項関連する8の変動に関連する追加の複雑さと同様、同様の問題に直面します。その一方で、急性発作モデル比較的準備に便利、低コスト、大量の研究9発作時のイベントを生成できる、有利です。さらに、条件が電気生理学的記録発作ダイナミクスと関連の基本的な病態を検討する必要を実行するために理想的なので、組織は安定した位置に固定されます。彼らは、脳のすべての固有の要因と取り込めないことがあるシナプスの接続構成ニューロン ネットワークの構成生物学的材料に基づいているため急性発作モデルはインシリコ(コンピューター) モデル上良好のまま最も詳細なコンピューターによって10をモデル化します。これらの機能は、急性発作モデルの潜在的な抗けいれん治療スクリーニングと慢性てんかんモデルと臨床試験のさらなる調査のためにそれらを進める前に予備調査結果を作るで効率的に構えを作る。

通常、急性発作モデルはハイパー興奮性の条件にさらされている正常な脳組織から派生しました。健康的な脳組織の臨床的に関連する発作時イベントを誘発するには、それは、励起 (E) と (I) 抑制がバランスの取れた12脳が重大な状態11で最適に機能するかを理解することが重要。E の混乱-私のバランスは発作時イベントが沈殿させるハイパー興奮性発作状態につながることができます。したがって、この概念の枠組みの中で、脳のスライス (生体外で) または全体の脳 (体内) 準備発作時のイベントを生成する 2 つの主要な方法があります: 抑制 ("disinhibition") を減少または増加励起 ("非-disinhibition")。しかし、発作時のイベントは高い並べられニューラル ネットワーク活動13,14を統制する gaba 作動性介在ニューロンの影響を必要とするイベントを同期します。このため、非脱モデルは、分離のニューラル ネットワークにおける発作時イベントの生成の最も効果的な培養脳スライス15、脱モデル体外一般的に活動をスパイクにつながるに対し、します。発作間欠期のようなスパイクを連想させる。さらに、この概念の枠組みの中で、瞬間的な同期イベントは、確実に発作イベント16をトリガーできます。実際には、発作時のイベントは、重大な状態遷移 (「分岐」) ポイント18時に神経系の17に適用される任意のマイナーな摂動によって引き起こされることができます。伝統的に、これらの摂動は、電気刺激により誘導された.神経科学における光遺伝学の最近の発展しかし、今重大な状態遷移16を誘導するためにより洗練された戦略を提供しています。

このペーパーで説明する方法体外(プロトコルの手順 1) と生体内での研究 (プロトコルの手順 2) の両方のための急性発作モデルでオンデマンドで発作時のイベントを生成する方法を示します。彼らは脳の領域、発作誘導法、研究の種類、および種の選択を含むただし、フォーカスは、さまざまな種類の研究の多様性のため急性 4 AP 皮質発作モデルの推奨される選択になります。4 AP 発作モデル急性体外は電気生理学的記録の質の高い脳スライスを準備する標準プロトコルに基づいており、イメージング研究19。これらのプロトコルは、マウス16,20と人間21の体性感覚運動皮質からコロナ脳スライスを体外に既に使用されています。脳スライスのこれらのタイプの発作時のイベントを生成する変更は以前16と完全な詳細についてはプロトコルの下、実証されています。4 AP 皮質発作モデル急性生体内では、イメージング研究22のために開頭術を準備する標準のプロトコルに基づいています。変更は、(スライド ガラス) ウィンドウがインストールされていないこと、開頭手術の後です。代わりに、proconvulsant エージェント (4 AP) は、動物は、全身麻酔下では発作時のイベントを誘発する露出の皮質に局所的に適用されます。私たちの知る限り、私たちのグループは最初のモデルを開発するこの急性体内皮質発作マウス16,23だった大人のマウスから作製した急性体内4 AP 皮質発作のモデルは、少年組織から培養スライス モデルを補完するために開発されました。2 D 脳スライス (対3-D 全体の脳の非生理的条件に関する固有の懸念に取り組むことによってスライス モデルからの調査結果を一般化するのに役立ちます発作モデル アダルト生体内における所見のレプリケーション構造) および年少および大人のティッシュの生理の違い。

Picospritzer または光遺伝学的戦略と神経伝達物質のいずれかのパフを使用してオンデマンドで発作時イベント開始の方法を示します。我々 の知る限り、私たちのグループは神経伝達物質を介してpicospritzer16を使用して人間の組織で発作時のイベントを開始する最初の。C57BL/6 マウス株は、光遺伝学的戦略、遺伝子を表現するために使用される従来のひずみです。チャネルロドプシン 2 (ChR2) を gaba 作動性介在ニューロンのグルタミン酸作動性の錐体細胞の発現は、短い光パルスを用いたオンデマンドに発作時のイベントを生成するオプションの機能を提供します。適切な光マウス系統にはマウス水疱性 GABA トランスポーター プロモーター (vgat ノックアウト)24、またはマウス胸腺細胞抗原 1 を使用して、ピラミッド型のセルを使用して、いずれかの介在ニューロンに ChR2 を表現する市販の C57BL/6 バリアントが含まれますプロモーター (Thy1)25。これらの市販 vgat ノックアウト ChR2 Thy1 ChR2 マウスは、それぞれ、青と大脳新皮質のグルタミン酸作動性ニューロン、gaba 作動性ニューロンまたはアクティブにする機会を提供 (470 nm) の光。急性発作モデルのオンデマンド発作時のイベントを生成する能力は発作開始ダイナミクスし、潜在的な抗けいれん療法を効率的に評価する新しい機会を提供できます。

プロトコル

患者を含むすべての研究は、ヘルシンキ宣言に基づき大学健康ネットワーク研究倫理審査会によって承認されたプロトコルの下で行った。プロシージャの動物を含む動物のケアに関するカナダの理事会によるガイドラインに従って、Krembil 研究所動物ケア委員会によって承認されました。

1. プロトコル i: 急性発作の in vitroモデル

  1. 郭清のソリューションおよび人工髄液の準備
    1. Carbogenate 超純水 (ある 18.2 MΩ·cm の抵抗とフィルター処理水) 5 分 (95% O25% CO2) カーボゲン ・石バブル ディフューザー (水族館の気泡器) を使用して空気します。
      注: エアース トーンは、標準的なシリコン チューブを介してカーボゲン ・ タンクのレギュレータに接続できます。エアース トーンを使用できない場合、シールはシリコン チューブの端をシャット ダウンし、うちバブル カーボゲン ・ ガスと carbogenate ソリューションを許可するシールに小さな穴を突きます。
    2. 表 1純水から溶質を溶解することにより解離ソリューションを準備します。CaCl2を溶かすため、少なくとも 5 分の carbogenated をされているソリューションに追加します。
      注: また、追加 CaCl2最初に、それは不飽和ソリューションで容易に溶解することができます。液体の形でのソリューション必要があります 300 320 mOsm/L、pH 7.4 カーボゲン ・で飽和されて後。
      1. 0 - 4 ° C に郭清ソリューションを冷やす一晩冷蔵庫の中に解決策を残して 1 時間冷凍庫にソリューションを配置や温度を継続的に監視します。
        注: 郭清ソリューションは最大 3 泊までの格納できます。その後破棄します。
      2. Carbogenate 使用する前に 5-10 分のための解離ソリューション。
        注: 理想的には、ソリューションにスラッシュとして表示する必要がありますかまたは使用する前に秘密に移行します。
    3. 表 2 (または人間のアプライドの表 3 ) から溶質を溶解することにより純水齧歯動物人工髄液 (アプライド) を準備します。Carbogenate 中にアプライド ソリューションは、使用するまで 35 ° C に加熱水浴中です。CaCl2を溶かすため、少なくとも 5 分の carbogenated をされているソリューションに追加します。
      注: また、追加 CaCl2まず不飽和溶液に容易に溶解できます。解決策は、液体の形で 290 320 mOsm/L と pH 7.4 カーボゲン ・で飽和されて後。ソリューションは、実験の期間に応じて 1、2、または 4 つの L のボリュームにすべきであります。実験の 1 日 (8 h) のため 4 つの L を作る。アプライドす新鮮な各日;1 d よりも長くそれを置かないでください。
  2. 脳組織を収集するマウスの解剖
    注: 人間の組織、vibratome と脳スライスを作ることに次の手順 (手順 1.3) に進みます。脳のキューブ型ブロック (1 cm3) 脳神経外科プロシージャ前述26,27を使用してから入手してください。
    1. すべてのツールと動物解剖に必要な資料を収集します。動物解剖に備えてワークスペースを設定します。
      1. カーボゲン ・ タンク (95% O2/5%CO2) が空でないことを確認するを確認します。500 psi 未満の残り圧力がある場合は、実験前にボンベを交換します。
      2. 製造元の取扱説明書によると vibratome (振動ブレード組織スライサー) を調整します。Vibratome 0.12 mm/s の切削速度と切削振幅 1 mm を持っているの設定を調整します。
        注: 最適な設定は、各個別振動組織刃カッターの異なる場合があります。ただし、一般的には、振幅が高くなければならないし、切削速度は低いべきであります。
      3. アプライドと脳スライス培養チャンバー (すなわち、脳スライス キーパー) を記入し、カーボゲン ・付きバブルします。35 ° C で設定水浴の孵化室を配置します。
        注: は、齧歯動物の脳のスライスと人間の脳のスライスの人間アプライドのアプライドの齧歯動物を使用します。
    2. 13 d (p13) 21 d (p21、p0 が生年月日) の年齢の間のいずれかのセックスの若年マウスを取得します。
    3. ペントバルビ タール ナトリウム 55 mg/kg 体重の腹腔内注入マウスを麻酔します。マウスは麻酔深くつま先ピンチ反射の不在によって示されるように、速やかに 1 つの迅速な動きでマウスの首をはねるにギロチンの獣医が承認した楽器を使用します。
      注: は、制度のガイドラインで推奨している手順に従ってナトリウム ペントバルビ タール注射を準備します。
    4. 首のない頭を安定させ優しく頭蓋骨を公開するために頭皮の全体の長さに沿ってマウスの目の間から正中切開マウスの鼻を保持します。頭蓋骨はかみそりによって適用される圧力によって圧縮されていませんを確認します。カットの精度を高めるためのかみそりの刃の角を使用します。
    5. 指を使って頭蓋骨を公開するマウスの頭皮のフラップを広げます。頭蓋骨; の正中線に沿って切開すること剃刀の刃の新鮮なコーナーを使用して、大脳皮質との接触を避けるために細心の注意を払います。
    6. 風邪 (0 - 4 ° C) 満ちている首のない頭を安定化し、ペトリ皿でマウスの目のソケットに挿入破片鉗子解離ソリューション。頭は郭清ソリューションで完全に水没するを確認します。
    7. 優しく、それを剥離して鼻の骨を削除マウスの頭皮をはがす、破片鉗子の 2 番目のセットを使用し、頭蓋の後部 (尾びれ側) を削除します。
      注: 若年マウスの鼻の骨が非常に柔らかく、壊れやすいです。
    8. マイクロ ヘラを使用すると、視神経、三叉神経神経や脊髄をカットします。その後、頭蓋から脳を優しくマイクロ ヘラを使用します。完全に解離液でいっぱいペトリ皿に沈んで脳を残します。
  3. 体性感覚運動野から皮質スライスの準備
    1. 風邪 (0 - 4 ° C) の ~ 150 ml vibratome のバッファー トレイを埋める解離ソリューション。
      注: 必要に応じて、スライス処理中に低温を維持するために必要になるまで冷凍庫でバッファー トレイを保持します。
    2. マウスまたは瞬間接着剤を使用して、vibratome ステージ (試験片ホルダー/トレイ) に人間から脳組織を接着します。マウス (天井に直面する脳の吻側の側面を許可) 試料ホルダーにフラットを簡単に接着できるように (すなわち小脳) 脳の小さな尾の部分をカットします。
      注: また、水平方向のマウスの脳スライス (脳の腹側天井に直面する必要があります) 試料ホルダーに脳の背側を接着により調製することができます28。
    3. ゆっくりバッファー トレイに (脳組織) と試料ホルダーを配置します。脳の背の部分で vibratome のブレードが直面していることを確認します。
      注: 脳が空気にさらされる時間を最小限に抑えることが重要です。
  4. 脳組織の区分およびコレクション
    1. 腹側方向の背側で、vibratome を使用して 450 μ m 厚いスライスに脳をスライスします。脳はそれをスライスしながら試験片トレーに完全に固定されたことを確認します。
      1. 嗅球を削除するマウスの脳の最初のカットを作る。(嗅球と前の間におよそ中途半端にある) 体性感覚-運動領域が観察されるまでは、その後のカットを行います。
        注: は必要に応じて、脳梁が体性感覚-運動領域が近いことを示す脳の冠状ビューに表示されるまで (200 μ m) の薄いスライスで脳をスライスします。
    2. ワイドボア転送ピペットを使用して感覚運動領域を含む、風邪 (0 - 4 ° C) を含むペトリ皿にそれらを沈めるコロナ スライス (450 μ m) を収集する解離ソリューション。
    3. 新しいかみそりの刃を使用し、スライスから任意の余分な組織を切断します。マウスから辺縁系、新皮質の交連 (すなわち脳梁) のすぐ下を切る横行を実行します。鋸引きの動きでカットしないでください。単にブレードに組織に圧力をかけるし、ディテールのブラシを使用して、組織を優しきます。コロナのスライスの動きを最小限に抑えることを確認してください。
    4. ちょっと暖かい (35 ° C) アプライド満ちて 2 番目シャーレに大脳新皮質 (層 1-6) を含む辺縁系の背の部分の転送にワイドボア転送ピペット使用 (~ 1 秒)。その後、暖かい (35 ° C) carbogenated アプライドを含むインキュベーション室にスライスを速やかに転送します。
      注: アプライドでシャーレに転送の目的は、ワイドボア ピペットと脳スライスの転送中インキュベーション室に解離液の転送を最小限に抑えることです。培養室の異なる脳スライスを維持する複数の井戸の組織を利用します。
    5. 脳と制度のガイドラインによると動物の死体の残りの部分を破棄します。
  5. インキュベーションとメンテナンス
    1. わずか 35 の ° c で 30 分間インキュベーション室に沈んで脳スライスを残します。風呂の水から培養室を削除し、室温 (20-25 ° C) に戻ることができます。電気生理学的記録を実行する前に回復する脳スライスの 1 h を待ちます。
      注: は、培養室で脳スライスの下に収集される気泡がないを確認します。空気の泡は、組織損傷を引き起こす空気インターフェイスです。マウスの脳スライスは、人間の脳組織は適切なアプライドでよく carbogenated 培養室で 24 時間まで保存できますが、6-8 時間維持できます。
  6. 皮質表層の電気生理学的記録
    注: 発作時のイベントは脳スライスから潜在的な (LFP) の細胞外のローカル フィールド録音で観察されます。脳スライスの LFP を観察し、インターフェイス型チャンバー29または水中の多電極アレイ (MEA) システム16のいずれかで記録できます。手順は上記16をされており、詳細は以下します。
    1. 歯科用ピンセットを使ってその場で開催される大きめのカット済みレンズから紙脳スライスを移動するのにワイドボア転送ピペットまたは詳細ブラシを使用します。記録室に (つまり脳スライス時に休んでいる) レンズ ペーパーを転送し、ハープの画面位置で固定します。
    2. 実行の暖かい (35 ° C)、脳スライス 3 mL/分 (〜 1 滴/秒) の速度で上録音室を carbogenated アプライド出納。デジタル温度計を使用して、録音室 33-36 ° C であることを確認するには
    3. ホウケイ酸ガラス管から 1-3 MΩ (外径 1.5 mm) でインピー ダンスがガラス電極をプル、引き手を使用しています。バックフィル アプライドでガラス電極 (~ 10 μ L) ハミルトンの注射器を使用しています。すぐに先端が破損している場合は、電極を破棄します。
      注: ブリーチ銀線 (5 分) と水中で録音中にノイズやドリフトを最小限に抑えるアプライド埋め戻しガラス電極銀線の最小部分 (すなわち先端) に限定。必要に応じてハミルトン スポイト付けガラス電極から任意の余分なアプライドを削除します。
    4. 正確にガイド、ガラス電極表面的に皮質に 20 X ステレオ顕微鏡の使用層 (2/3) を使用して手動式マニピュレーター。標準ソフトウェアとともにコンピューターに脳スライスの電気的活動を記録/ビュー。
      注: 実行可能な (高品質) 脳スライスは、応用電気刺激 (100 μ 秒、30-300 μ A) または光遺伝学的組織の光パルス (30 ms、10 mW/mm2) への応答で堅牢な誘発電位を展示いたします。
  7. 発作のような活動の誘導
    1. 脳スライスの上 100 μ M 4 aminopyrimidine (4 AP) を含むアプライドを灌流します。4 AP 100 μ m アプライド出納を達成するためにアプライドの 100 mL に 100 mM 4 AP 原液の 100 μ L を追加 100 mM 4 参加ストック ソリューションを作るために水の 8.5 ml 4 AP の 80 mg を溶解します。
      注: また、0 Mg2 +アプライド (表 4)、ないを含む追加 Mg2 +、変更されたアプライド ソリューション脳スライスを灌流して使用します。人間の組織に最適な結果を達成するために 0 Mg2 +人間アプライド (表 5) で 100 μ M 4 AP の組み合わせを使用します。発作時のイベントを記録の平均時間は 15 分です。ただし、いくつかの脳のスライス最大 40 分をかかることがあります。
  8. オンデマンド発作世代: 光マウスの光遺伝学的戦略
    1. 青のブリーフ (30 ms) パルスを適用 (470 nm) 発作時のイベントを開始する (最小 1 mW/mm2の出力強度) を持つ光します。手動式マニピュレーターを使用して、記録領域の真上 1,000 μ m コア径光ファイバー (0.39 NA) を配置します。
      注: 発作時のイベント発生の所望の速度に合わせて光刺激の間隔を設定する (すなわち、1 パルスごとの 50 s)。ただし、レートできない発作時のイベントが発生する本質的な率から過度に誇張されました。
  9. オンデマンド発作世代: 人体組織の非光戦略
    1. 上流、浅層、深層記録室を出納の流れを下流にあるように、脳のスライスを配置します。
    2. ガラス電極 (LFP 録音用と同じ型) を引き、小さな開口部を作成する繊細なタスク ワイパーの先端をそっと触れます。バックフィル 100 mM (水に溶ける) GABA の ~ 25 μ L で電極、picospritzer にアタッチします。また、バックフィル 200 μ M グルタミン酸 (水に溶解) を電極。
      注: picospritzer (~ 50 μ L) から増長されているボリュームを見積もるには、プラスチック板 (できればグリッド) にテスト パフを適用されます。その後、テスト パフとの比較のピペットで知られているボリューム (すなわち10 μ L、20 μ、50 μ L、100 μ L) の滴を適用します。
    3. 発作時のイベントを開始する picospritzer (30-100 ms の 10-20 の psi) による生体組織に神経伝達物質 (GABA、グルタミン酸) のパフを適用されます。浅層で発作時のイベントを生成する脳組織の深層 (5) の上に 100 ミリメートル GABA の単一化粧パフ (2/3)。また、浅層で発作時のイベントを生成する表面的な層の上に直接 200 μ M グルタミン酸の単一パフを適用します。
      注: は、発作時のイベント発生の所望の速度に合わせてパフ、picospritzer のレートを設定 (つまり、1 パルスごとの 50 s)。ただし、レートできない発作時のイベントが発生する本質的な率から過度に誇張されました。

2 急性生体プロトコル II: 発作モデル

  1. 手術の準備と手術
    1. 男女のアダルト マウス (p35 - p60) を取得します。
    2. 深くケタミン (95 mg/kg) とキシラジン (5 mg/kg) マウスを麻酔します。マウスを鎮静できるようにつま先ピンチ反射テストを実行します。また、マウスを麻酔するイソフルラン (誘導手術のための 1.5-2% 4%) を使用します。
      注: 麻酔薬の選択は差し押さえ活動30,31に影響を与えることができます。
    3. 耳の棒でその頭を確保することにより、固定フレームにマウスをマウントします。手術の間、マウスの下に加熱パッドを配置します。
    4. 齧歯動物トリマーを使用して頭皮を公開するマウスの頭の上を剃る。過度の出血や痛みを避けるために骨膜にリドカイン 0.3 mL で 25 5/8 針を挿入します。マウスの実験では乾燥を防ぐために目に眼軟膏を適用されます。
    5. ピンチ、その反射はなくなっている場合を評価するためにマウスの頭皮の中心を持ち上げます。その後、水平の頭蓋骨のラムダ領域に前を公開するカットを実行します。優しく乾燥表面を作成する綿棒と頭蓋骨の露出した領域全体を擦りなさい。
    6. 体性感覚野を公開する座標 2.0 mm lateromedial と-2.00 ミリメートル rostrocaudal で直径 4 mm の開頭術を実行します。永久的なマーカーを使用して円 (4 mm の直径) と場所をマークします。開頭の骨の残りの層まで空気圧歯科用ドリルに円の周りにドリルは簡単にプッシュ ダウンするときの方法を与えます。破片鉗子で、開頭手術を削除する前に骨の層に生理食塩水ソリューションを適用します。その後、露出した領域に食塩を適用します。
  2. 録音方法と発作の化学的誘導
    1. ホウケイ酸ガラス管から 1-3 MΩ (外径 1.5 mm) でインピー ダンスがガラス電極をプル、引き手を使用しています。バックフィル アプライドまたは生理食塩水、ハミルトンを使用しての ~ 10 μ L でガラス電極注射器します。すぐに先端が破損している場合は、電極を破棄します。
      注: ブリーチ銀線 (5 分) と水中で録音中にノイズやドリフトを最小限に抑えるアプライド埋め戻しガラス電極銀線の最小部分 (すなわち先端) に限定。必要に応じてハミルトン スポイト付けガラス電極から任意の余分なアプライドを削除します。
    2. 大脳皮質の表面にガラス電極を導くため、手動式マニピュレーターを使用して層の感覚運動地区 (2/3)。標準ソフトウェアとともにコンピューターに脳スライスの電気的活動を記録/ビュー。
      注: レイヤー 2/3 は約 0.3 mm32の表面のから深いです。
    3. それは完全に、開頭手術をカバーするまで、~0.5 mL 1.5 mM マウスの露出の皮質に 4 AP 生理食塩水注射器で局所的に適用されます。1.5 mM 4 AP 生理食塩水の原液を作るに等張生理食塩水 100 mL に 4 AP の 14 mg を溶解します。
      注: は、実験を開始する前に、4 AP 生理食塩水を準備します。平均では、発作時のイベントでは、塗布後 15-30 分が表示されます。
  3. 光マウスの発作のオンデマンド生成
    1. 青のブリーフ (30 ms) パルスを適用 (470 nm) 発作時のイベントを開始する (最小 10 mW/mm2の出力強度) を持つ光します。手動式マニピュレーターを使用して、記録領域の真上 1,000 μ m コア径光ファイバー (0.39 NA) を配置します。
      注: 発作時のイベント発生の所望の速度に合わせて光刺激の間隔を設定する (すなわち、1 パルスごとの 300 s)。ただし、レートできない発作時のイベントが発生する本質的な率から過度に誇張されました。

結果

100 μ M 4-AP の良質 (無傷) 450 μ m サイズの皮質脳スライスに、少年 vgat ノックアウト ChR2 確実に誘発マウス発作再発 (> 5 s) (図 1Ai) 15 分以内からアプリケーション。100 μ M 4-ap 通信の質の悪いのスライスへの応用結果イベントを破裂、またはスパイク活動 (図 1Aii)。平均すると、ごと切り裂かれたマウスの脳スライスの 40% は、...

ディスカッション

脳スライスは proconvulsant 薬やニューラル ネットワークの興奮性を高め、発作時イベント (アノキシア発作様イベント) の沈殿物を促進するために変更されたアプライド出納と扱われます。マウスの体性感覚-運動部最寄のコロナ スライス後板状領域 (RS) のではなく、エリア 2 (CG)、帯状皮質を含める必要があります。これらの解剖学的マーカーは、辺縁系発作時イベントの誘導に最適な各種の?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、カナダ保健研究機関 (ピーター ・ l ・ カーレン、タウフィック A. Valiante モップ 119603)、(にする A. Valiante)、オンタリオの脳研究所と (マイケル ・ チャン) に Mightex 学生研究助成金によって支持されました。リアム長いビデオの原稿を撮影の彼の援助に感謝したいと思います。数字とこの原稿内のテーブルをコンパイルのパリア Baharikhoob、Abeeshan Selvabaskaran、Shadini Dematagoda を認識したいと思います。図 1 a、 3 a 4 a 6 aチャンらに公開されているデータから作られたすべての元の数字16。

資料

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