Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מודלים התקף אקוטי חשובים ללמוד המנגנונים אפילפטית אירועים. יתר על כן, היכולת להפיק אפילפטית אירועים לפי-דרישה מספק שיטה יעילה במיוחד ללמוד רצף האירועים שבבסיס בהכנסתם המדויק. כאן, אנו מתארים את הדגמים פרכוס קורטיקלית פמפרידין חריפה נוסדה בשנת רקמה אנושית של עכבר.

Abstract

שליטה התקפים נותר סוגיה מאתגרת עבור הקהילה הרפואית. כדי להפוך את התקדמות, חוקרים צריכים דרך בחקר דינמיקה פרכוס ולחקור בהרחבה מנגנונים הבסיסית שלה. התקף אקוטי דגמים נוחים, מציעים את היכולת לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות, ניתן להפיק כמויות גדולות של electrographic פרכוס דמוי אירועים (התקפי). ממצאי מבטיח מודלים התקף אקוטי ניתן אז מתקדמים כדי אפילפסיה כרונית מודלים של ניסויים קליניים. לפיכך, לומד התקפים בדגמי חריפה להעתיק במדויק את חתימות electrographic, דינמיות של התקף קליניים יהיה חיוני לייצור ממצאים הרלוונטית קלינית. לומד אירועי התקפי. התקף אקוטי דגמים שהוכנו רקמה אנושית חשוב גם להכנת הממצאים הרלוונטיים קלינית. המוקד מפתח בעיתון הזה הוא על מודל 4-AP קורטיקלית בשל צדדיות שלה ביצירת אירועים התקפי. במחקרים גם ויוו וגם במבחנה , כמו גם העכבר וגם רקמה אנושית. השיטות בעיתון הזה גם מתארים שיטה חלופית האינדוקציה ההתקף באמצעות אפס-Mg2 + המודל ומספקים סקירה מפורטת על היתרונות והמגבלות של פעילות אפילפטית דמוי המופקים השונות חריפה מודלים התקף. יתר על כן, על ידי ניצול של optogenetic זמינים מסחרית העכבר זנים, דופק אור הבריף (30 ms) יכול לשמש כדי לעורר אירוע התקפי זהים לאלו המתרחשים באופן ספונטני. באופן דומה, פחזניות 30-100 ms של נוירוטרנסמיטרים (חומצה גאמא אמינו בוטירית או גלוטמט) ניתן להחיל הרקמה האנושית כדי לעורר התקפי. אירועים זהים לאלו המתרחשים באופן ספונטני. היכולת לעורר התקפי. אירועים לפי-דרישה במודלים התקף אקוטי מציע את היכולת החדשה כדי לבחון את רצף המדויק של אירועים ביסוד תפיסת החניכה dynamics ביעילות להעריך את פוטנציאל טיפולי אנטי-אפילפטית.

Introduction

מודלים התקף אקוטי יכול לשכפל בהצלחה מזכיר אירועים התקפי שנצפתה על העוויתיים (EEG) של אנשים חווים התקף electrographic חתימות. חוקרים משתמשים אלה אירועים דמויי התקפי (המכונה בזאת התקפי 'אירועים' ') כתחליף עבור אירוע פרכוס1. קלינית, אירועי התקפי. לשמש כמדד מהימן לאירועים פרכוס מאז ההתקפים הפרעה נוירולוגית שמקורה במוח. יחידת ניטור אפילפסיה, נוירולוגים להסתמך על הגילוי של אירועים התקפי. כדי לאשר את אזור epileptogenic של המוח ולבודד אותו עבור כריתה2. בנמרץ, רופאים לפקח על פעילות התקפי. כדי להעריך אם כל פעילות ההתקף נמשך חולים מסומם3. שליטה התקפים נותר נושא מאתגר עבור הקהילה הרפואית, כמו 30% מהחולים אפילפסיה עמידים סמים תרופות זמינות4,5, 10% במקרים רפואיים שיכרון התקפים של הם להגיב הטיפול הסטנדרטי3. זה מציג בעיה רצינית עבור החברה, 10% מהאוכלוסייה האמריקאית היא prospected לחוות אירוע פרכוס אחד ךלהמב, 3% צפויים לפתח אפילפסיה6.

לומד התקפים במודלים אפילפסיה כרוני הוא יקר, מייגעת, לעתים קרובות לקחת חודשים להתכונן7. . זה גם קשה לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות במעבר בחופשיות חיות... ניסויים קליניים בבני להתמודד עם בעיות דומות, כמו גם מורכבויות נוספות הקשורות החולה והסכמתו, השתנות הרקעים של המשתתפים, מעורבים שיקולים מוסרי וערכי,8. מודלים התקף אקוטי, מצד שני, הם חיוביים כי הם יחסית נוח להכין חסכוניים, מסוגל לייצר כמויות גדולות של אירועי התקפי. המחקר9. בנוסף, הרקמה קבוע בעמדה יציבה, אז התנאים אידיאליים לביצוע ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות צריך להתעמק פרכוס dynamics, הפתופיזיולוגיה הקשורה הבסיסית. מודלים התקף אקוטי להישאר חיובית על מודלים סיליקו (מחשב) משום שהם מבוססים על החומר הביולוגי מורכב הרשת של המוח העצבית המרכיבים אותה עם כל הגורמים הטבועים קישוריות סינפטית, זה עשוי לא להילכד על-ידי מחשב אפילו הכי מפורט מודלים10. תכונות אלה להפוך התקף אקוטי מודלים צפוי להיות יעילים הקרנת עבור טיפולים אנטי-אפילפטית פוטנציאליים ולגרום ממצאים ראשוניים לפני קידום אותם לחקירה נוספת באפילפסיה כרונית מודלים של ניסויים קליניים.

בדרך כלל, התקף אקוטי מודלים נגזרות רקמת מוח נורמלי, זה כבר נתון לתנאים hyper-טמפרמנט. לזירוז הרלוונטית קלינית אירועי התקפי ברקמת המוח בריא, חשוב להבין כי המוח מתפקד בצורה אופטימלית המצב קריטי11 עירור (E) וניגוד (I) איפה מאוזנת12. הפרעה של ה-E-אני האיזון יכול להוביל המדינה תפיסה היפר-טמפרמנט שבה אירועי התקפי. לזרז. בהתאם לכך, במסגרת מושגית זו, קיימות שתי אסטרטגיות מרכזיות להפקת אירועים התקפי פרוסות המוח (במבחנה) או בכל ההכנות שלם-מוח (ב- vivo): ירד עיכוב ("עכבה של הקדמית") או גדל עירור ("אי-עכבה של הקדמית"). עם זאת, אירועי התקפי מאוד מסודרות ומסונכרנות האירועים הדורשים את השפעת GABAergic interneurons שננהל את פעילות13,של רשת עצבית14. מסיבה זו, דגמים שאינם עכבה של הקדמית הן היעילות ביותר לאירועים התקפי. ביצירת ברשתות עצביות מבודד, כגון במבחנה המוח פורסים15, ואילו במבחנה עכבה של הקדמית מודלים נפוץ להוביל spiking פעילות המזכירה interictal דמוי עולה. יתר על כן, במסגרת מושגית זו אירוע המסנכרן רגעית ניתן בצורה אמינה גם מפעילים של אירוע התקפי.16. למעשה, אירוע התקפי. יכול להיות מופעלות על ידי כל ההפרעות קלות להחיל את המערכת העצבית17 כאשר זה נקודת מעבר ("נגע הסתעפות") המצב קריטי18. באופן מסורתי, לפליטת אלה היו המושרה על ידי גירוי חשמלי. ההתפתחות האחרונה של optogenetics במדעי המוח, לעומת זאת, מציעה כעת אסטרטגיה יותר אלגנטי לזירוז המצב קריטי מעברים16.

בשיטות המתוארות במאמר זה מדגימים כיצד ליצור אירועים התקפי. לפי דרישה במודלים התקף אקוטי במבחנה (שלב 1 של פרוטוקול) וגם אין ויוו מחקרים (שלב 2 לפרוטוקול). הם כרוכים הבחירה של אזור במוח, פרכוס אינדוקציה שיטה, סוג המחקר המינים; עם זאת, המוקד יהיה על הבחירה המומלצת מודל חריפה 4-AP קורטיקלית התקף בגלל צדדיות שלה במגוון רחב של סוגי המחקר. דגם 4-AP התקף אקוטי במבחנה מבוססת על פרוטוקול רגיל להכין פרוסות המוח איכותיים להקלטות אלקטרופיזיולוגיות ולומד הדמיה19. פרוטוקולים אלה כבר בשימוש כדי לגרום במבחנה המוח הילתית פרוסות קליפת המגע-מנוע של עכברים16,20 ובני21. שינויים כדי להפיק אירועים התקפי בסוגים אלה של פרוסות המוח הוכחו בעבר16 ואת הפרטים המלאים מתוארים את פרוטוקול להלן. המודל 4-AP קורטיקלית התקף אקוטי ויוו מבוססת על פרוטוקול רגיל להכין גולגולת עבור הדמיה מחקרים22. השינוי הוא כי ללא חלון (שקופיות זכוכית) מותקן בעקבות את הניתוח. במקום זאת, proconvulsant סוכנים (4-AP) הגארדיאן מוחלים על קליפת המוח החשוף לזירוז אירועי התקפי. בעוד החיה הוא בהרדמה כללית. לידע שלנו, הקבוצה שלנו היה הראשון לפתח חריפה ויוו פרכוס קורטיקלית מודל זה עכברים16,23. חריפה ויוו פרכוס קורטיקלית 4-AP המודל מקריסטלים של עכברים בוגרים פותחה כדי להשלים את המודל פרוסה במבחנה של רקמות לנוער. השכפול של הממצאים במודל פרכוס למבוגרים ויוו מסייעת להכליל ממצאי מודלים פרוסה באמצעות טיפול את החששות הכרוכים בדבר התנאים הלא-פיזיולוגיים של פרוסה המוח 2D (לעומת תלת-ממדי שלם-מוח מבנה) וההבדלים פיזיולוגי בין רקמות לנוער ומבוגרים.

השיטה של חניכה אירוע התקפי. לפי דרישה הוא הפגין באמצעות או פחזניות של נוירוטרנסמיטרים אסטרטגיות picospritzer או optogenetic. לפי מיטב ידיעתנו, הקבוצה שלנו הוא הראשון ליזום אירועים התקפי. רקמות אנושיות באמצעות נוירוטרנסמיטורים ויה picospritzer16. Optogenetic אסטרטגיות, המתח עכברים C57BL/6 הוא המתח קונבנציונאלי משמש ביטוי transgenes. הביטוי של channelrhodopsin-2 (ChR2) GABAergic interneurons או glutamatergic תאים כפירמידה יספקו את היכולת אופציונלי להפיק אירועים התקפי. לפי-דרישה עם להבזקי האור קצרה. זני עכברים optogenetic מתאימים כוללים את הווריאציה C57BL/6 זמינים מסחרית המבטאת ChR2 ב משני interneurons, בעזרת העכבר vesicular גאבא טרנספורטר promotor (VGAT)24, או תאים כפירמידה, באמצעות העכבר התימוס תא אנטיגן 1 promotor (Thy1)25. אלו עכברים זמינים מסחרית של VGAT-ChR2 ו- Thy1-ChR2 מציעים את ההזדמנות כדי להפעיל הנוירונים GABAergic או glutamatergic הנוירונים, בהתאמה, בתוך קליפת עם כחול (470 ננומטר) אור. היכולת להפיק אירועים התקפי. לפי דרישה במודלים התקף אקוטי יכול להציע הזדמנויות חדשניים בחקר תפיסת החניכה דינמיקה ולהעריך ביעילות טיפולים אנטי-אפילפטית פוטנציאליים.

Protocol

כל המחקרים מעורבים מטופלים בוצע תחת פרוטוקול שאושר על-ידי אוניברסיטת בריאות רשת המחקר אתיקה הלוח בהתאם הצהרת הלסינקי. נהלים המערבות בעלי חיים היו לפי הנחיות על ידי המועצה הקנדית על החיה אכפת ואושרו על-ידי Krembil מכון חיה אכפת לי וועדת המחקר.

1. פרוטוקול i: סימן במבחנה תפיסת המודל

  1. אופן ההכנה של פתרונות לנתיחה, נוזל מוחי שדרתי מלאכותי
    1. הנדסה גנטית Carbogenate מים (אשר מים מסוננים עם resistivity של 18.2 MΩ·cm) עם carbogen (95% או2/5% CO2) עבור 5 דקות באמצעות אויר רשתות ומפזרים בועה אבן (מרססים עבור אקווריומים).
      הערה: אבנים האוויר יכול להיות מחובר וסת באמצעות תקן סיליקון אבובים של טנק carbogen. אם אבנים האוויר אינם זמינים, חותם לסגור סוף לאורך צינור סיליקון, חורים קטנים החותם כדי לאפשר את גז carbogen בועה החוצה ואת carbogenate הפתרון.
    2. להכין פתרון לנתיחה על ידי המסת של מומסים בגבול בין לוח 1 במים הנדסה גנטית. להוסיף CaCl2 פתרון כי כבר carbogenated לפחות 5 דקות כדי לעזור לו להתמוסס.
      הערה: לחלופין, להוסיף CaCl2 קודם, כך זה יכול להמיס בקלות בפתרון רוויים. הפתרון, בצורת נוזל, צריך להיות 300-320 mOsm/L, יש pH של 7.4 לאחר להיות רווי carbogen.
      1. . תירגע הפתרון לנתיחה 0 - 4 מעלות צלזיוס. . עזוב הפתרון במקרר למשך הלילה או למקם את הפתרון במקפיא לשעה וללא הרף לפקח על הטמפרטורה.
        הערה: הפתרון לנתיחה ניתן לאחסן עד 3 לילות; ביטול לאחר מכן.
      2. Carbogenate הפתרון לנתיחה למשך 5-10 דקות לפני השימוש.
        הערה: באופן אידיאלי, הפתרון אמור להופיע גם בתור הרפש או להיות משתנה יעזור לפני השימוש.
    3. להכין מכרסמים נוזל מוחי שדרתי מלאכותי (כלנית חדד) על ידי המסת של מומסים בגבול בטבלה 2 (או טבלה 3 עבור חנה המבר אנושי) במים הנדסה גנטית. Carbogenate הפתרון חנה המבר בזמן זה הוא באמבט מים מחומם עד 35 ° צלזיוס עד השימוש. להוסיף CaCl2 פתרון כי כבר carbogenated לפחות 5 דקות כדי לעזור לו להתמוסס.
      הערה: לחלופין, להוסיף CaCl2 קודם כך זה יכול להמיס קל ב פתרון רוויים. הפתרון, בצורת נוזל, צריך להיות 290-320 mOsm/L, יש pH של 7.4 לאחר להיות רווי carbogen. פתרונות צריכה להיעשות כרכים 1, 2 או 4 L בהתאם משך הזמן של הניסויים. לעשות 4 L יום שלם (8 שעות) של ניסויים. כלנית חדד צריכה להיעשות טריים כל יום; אין לאחסן אותו יותר מ 1 י.
  2. דיסקציה העכבר כדי לאסוף את רקמת המוח
    הערה: עבור רקמה אנושית, המשך לשלב הבא (שלב 1.3) על עשיית פרוסות המוח עם vibratome. בצורת קובייה אבני (1 ס מ3) של רקמת המוח צריכה להתקבל מן המנתח באמצעות הליכים שתואר לעיל26,27.
    1. לאסוף את כל הכלים חומרים נחוצים והניתוחים בעלי חיים. להגדיר את סביבת העבודה כדי להתכונן והניתוחים בעלי חיים.
      1. בדוק את המיכל carbogen (95 %O2/5%CO2) כדי לוודא שאינו ריק. החלף את בלון גז לפני ניסויים אם יש פחות מ- 500 psi לחץ הנותרים.
      2. כיילו את vibratome (רטט להב רקמות מבצעה) לפי ההוראות של היצרן. להתאים את vibratome הגדרה של משרעת חיתוך של 1 מ מ ואת מהירות חיתוך של 0.12 מ"מ/s.
        הערה: ההגדרות האופטימליות עשויים להיות שונים עבור כל בודדים רוטטת רקמות להב קאטר; עם זאת, באופן כללי, משרעת צריך להיות גבוה, מהירות החיתוך צריך להיות נמוך.
      3. למלא את המוח פרוסה הדגירה תא (קרי, השומר פרוסה המוח) עם כלנית חדד, בועה זה עם carbogen. אז במקום תא הדגירה באמבט מים להגדיר ב 35 º C.
        הערה: השתמש מכרסם חנה המבר פרוסות המוח מכרסמים, חנה המבר האנושי פרוסות המוח האנושי.
    2. לקבל עכבר לנוער של מין או, בין גיל 13 d (p13) עד 21 ד (p21, איפה p0 תאריך הלידה).
    3. עזים ומתנגד את העכבר עם זריקה בקרום הבטן של סודיום פנטוברביטל (55 מ"ג/ק"ג משקל גוף). לאחר העכבר הוא מורדם עמוקות, כמצוין על-ידי העדר רפלקס קמצוץ של הבוהן, מיד להשתמש מכשיר גיליוטינה שאושרו על-ידי הווטרינר כדי לערוף את העכבר בתנועה מהירה אחת.
      הערה: להכין את הזריקה סודיום פנטוברביטל לפי הנוהל המומלץ על ידי המוסדיים הנחיות
    4. החזק האף העכבר כדי לייצב את הראש ערופת הראש ולבצע בעדינות חתך קו האמצע מתחילה בין העיניים של העכבר, לכל אורכו של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת. ודא שהגולגולת לא דחוס על ידי למידת הלחץ המופעל על ידי סכין הגילוח. להשתמש בפינת התהום פי כדי להגביר את הדיוק לחתוך.
    5. רחוקים המשק של הקרקפת של העכבר באמצעות האצבעות כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן השתמש הפינה טריים של הקצה לבצע חתך לאורך הקו האמצעי של הגולגולת; שים לב כדי להימנע מכל מגע עם קליפת המוח.
    6. הוספה מלקחיים קיסם לתוך ארובות העיניים של העכבר כדי לייצב את הראש ערופת הראש ולמקם אותו בצלחת פטרי מלא קר (0 - 4 מעלות צלזיוס) פתרון לנתיחה. ודא כי הראש לגמרי שקוע בפתרון לנתיחה.
    7. להשתמש עוד זוג מלקחיים קיסם בעדינות הקילוף בקרקפת של העכבר, להסיר את עצם האף על ידי לקלף אותו, ולהסיר האחורי (צד סימטרית) של הגולגולת.
      הערה: עצם האף של עכברים לנוער הוא רך מאוד ויכולים להישבר בקלות.
    8. השתמש במרית מיקרו לחתוך העצבים האופטים, המשולש, ואת חוט השדרה. לאחר מכן, השתמש המרית מיקרו בעדינות להפריד למוח הגולגולת. ישאיר אותו לגמרי שקועים הפטרי מלא עם פתרון לנתיחה.
  3. הכנת קורטיקלית פרוסות קליפת המגע-מנוע
    1. למלא מגש מאגר של vibratome ~ 150 מ"ל של קור (0 - 4 מעלות צלזיוס) פתרון לנתיחה.
      הערה: לחלופין, השאר את המגש מאגר במקפיא עד הדרושים לשמירה על טמפרטורה נמוכה במהלך ההליך עם פרוסות.
    2. הדבק על רקמת המוח העכבר או האדם לבמה vibratome (הדגימה מחזיק/מגש) באמצעות דבק דבק מיידית. על עכברים, לחתוך חלק קטן סימטרית של המוח (כלומר, המוח הקטן) כך שזה יכול להיות דבוק בקלות בחוזקה בעל הדגימה (המאפשר את הצד rostral של המוח, כדי להתמודד עם התקרה).
      הערה: לחלופין, פרוסות המוח העכבר אופקי ניתן להכין על ידי הדבקה בצד הגבי של המוח אל בעל הדגימה (בצד הגחוני של המוח צריך להתמודד על התקרה)28.
    3. הנח בעדינות בעל הדגימה (עם רקמת המוח) במגש מאגר. ודא כי החלק הגבי של המוח פונה הלהב של vibratome.
      הערה: חיוני כדי למזער את כמות הזמן שהמוח חשוף לאוויר.
  4. חלוקתה של רקמת המוח וגבייה
    1. לפרוס את המוח לפרוסות 450 μm עבות באמצעות vibratome את מהראש לכיוון הגחון. ודא כי המוח נשאר תקוע לגמרי המגש הדגימה בעודו חותך אותו.
      1. לבצע את החתך הראשון במוח העכבר כדי להסיר את הנורה הריח. לאחר מכן, לבצע חתכים עוקבים עד אזור המגע-מנוע נצפית (ממוקמת בערך באמצע הדרך בין הנורה הריח bregma).
        הערה: לחלופין, פורסים המוח לפרוסות (200 μm) רזה עד כפיס המוח יופיע בתצוגה הילתית של המוח, אשר מציין אזור המגע-מנוע הוא קרוב.
    2. להשתמש על פיפטה רחב נשא העברה כדי לאסוף הילתית פרוסות (450 μm) אשר מכילים את אזור המגע-מנוע ויציפו אותם בצלחת פטרי המכילות קר (0 - 4 מעלות צלזיוס) פתרון לנתיחה.
    3. סכין גילוח חדש ולהשתמש לחתוך כל רקמות עודף של הפרוסות. עבור פרוסות הילתית של עכברים, לבצע רוחבי של חתך מתחת commissure neocortical (כלומר, כפיס המוח). Not גזור בתנועות ניסור; פשוט הפעילו לחץ על הלהב לתוך הרקמה, להשתמש במברשת המפרט להפריד בעדינות את הרקמה. ודא למזער את התנועה של הפרוסה הילתית.
    4. שימוש פיפטה רחב נשא העברה להעביר את החלק הגבי של הפרוסות הילתית המכילים קליפת (שכבה 1-6) על צלחת פטרי השני מלא חמים (35 מעלות צלזיוס) חנה המבר לרגע (~ 1 s). לאחר מכן, מיד להעביר את הפרוסות תא הדגירה המכיל carbogenated חמים (35 מעלות צלזיוס) חנה המבר.
      הערה: מטרת העברת לתוך הפטרי עם חנה המבר היא למזער העברת פתרון לנתיחה לתא הדגירה בעת העברת פרוסות המוח עם פיפטה רחב נשא. לנצל את הדגירה הלשכה בארות מרובים כדי לשמור על מוח שונים פרוסות מאורגן.
    5. למחוק את שאר המוח וחוט של חיה ברוטב על פי הנחיות מוסדיים.
  5. הדגירה ותחזוקה
    1. להשאיר את פרוסות המוח שקוע מעט בחדר דגירה ב 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, להסיר תא דגירה תנורים, לאפשר לו לחזור לטמפרטורת החדר (20-25 ° C). המתן 1h לציון פרוסות המוח להתאושש לפני ביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות.
      הערה: ודא ישנם אין בועות אוויר אוספים מתחת פרוסות המוח בבית הבליעה הדגירה. בועות אוויר הם ממשקי אוויר לגרום נזק לרקמות. פרוסות המוח של העכבר יכול להישמר עבור 6-8 h, בעוד רקמת המוח האנושי ניתן לאחסן עד 24 שעות בחדר דגירה טוב-carbogenated עם חנה המבר המתאים.
  6. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של השכבה קורטיקלית שטחית
    הערה: אירועי התקפי. הם נצפו ההקלטות (LFP) פוטנציאל חוץ-תאית שדה מקומי של פרוסות המוח. LFP הפרוסה המוח יכול ניתן להקליט ולצפות במעשיהם של הקאמרית סוג ממשק29 או מערכת המשוקע מרובה האלקטרודות (מאה)16. התהליך שתואר לעיל16 , פרטים נוספים מתוארים להלן.
    1. השתמש פיפטה רחב נשא העברה או מברשת המפרט כדי להזיז פרוסה המוח לנייר עדשה חתוכות מראש מעט גדול יותר, זה מתקיים במקום באמצעות פינצטה שיניים. להעביר את העדשה נייר (הפרוסה המוח היא הבסיס) לחדר ההקלטה ואבטח אותו בעמדה עם מסך נבל.
    2. ריצה חמים (35 מעלות צלזיוס), carbogenated perfusate חנה המבר דרך החדר הקלטה על הפרוסה המוח בקצב של 3 mL/min (~ 1 טפטוף/s). השתמש מדחום דיגיטלי כדי להבטיח שלחדר ההקלטה הוא 33-36 מעלות צלזיוס.
    3. משוך אלקטרודות זכוכית עם עכבה של 1-3 MΩ של זכוכית בורוסיליקט אבובים (עם הקוטר החיצוני של 1.5 מ מ) באמצעות של פולר. מילוי האלקטרודות זכוכית עם כלנית חדד (~ 10 µL) באמצעות מזרק המילטון. מיד למחוק את האלקטרודה אם העצה פגום.
      הערה: מלבין את החוט כסף (5 דקות), אפשר רק חלק מזערי (קרי, הטיפ) של חוט כסף כדי להיות שקוע בתוך זכוכית מלא הגב חנה המבר האלקטרודות כדי למזער את הרעש ואת הסחף במהלך ההקלטות. הסר כל עודף כלנית חדד אלקטרודת זכוכית עם מזרק המילטון במידת הצורך.
    4. שימוש במיקרוסקופ סטריאו X 20 במדריך במדויק ההקלטה אלקטרודת זכוכית לתוך השטחיות קורטיקלית שכבה (2/3) באמצעות סימולטורי ידנית. שיא/הצג הפעילות החשמלית של המוח פרוסה על מחשב עם תוכנה רגילה.
      הערה: פרוסות המוח (איכותיים) בת קיימא תערוכת פוטנציאלי עורר חזקה בתגובה גירויים חשמליים יישומית (100 µs, 30-300 μA) או להבזקי האור (30 ms, 10 מ"מ/mW2) בשביל לרקמות optogenetic.
  7. אינדוקציה של פעילויות כמו התקף
    1. Perfuse חנה המבר המכיל 100 מיקרומטר 4-aminopyrimidine (4-AP) על הפרוסה המוח. להמיס 80 מ ג של 4-AP ב- 8.5 מ של מים כדי ליצור פתרון מניות של 100 מ מ 4-AP. להוסיף 100 µL 100 מ מ 4-AP מניות פתרון 100 מ של חנה המבר כדי להשיג perfusate של חנה המבר עם 100 מיקרומטר 4-AP.
      הערה: לחלופין, השתמש אפס-Mg2 + כלנית חדד (טבלה 4), פתרון חנה המבר ששונה המכילה לא הוסיף Mg2 +, כדי perfuse את הפרוסה המוח. עבור רקמה אנושית, להשתמש בשילוב של 4 מיקרומטר 100-AP ב אפס-Mg2 + חנה המבר אנושי (טבלה 5) כדי להשיג תוצאות אופטימליות. הזמן הממוצע עבור אירועים התקפי. להופיע הוא 15 דקות; עם זאת, ייתכן שיחלפו עד 40 דקות בשביל כמה פרוסות המוח.
  8. דור פרכוס לפי דרישה: אסטרטגיית optogenetic עבור optogenetic עכברים
    1. החלת דופק הבריף (30 ms) של כחול (470 ננומטר) אור (בעוצמה פלט2 מינימום 1 mW/מ) ליזום אירוע התקפי. השתמש תחמן ידנית למיקום של מיקרומטר 1,000 הליבה קוטר סיב אופטי (0.39 NA) ישירות מעל האזור הקלטה.
      הערה: הגדרת הקצב של צילום-גירוי כדי להתאים את הקצב הרצוי של התרחשות אירוע התקפי (כלומר1. דופק כל 50 s). עם זאת, הקצב לא מוגזמות יתר על המידה מהתעריף פנימי שבו מתרחשים אירועים התקפי.
  9. דור פרכוס לפי דרישה: אסטרטגיה הלא-optogenetic רקמה אנושית
    1. מקם את הפרוסה המוח כך השכבות השטחיות במעלה הזרם, והם לרבדים עמוקים במורד הזרם לזרימה של perfusate דרך החדר הקלטה.
    2. משוך את אלקטרודת זכוכית (מאותו סוג המשמשים עבור ההקלטות LFP), לגעת בעדינות את קצהו עם מגב המשימה העדינה כדי ליצור פתח קטן. מילוי האלקטרודה עם µL ~ 25 מ"מ גאבא (מומס במים) ולחבר אותו picospritzer. לחלופין, מילוי האלקטרודה עם 200 גלוטמט מיקרומטר (מומס במים).
      הערה: כדי להעריך את עוצמת הקול להיות נפוחים מ picospritzer (~ 50 µL), החל שאכטה מבחן לצלחת פלסטיק (רצוי gridded). לאחר מכן, להחיל droplet של כרכים ידועים (קרי, 10 µL, 20 µL, 50 µL או 100 µL) עם פיפטה עבור השוואה עם אצלם הבדיקה.
    3. חלות נשיפה של מוליך עצבי (GABA או גלוטמט) הרקמה האנושית עם picospritzer (10-20 psi למשך 30-100 אלפיות השניה) ליזום אירוע התקפי. החלת שאכטה אחת של 100 מ מ גאבא על גבי השכבה העמוקה (5) של רקמת המוח להפקת אירועים התקפי בשכבה השטחית (2/3). לחלופין, להחיל שאכטה אחת של גלוטמט מיקרומטר 200 ישירות על גבי השכבה השטחית להפקת אירועים התקפי בשכבה השטחית.
      הערה: הגדרת הקצב של picospritzer עלים כדי להתאים את הקצב הרצוי של התרחשות אירוע התקפי (כלומר1. דופק כל 50 s). עם זאת, הקצב לא מוגזמות יתר על המידה מהתעריף פנימי שבו מתרחשים אירועים התקפי.

2. פרוטוקול II: חריפה In vivo תפיסת המודל

  1. ניתוח והכנה כירורגי
    1. להשיג על העכבר למבוגרים (p35 - p60) של מין או.
    2. עמוק עזים ומתנגד עכבר עם קטמין (95 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (5 מ"ג/ק"ג). לבצע את בדיקת רפלקס של הבוהן-קמצוץ כדי להבטיח שהעכבר מורדמת. לחלופין, השתמש איזופלוריין (4% עבור אינדוקציה, 1.5-2% לניתוח) כדי עזים ומתנגד העכבר.
      הערה: הבחירה של חומרי הרדמה יכולים להשפיע תפיסת פעילות30,31.
    3. הר העכבר לתוך מסגרת stereotaxic נאבטח את ראשו עם האוזן סורגים. מקם כרית מחוממת מתחת העכבר משך זמן הניתוח.
    4. לגלח את הראש של העכבר באמצעות מכונת תספורת מכרסמים לחשוף את עור הקרקפת. להזריק mL 0.3 של לידוקאין עם 25 G 5/8 במחט לתוך קרום העצם כדי למנוע דימום יתר או כאב. להחיל משחה עיניים לעיניים של העכבר כדי למנוע מהם מתייבש במהלך הניסוי.
    5. לצבוט והרם במרכז הקרקפת של העכבר כדי להעריך אם את הרפלקסים שלו נעלמו. לאחר מכן, לבצע אופקי לחתוך כדי לחשוף את bregma לאזור למבדה של הגולגולת. בעדינות לגרד את כל שטח חשוף הגולגולת באמצעות מקלון צמר גפן כדי ליצור משטח יבש.
    6. לבצע ניתוח של פתיחת גולגולת של 4 מ מ קוטר ב קואורדינטות 2.0 מ מ rostrocaudal lateromedial ו--2.0 מ מ כדי לחשוף את קליפת המגע. סמן את המיקום עם מעגל (4 מ מ מ) בעזרת סמן קבוע. תקדחי מסביב למעגל עם קומפרסורים שיניים עד לשכבת הנותרים של עצם הגולגולת נותנת בקלות בדרך כשאני נדחף למטה. החל תמיסת מלח על גבי השכבה של העצם לפני הסרת את הניתוח עם קיסם מלקחיים. לאחר מכן, להחיל תמיסת מלח חמימים על האזור חשוף.
  2. אינדוקציה כימי של התקפים ושיטות הקלטה
    1. משוך אלקטרודות זכוכית עם עכבה של 1-3 MΩ של זכוכית בורוסיליקט אבובים (עם הקוטר החיצוני של 1.5 מ מ) באמצעות של פולר. מילוי האלקטרודות זכוכית עם ~ 10 µL של חנה המבר או תמיסת מלח באמצעות המילטון מזרק. מיד למחוק את האלקטרודה אם העצה פגום.
      הערה: מלבין את החוט כסף (5 דקות), אפשר רק חלק מזערי (קרי, הטיפ) של חוט כסף כדי להיות שקוע בתוך זכוכית מלא הגב חנה המבר האלקטרודות כדי למזער את הרעש ואת הסחף במהלך ההקלטות. הסר כל עודף כלנית חדד אלקטרודת זכוכית עם מזרק המילטון במידת הצורך.
    2. השתמש תחמן ידנית כדי להנחות את אלקטרודת זכוכית לתוך השטחיות קורטיקלית שכבה (2/3) באזור המגע-מנוע. שיא/הצג הפעילות החשמלית של המוח פרוסה על מחשב עם תוכנה רגילה.
      הערה: משכבה 2/3 הוא כ 0.3 מ מ עמוקה פני32.
    3. החל הגארדיאן ~0.5 mL 1.5 מ מ 4-AP תמיסת מלח על גבי קליפת המוח החשוף של העכבר עם מזרק, עד שיכסה לגמרי את הניתוח. להמיס 14 מ ג 4-AP ב- 100 מ של תמיסת מלח מול לעשות פתרון מניות של 1.5 מ מ 4-AP תמיסת מלח.
      הערה: להכין תמיסת המלח 4-AP לפני תחילת הניסוי. בממוצע, אירועים התקפי מופיעים 15-30 דקות לאחר יישום מקומי.
  3. דור על פי דרישה של התקפים בעכברים optogenetic
    1. החלת דופק הבריף (30 ms) של כחול (470 ננומטר) אור (בעוצמה פלט2 מינימום 10 mW/מ) ליזום אירוע התקפי. השתמש תחמן ידנית למיקום של מיקרומטר 1,000 הליבה קוטר סיב אופטי (0.39 NA) ישירות מעל האזור הקלטה.
      הערה: הגדרת הקצב של צילום-גירוי כדי להתאים את הקצב הרצוי של התרחשות אירוע התקפי (כלומר1. דופק כל 300 s). עם זאת, הקצב לא מוגזמות יתר על המידה מהתעריף פנימי שבו מתרחשים אירועים התקפי.

תוצאות

היישום של 100 מיקרומטר 4-AP כדי פרוסות באיכות טובה (ניזוק) מוח קליפתי מיקרומטר בגודל 450 מ לנוער VGAT-ChR2 אמין המושרה חוזרים ונשנים התקפי. אירועי עכבר (> 5 s) בתוך 15 דקות (איור 1Ai). היישום של 4 מיקרומטר 100-AP פרוסות באיכות ירודה כתוצאה מתפוצץ אירועים או עולה פעילות (

Discussion

פרוסות המוח מטופלים עם תרופה proconvulsant או perfusate חנה המבר שינו כדי להגביר את רגישות של הרשת העצבית ולקדם משקעים של התקפי. אירועים (אירועים פרכוס דמוי electrographic). על עכברים, להכיל הפרוסות הילתית המועדפת של אזור המגע-מנוע בקליפת cingulate, אזור 2 (ג), אבל לא את אזור retrosplenial (RS); סמנים אנטומיים אלה מסייעים ל?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מוסדות הקנדי של המחקר בריאות (מגב 119603 פיטר ל' Carlen, תאופיק א Valiante), מכון המוח אונטריו (כדי תאופיק א Valiante), את Mightex תלמיד המחקר מענק (מייקל צ'אנג). ברצוננו להודות ליאם לונג על עזרתו לצלם וידאו כתב היד. ברצוננו להודות פאריה Baharikhoob, Abeeshan Selvabaskaran, Shadini Dematagoda לסיוע שלהם בשנת קומפילציה לאיורים ולטבלאות בכתב היד. דמויות 1A, 3A, 4Aו- 6A הם דמויות המקורי כל זני הנתונים פורסמו ב- Chang. et al. 16.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sodium pentobarbitalN/AN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
1 mm syringeN/AN/APurchased through UT Med Store
25G 5/8” sterile needleN/AN/APurchased through UT Med Store
Single edge razor blade (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
Instant adhesive glueN/AN/APurchased through UT Med Store
Lens paperN/AN/APurchased through UT Med Store
Glass petri dish (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
Splinter forceps (2x)N/AN/APurchased through UT Med Store
PVC handle micro spatulaN/AN/APurchased through UT Med Store
Micro spoon with flat endN/AN/APurchased through UT Med Store
Detailing brush 5/0N/AN/APurcahsed from a boutique art store
Wide bore transfer pipetteN/AN/APurchased through UT Med Store
Dental TweezerN/AN/APurchased through UT Med Store
Thermometer (digital)N/AN/APurchased on Amazon.ca
Check carbogen tank (95%O2/5%CO2) N/AN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
VibratomeLeicaN/APurchased through the Toronto Western Hospital's Suppliers
brain slice incubation chamber (a.k.a. brain slice keeper) Scientific Systems Design IncN/A
Sodium Chloride (NaCl)N/AN/APurchased through UT Med Store
Sodium BicarbonateN/AN/APurchased through UT Med Store
DextroseN/AN/APurchased through UT Med Store
Potassium Chloride (KCl)N/AN/APurchased through UT Med Store
Magnesium Sulfate (MgSO4 H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
Sodium phosphate monobasic monohydrate (HNaPO4·H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
Calcium Chloride (CaCl2·2H2O)N/AN/APurchased through UT Med Store
SucroseN/AN/APurchased through UT Med Store

References

  1. Jefferys, J. G. R. Advances in understanding basic mechanisms of epilepsy and seizures. Seizure. 19 (10), 638-646 (2010).
  2. Fujiwara, H., et al. Resection of ictal high-frequency oscillations leads to favorable surgical outcome in pediatric epilepsy. Epilepsia. 53 (9), 1607-1617 (2012).
  3. Chen, H. Y., Albertson, T. E., Olson, K. R. Treatment of drug-induced seizures. British Journal of Clinical Pharmacology. 81 (3), 412-419 (2015).
  4. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  5. Giussani, G., et al. A population-based study of active and drug-resistant epilepsies in Northern Italy. Epilepsy & Behavior. 55, 30-37 (2016).
  6. Pellock, J. M. Overview: definitions and classifications of seizure emergencies. Journal of Child Neurology. 22 (5_suppl), 9S-13S (2007).
  7. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  8. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  9. Castel-Branco, M., Alves, G., Figueiredo, I., Falcão, A., Caramona, M. The maximal electroshock seizure (MES) model in the preclinical assessment of potential new antiepileptic drugs. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 31 (2), 101-106 (2009).
  10. Wendling, F., Bartolomei, F., Modolo, J., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S. Neocortical/Thalamic In Silico Models of Seizures and Epilepsy. Models of Seizures and Epilepsy. , 233-246 (2017).
  11. Cocchi, L., Gollo, L. L., Zalesky, A., Breakspear, M. Criticality in the brain: A synthesis of neurobiology, models and cognition. Progress in Neurobiology. 158, 132-152 (2017).
  12. Xue, M., Atallah, B. V., Scanziani, M. Equalizing excitation-inhibition ratios across visual cortical neurons. Nature. 511 (7511), 596-600 (2014).
  13. Engel, J. . Seizures and epilepsy. , (2013).
  14. Panuccio, G., Curia, G., Colosimo, A., Cruccu, G., Avoli, M. Epileptiform synchronization in the cingulate cortex. Epilepsia. 50 (3), 521-536 (2009).
  15. Avoli, M., de Curtis, M. GABAergic synchronization in the limbic system and its role in the generation of epileptiform activity. Progress in Neurobiology. 95 (2), 104-132 (2011).
  16. Chang, M., et al. Brief activation of GABAergic interneurons initiates the transition to ictal events through post-inhibitory rebound excitation. Neurobiology of Disease. 109, 102-116 (2018).
  17. Jiruska, P., et al. High-frequency network activity, global increase in neuronal activity, and synchrony expansion precede epileptic seizures in vitro. The Journal of Neuroscience. 30 (16), 5690-5701 (2010).
  18. Jirsa, V. K., Stacey, W. C., Quilichini, P. P., Ivanov, A. I., Bernard, C. On the nature of seizure dynamics. Brain. 137 (Pt 8), 2210-2230 (2014).
  19. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Ion Channels: Methods and Protocols. 337, 117-125 (2006).
  20. Li, H., Prince, D. A. Synaptic activity in chronically injured, epileptogenic sensory-motor neocortex. Journal of Neurophysiology. 88 (1), 2-12 (2002).
  21. Köhling, R., Avoli, M. Methodological approaches to exploring epileptic disorders in the human brain in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 1-19 (2006).
  22. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. Journal of Visualized Experiments. (12), e680 (2008).
  23. Ritter, L. M., et al. WONOEP appraisal: optogenetic tools to suppress seizures and explore the mechanisms of epileptogenesis. Epilepsia. 55 (11), 1693-1702 (2014).
  24. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  25. Arenkiel, B. R., et al. In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. Neuron. 54 (2), 205-218 (2007).
  26. Heinemann, U., Pitkänen, A., Buckmaster, P., Galanopoulou, A. S., Moshé, S., et al. Brain slices from human resected tissue. Models of Seizures and Epilepsy. , 285-299 (2017).
  27. Florez, C., et al. In vitro recordings of human neocortical oscillations. Cerebral Cortex. 25 (3), 578-597 (2015).
  28. Lein, P. J., Barnhart, C. D., Pessah, I. N. Acute hippocampal slice preparation and hippocampal slice cultures. Methods in Molecular Biology. , 115-134 (2011).
  29. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  30. Poulton, T. J., Ellingson, R. J. Seizure associated with induction of anesthesia with isoflurane. Anesthesiology: The Journal of the American Society of Anesthesiologists. 61 (4), 471-476 (1984).
  31. Borris, D. J., Bertram, E. H., Kapur, J. Ketamine controls prolonged status epilepticus. Epilepsy Research. 42 (2-3), 117-122 (2000).
  32. DeFelipe, J., Alonso-Nanclares, L., Arellano, J. I. Microstructure of the neocortex: comparative aspects. Journal of Neurocytology. 31 (3-5), 299-316 (2002).
  33. Velasco, A. L., Wilson, C. L., Babb, T. L., Engel, J. Functional and anatomic correlates of two frequently observed temporal lobe seizure-onset patterns. Neural Plasticity. 7 (1-2), 49-63 (2000).
  34. Vlachos, A., Reddy-Alla, S., Papadopoulos, T., Deller, T., Betz, H. Homeostatic regulation of gephyrin scaffolds and synaptic strength at mature hippocampal GABAergic postsynapses. Cerebral Cortex. 23 (11), 2700-2711 (2012).
  35. Kirmse, K., et al. GABA depolarizes immature neurons and inhibits network activity in the neonatal neocortex in vivo. Nature Communications. 6, 7750 (2015).
  36. Stein, V., Hermans-Borgmeyer, I., Jentsch, T. J., Hübner, C. A. Expression of the KCl cotransporter KCC2 parallels neuronal maturation and the emergence of low intracellular chloride. Journal of Comparative Neurology. 468 (1), 57-64 (2004).
  37. Wong, B. Y., Prince, D. A. The lateral spread of ictal discharges in neocortical brain slices. Epilepsy Research. 7 (1), 29-39 (1990).
  38. Trevelyan, A. J., Sussillo, D., Watson, B. O., Yuste, R. Modular propagation of epileptiform activity: evidence for an inhibitory veto in neocortex. Journal of Neuroscience. 26 (48), 12447-12455 (2006).
  39. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1263-1270 (2000).
  40. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  41. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Patch-clamp Methods and Protocols. , 221-242 (2014).
  42. Swartzwelder, H. S., Lewis, D., Anderson, W., Wilson, W. Seizure-like events in brain slices: suppression by interictal activity. Brain Research. 410 (2), 362-366 (1987).
  43. Lees, G., Stöhr, T., Errington, A. C. Stereoselective effects of the novel anticonvulsant lacosamide against 4-AP induced epileptiform activity in rat visual cortex in vitro. Neuropharmacology. 50 (1), 98-110 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

143interictal4 APoptogeneticChR2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved