تحليلات ترانسكريبتوميك خلية واحدة من خلايا الغدد الصماء البنكرياس الماوس

Summary

يصف لنا طريقة لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة، تليها تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة. يسمح هذا الأسلوب بتحليل التنمية النسب الغدد الصماء في البنكرياس، خلية ديناميات عدم التجانس وترانسكريبتوميك.

Abstract

خلايا الغدد الصماء البنكرياس، التي تتجمع في الجزر الصغيرة، تنظيم استقرار الجلوكوز في الدم والايض الطاقة. تختلف أنواع الخلايا متميزة في الجزر الصغيرة، بما في ذلك إفراز الأنسولين خلايا بيتا، من أجداد الغدد الصماء شيوعاً أثناء المرحلة الجنينية. توسيع عن طريق انتشار الخلايا غير ناضجة من خلايا الغدد الصماء وتنضج خلال فترة إنمائية طويلة بعد الولادة. ومع ذلك، أن الآليات الكامنة وراء هذه العمليات غير محددة بوضوح. خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي نهجاً واعداً لتوصيف السكان خلية متميزة وتتبع الخلية النسب تمايز المسارات. هنا، يمكننا وصف أسلوب للجيش الملكي النيبالي-تسلسل خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس معزولة في البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة.

Introduction

البنكرياس جهاز الأيض حيوي في الثدييات. يتكون البنكرياس من المقصورات، وافرازات الغدد الصماء. خلايا الغدد الصماء البنكرياس، بما في ذلك خلايا بيتا المنتجة للأنسولين وإنتاج الجلوكاجون خلايا α، المجموعة معا في جزر لانجرهانز وكورديناتيلي تنظيم التوازن الجلوكوز الجهازية. ويؤدي الخلل في خلايا الغدد الصماء مرض البول السكري، الذي أصبح مشكلة صحية عامة رئيسية في جميع أنحاء العالم.

يتم اشتقاق خلايا الغدد الصماء في البنكرياس من Ngn3⁺ فروعه خلال embryogenesis¹. في وقت لاحق، خلال فترة ما حول الولادة، تتكاثر خلايا الغدد الصماء بشكل غير ناضجة الجزر الصغيرة. هذه الخلايا غير ناضجة مواصلة تطوير وتدريجيا تصبح جزيرات الناضجة، التي تصبح الغني vascularized لتنظيم التوازن الجلوكوز في الدم في البالغين².

على الرغم من أن قد حددت مجموعة من العوامل النسخي التي تنظم تمايز الخلايا β، مسار نضج الدقيق لخلايا بيتا لا يزال غير واضح. وعلاوة على ذلك، عملية نضج خلية بيتا ينطوي أيضا على تنظيم توسيع الخلية رقم^3،4 وتوليد التغايرية الخلوية^5،6. ومع ذلك، لم تدرس جيدا الآليات التنظيمية لهذه العمليات.

خلية واحدة-تسلسل الحمض النووي الريبي هو نهج قوية يمكن الشخصية الفئات السكانية الفرعية الخلية وتتبع الخلية النسب المسارات الإنمائية⁷. الاستفادة من هذه التكنولوجيا، مفتاح يمكن فك شفرتها الأحداث التي تحدث أثناء تطوير جزيرة البنكرياس في خلية واحدة مستوى⁸. بين البروتوكولات تسلسل الحمض النووي الريبي خلية واحدة، يسمح الذكية-seq2 جيل كامل طول كدنا مع تحسين حساسية ودقة، واستخدام الكواشف القياسية في انخفاض تكلفة⁹. ذكية-seq2 يستغرق يومين تقريبا لبناء مكتبة كدنا للتسلسل¹⁰.

هنا، نحن نقترح أسلوب لعزل الخلايا β المسمى الأسفار من البنكرياس للجنين للكبار Ins1-RFP الفئران المعدلة وراثيا¹¹، استخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، ويحلل أداء ترانسكريبتوميك في مستوى خلية واحدة، باستخدام التكنولوجيا الذكية-seq2 (الشكل 1). ويمكن تمديد هذا البروتوكول لتحليل ترانسكريبتوميس لجميع أنواع خلايا الغدد الصماء في البنكرياس في الدول العادية والمرضية والشيخوخة.

Protocol

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة بكين.

1-البنكرياس العزلة

1. للأجنة E17.5 (17.5 يوما الجنينية):
   1. ويقدر اليوم الجنينية 0.5 استناداً إلى النقطة الزمنية عندما يظهر المكونات المهبلية.
   2. التضحية الفئران الحوامل بالإدارة₂ CO. رش الفراء البطن مع الكحول 70%.
   3. جعل شق على شكل V مع مقص من توسيع المنطقة التناسلية للاضلاع. سيتم فتح هذه العملية تماما في تجويف البطن.
   4. تشريح الرحم خارج تجويف البطن ووضعه في صحن 10 سم يحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
   5. تشريح الأجنة من الرحم مع الملقط رقيقة ذات الرؤوس تحت ستيريوميكروسكوبي، إزالة الأنسجة الأخرى، مثل المشيمة والحبل السري. ضع جميع الأجنة في صحن 10 سم يحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
   6. المسيل للدموع فتح تجويف البطن للأجنة وحفر النسيج الحشوي مع ملاقط الكوع. نقل النسيج الحشوي في صحن أسود أسفل 6 سم يحتوي على برنامج تلفزيوني الباردة.
   7. يقع في أعلى اليسار جزء من البطن البنكرياس وتعلق على المعدة والطحال والعفج (الخط المنقط صفراء في الشكل 2 أ)¹². فصل في البنكرياس من النسيج الحشوي استخدام الملقط وتجميع أنسجة البنكرياس في قنينة 20 مل يحتوي على 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل: كولاجيناز 0.5 ملغ/مل ف في عزلة المخزن المؤقت (حبس تحتوي على 10 مم حبيس، 1 مم مجكل₂ ، 5 ملم الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.4).
2. للفئران P0-P15 (0-15 يوما بعد الولادة):
   1. التضحية وإصلاح الماوس بالتقيد بأطرافه إلى قطعة من حامي benchtop مع الشريط. رش الفراء البطن مع الكحول 70%.
   2. فتح تجويف البطن تماما كما هو موضح في الخطوة 1-1-3. سحب الأمعاء وعلى الجانب الأيسر للماوس. سوف يعرض هذا الإجراء الفصوص الإثني عشر والمعدة والطحال البنكرياس. تشريح جميع الفصوص البنكرياس (الشكل 2)¹² وتجميع أنسجة البنكرياس في قنينة 20 مل يحتوي على 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل بعناية.
3. للفئران p18 وبطاقات مجانية-P60 (18-60 يوما بعد الولادة):
   1. إعداد الحل كولاجيناز. الحفاظ على الجليد حتى جاهزة للاستخدام.
   2. التضحية بالماوس وفتح التجويف البطني كما ذكر أعلاه (الخطوة 1.1.2 و 1.1.3).
      ملاحظة: لا تؤذي الكبد، وسوف تقلل ضغط التدفق في القناة الصفراوية أي جرح في الكبد وتقليل كفاءة التروية الخطوة التالية.
   3. قم بإزالة في الرهابه. سحب الأمعاء وعلى الجانب الأيمن من الماوس، ودفع الفصوص اليسار واليمين الآنسي الكبد لكل جانب لفضح (السهم الأبيض في الشكل 2) المرارة والقناة الصفراوية المشتركة.
   4. المشبك العفج مع زوج من المشابك السفن الصغيرة في الموضع العلوي والسفلي، المرافقة الموقع حيث يدخل القناة الصفراوية في العفج (الشكل 2D).
      ملاحظة: لا المشبك الفصوص المعدة أو الطحال البنكرياس. وسوف لا تدفق الحل كولاجيناز في الفص المعدة والطحال البنكرياس في الخطوة التالية إذا فرضت.
   5. ملء المحاقن مع 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل وإدراج إبرة ز 30 في المرارة. بدقة وسلاسة، التلاعب بالإبرة عبر القناة الصفراوية المشتركة.
   6. نتخلل البنكرياس عن طريق حقن 1 – 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل، تبعاً لحجم الماوس. ينبغي أن يكون الحقن البطيء والمستمر للحيلولة دون الانزلاق خارج مجرى الهواء الإبرة والحيلولة دون انفجار تحت ارتفاع ضغط السائل الأمعاء. اكتمال الحقن عند البنكرياس موسعة بشكل كامل.
   7. تشريح البنكرياس (الخط المنقط صفراء في 2D الشكل) خارج تجويف البطن باستخدام الملقط فورا بعد التروية. وضع الأنسجة في قنينة 20 مل يحتوي على 5 مل من محلول كولاجيناز الباردة 0.5 ملغ/مل. في حالة التعامل مع الماوس واحد أو أكثر في وقت واحد، نتخلل الفئران واحداً تلو الآخر وتجمع الأنسجة إلى حل كولاجيناز الباردة في قنينة 20 مل حتى قد تم تشريح الفئران جميع.

2-كولاجيناز الهضم وعزله جزيرة ليلى

1. مكان القنينة 20 مل يحتوي على أنسجة البنكرياس في حمام مائي 37 درجة مئوية واحتضان لمدة 3 دقيقة حجته درجة الحرارة.
2. بلطف يهز الأنبوب لآخر 3 إلى 5 دقائق. إذا هو تضخم أنسجة البنكرياس تماما، وسوف تنأى تدريجيا إلى قطع صغيرة من الأنسجة حتى أنه ينتشر أخيرا شكل موحد. ويختلف وقت الهضم اعتماداً على حجم البنكرياس وكفاءة التروية.
3. تصفية المنتج هضمها من خلال مصفاة نايلون 0.25 مم في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة. شاملة يغسل مصفاة استخدام 20 مل حقنه تحتوي على برنامج تلفزيوني المثلج.
4. للبنكرياس E17.5-P15، قم بالتخطي إلى الخطوة 3.1.
5. للبنكرياس p18 وبطاقات مجانية-P60، الطرد المركزي في 200 x ز لمدة 1 دقيقة وتجاهل المادة طافية. تعليق إعادة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني الباردة.
6. صب 5 مل تعليق الأنسجة في طبق السفلي أسود 6 سم. جزيرات البنكرياس هياكل بيضاء صغيرة، والتعاقد، درب التبانة والأنسجة أسينار بيضاء فضفاضة وشفافة. اختيار الجزر الصغيرة مع 200 ميكروليتر ماصة وتحويلها إلى 1.5 مل أنبوب يحتوي على كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني الباردة.

3-التربسين هضم أنسجة البنكرياس أو الجزر الصغيرة

1. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي على أنسجة البنكرياس أو الجزر الصغيرة في 200 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية بدون إزعاج بيليه.
2. تعليق إعادة بيليه مع 0.25% التربسين-يدتا واحتضان في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد 4 دقائق من الحضانة، نضح بلطف وأحيانا (ماصة) لمدة 1 دقيقة باستخدام 200 ميكروليتر النصائح.
   ملاحظة: للبنكرياس E17.5-P3، أضف 1 مل التربسين-يدتا. للبنكرياس P4-P15، أضف 3 مل التربسين-يدتا. للجزر الصغيرة 100-300، أضف 1 مل التربسين-يدتا. ضبط حجم الصوت يدتا التربسين وفقا لكمية الأنسجة.
3. وقف الهضم عن طريق إضافة حجم x 0.4 من مصل البقر الجنين الباردة (FBS)، ومزيج من دوامة لطيف.
4. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية دون إزعاج بيليه.
5. تعليق إعادة الخلايا مع 200 ميكروليتر الباردة نظام مراقبة الأصول الميدانية المخزن المؤقت (حبس يحتوي على 1% FBS، درجة الحموضة 7.4). نقل الخلايا إلى أنبوب 5 مل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
6. بسرعة تدور أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية للسماح بتعليق خلية لتمرير من خلال عامل التصفية لإزالة الحطام الأنسجة الكبيرة عسر الهضم. تعليق خلية مفردة في الأنبوب جاهز الآن لنظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز.

4-خلية واحدة تحلل

1. إعداد المخزن المؤقت لتحلل الخلية.
   ملاحظة: إجراء جميع التجارب تحت غطاء تعقيم الأشعة فوق البنفسجية مع الاندفاق الصفحي. ينبغي أن تكون جميع الأنابيب ولوحات ونصائح ماصة رناسي-الدناز مجاناً. إزالة التلوث من هود والماصات مع رناسي الحل بعيداً قبل الاستخدام.
   1. ذوبان الجليد الكواشف على الجليد: دنتب (10 ملم)، اليغو-dT التمهيدي (10 ميكرومترات)، واركك الأسهم الحل (01:20).
   2. تمييع اركك إلى 1:5 × 10⁵ مع المياه خالية من نوكلاس.
   3. حساب حجم المخزن المؤقت لتحلل الخلية المطلوبة. إضافة 0.1 ميكروليتر من رناسي المانع (يو 40/ميكروليتر)، ميكروليتر 1.9 من 0.2 في المائة (المجلد/المجلد) X-100 تريتون، 1 ميكروليتر دنتب وميكروليتر 1 من التمهيدي اليغو-dT ميكروليتر 0.05 من اركك المخفف لوحدة تخزين نهائي من ميكروليتر 4.05 لكل خلية.
   4. قاسمة المخزن المؤقت تحلل الخلية في أنابيب PCR 8-شريطية رقيقة الجدار 0.2 مل أو لوحات 96-جيدا. الطرد المركزي في أنابيب أو لوحات لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: الطرد المركزي أنابيب PCR 8-شريطية رقيقة الجدار 0.2 مل في 7500 x ز ولوحات 96-جيدا في 800 x ز في الخطوات التالية.
2. انتقاء خلية واحدة وتحلل.
   1. يدوياً اختيار نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز الخلايا Ins1-طلب تقديم العروض⁺ واحدة في المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية في أنابيب PCR 8-قطاع استخدام من 30-40 ميكرون ماصة شعرية، أو مباشرة فرز الخلايا المفردة Ins1-طلب تقديم العروض⁺ إلى لوحات 96-جيدا. وحدة التخزين التي تحتوي على خلية واحدة يعتبر أقل من 0.3 ميكروليتر.
      ملاحظة: استخدام مبعثر الأمام مقابل الطول (منتدى التعاون الأمني-H) إلى الأمام مبعثر منطقة استراتيجية التمييز يبنوا النابضة (منتدى التعاون الأمني-أ)، مقابل منتدى التعاون الأمني-ح الجانب المجال مبعثر (SSC-أ) للحطام والأسفار النابضة لفرز الخلايا (الشكل 3A-3C) Ins1-طلب تقديم العروض⁺ . لتحديد أسلوب الانتقاء، فرز الخلايا الهدف في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 300 ميكروليتر نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة. التركيز النهائي المناسب 5-10 خلية/ميكروليتر. ضبط حجم المخزن المؤقت وفقا لذلك. لطريقة جمع صفيحة، فرز خلية واحدة في كل بئر من صفيحة 96-جيدا عقب المختصر للصك. ^{7 , 13}
   2. دوامة الأنابيب أو لوحات الخلايا والإفراج عن الجيش الملكي النيبالي. الطرد المركزي في أنابيب أو لوحات لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية وعلى الفور مكان لهم على الجليد.
      ملاحظة: يمكن تخزين الخلايا في-80 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.

5-خلية واحدة كدنا التضخيم

1. عكس النسخ (RT).
   1. ذوبان الجليد الكواشف RT (الجدول 1) على الجليد.
   2. احتضان هذه العينات في 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق وفورا على أنابيب أو لوحات على الجليد على الأقل 1 دقيقة بإيجاز الطرد المركزي أنابيب أو لوحات لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدم cycler حرارية مع غطاء 105 مئوية ساخنة لجميع إينكوبيشنز.
   3. إعداد مزيج RT لجميع ردود الفعل، كما هو موضح في الجدول 1.
   4. الاستغناء عن 5.7 ميكروليتر من مزيج RT لكل عينة إحضار وحدة التخزين لما مجموعة 10 ميكروليتر. بلطف دوامة المزيج والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
   5. وضع العينات في cycler حرارية وبدء برنامج RT على النحو التالي: 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، 10 دورات (50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة، 42 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة)، 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
2. بكر قبل التضخيم.
   1. ذوبان الجليد الكواشف بكر (الجدول 2) على الجليد.
   2. إعداد مزيج PCR لجميع ردود الفعل، كما هو موضح في الجدول 2.
   3. الاستغناء عن 15 ميكروليتر من مزيج PCR لكل عينة، والذي يحتوي على ردود الفعل الأولى-حبلا. بلطف دوامة المزيج والطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 4 درجات مئوية.
   4. وضع العينات في cycler حرارية والبدء في البرنامج التالي PCR: 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، دورات 18 (98 درجة مئوية 20 s، 67 درجة مئوية لمدة 15 ق، 72 درجة مئوية لمدة 6 دقائق)، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يمكن تخزين المنتج بكر عند 4 درجة مئوية لمدة أقل من أسبوع واحد أو في-20 درجة مئوية/-80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
3. تنقية PCR.
   1. إضافة 25 ميكروليتر من إعادة تعليق الخرز تنقية الحمض الخلوي الصبغي (س 1) لكل عينة من الخطوة السابقة ومزيج جيد من دوامة. ثم، بسرعة تدور أنبوب أو لوحات في درجة حرارة الغرفة جمع السائل ولكن تجنب تسوية الخرز.
      ملاحظة: حجته الخرز تنقية الحمض النووي لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ودوامه جيدا قبل الاستخدام.
   2. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. مكان الأنبوب أو لوحة في المناسبة المغنطيسي الوقوف حتى الحل الواضح، ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
   4. إضافة 200 ميكروليتر من الإيثانول 80% طازجة لغسل الخرز بينما في موقف المغناطيسية، واحتضان لمدة 30 ثانية، ثم بعناية إزالة وتجاهل الحل الإيثانول.
      ملاحظة: الحل الإيثانول 80% (المجلد/المجلد) ينبغي أن يكون طازج في كل مرة.
   5. كرر الخطوة 5.3.4 لإجمالي يغسل اثنين.
   6. بعناية إزالة وتجاهل الباقي الحل الإيثانول والهواء الجاف الخرز بينما الأنبوب أو لوحة على الوقوف المغناطيسية.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز لضمان الكفاءة القصوى شطف.
   7. إضافة ميكروليتر 11 من المياه خالية من نوكلاس الوت الهدف الحمض النووي من الخرز ومزيج جيد من دوامة. ثم سرعان ما تدور أنبوب أو لوحة ووضعه في موقف مغناطيسي حتى الحل الواضح. نقل 10 ميكروليتر من العينة إلى أنبوب بكر جديدة.
      ملاحظة: في حالة وجود dimers بعد جولة واحدة من تنقية، استناداً إلى الكشف عن توزيع حجم كدنا، تنقية مرة أخرى لإزالة dimers تماما. يمكن أن تؤثر dimers حساب العائد كدنا إذا سمح لهم بالبقاء في العينة.
4. فحص الجودة من كدنا.
   1. اختيار العينات للكشف عن العائد الإجمالي كدنا استخدام fluorometer عشوائياً.
   2. تقييم مستويات التعبير الجيني علامة طريق PCR الوقت الحقيقي (qPCR) (4E الشكل). إزالة 1 ميكروليتر من العينة تمييع 40 مرة، وأداء قبكر باستخدام لوحة 384-جيدا. إعداد مزيج قبكر كما هو موضح في الجدول 3. شروط ركوب: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، دورات 45 (95 درجة مئوية لمدة 10 s، 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 15 s).
   3. اختيار العينات للكشف عن حجم التوزيع باستخدام أداة التفريد شعرية موازية عشوائياً.

6-كدنا بناء المكتبة

1. تاجمينتيشن رد فعل ترانسبوساسي Tn5.
   1. كشف كدنا عائد إجمالي الخلايا qPCR مختارة من الخطوة 5.4.2 استخدام فلوروميتير. استخدام 2 نانوغرام من كدنا كمادة البدء.
   2. ذوبان الجليد الكواشف رد فعل تاجمينتيشن (الجدول 4) على الجليد.
   3. إعداد رد فعل تاجمينتيشن في أنبوب بكر 8-شريطية رقيقة جدار 0.2 مل، كما هو موضح في الجدول 4، ومزيج دقيق من دوامة. ثم، تدور بسرعة إلى أسفل الحل في درجة حرارة الغرفة.
   4. احتضان هذه العينات في 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وعقد في 4 درجات مئوية.
   5. فورا إضافة 2 ميكروليتر من 5 x الملخص لكل عينة تحتوي على تاجمينتيد الحمض النووي لوقف رد الفعل. مزيج دقيق من دوامة، ومن ثم تدور بسرعة إلى أسفل الحل في درجة حرارة الغرفة.
   6. احتضان هذا الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ينبغي معالجة الحمض النووي لتخصيب اليورانيوم نهائياً PCR فورا.
2. التضخيم من محول متصلة الأجزاء.
   1. ذوبان الجليد الكواشف بكر (الجدول 5) على الجليد.
   2. إعداد مزيج PCR تخصيب اليورانيوم، كما هو موضح في الجدول 5، ومزيج دقيق من دوامة. ثم، تدور بسرعة إلى أسفل الحل في درجة حرارة الغرفة.
   3. أداء بكر باستخدام البرنامج التالي: 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 98 درجة مئوية لمدة 30 s، 8 دورات (98 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 s، 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق)، 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعقد في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: عدد الدورات يعتمد على مقدار الحمض النووي مكتبة المتوقعة.
3. تنقية PCR مع حجم التحديد.
   1. إضافة 14 ميكروليتر من إعادة تعليق الخرز تنقية الحمض النووي (0.7 x) لكل عينة من الخطوة السابقة ومزيج جيد من دوامة. ثم، بسرعة تدور الأنبوب في درجة حرارة الغرفة جمع السائل ولكن تجنب تسوية الخرز.
      ملاحظة: حجته الخرز تنقية الحمض النووي لدرجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة ودوامه جيدا قبل الاستخدام.
   2. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. وضع الأنبوب على موقفا مغناطيسي مناسب حتى يتم الحل واضح، بعناية نقل المادة طافية على شريط أنبوب جديد وتجاهل الشريط الأنبوبة السابقة.
   4. إضافة 3 ميكروليتر من إعادة تعليق الخرز تنقية الحمض النووي (0.15 x) لكل عينة في أنبوب شريطية ومزيج جيد من دوامة. ثم، بسرعة تدور الأنبوب في درجة حرارة الغرفة.
   5. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. مكان الأنبوب أو لوحة في المناسبة المغنطيسي الوقوف حتى الحل الواضح، ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
   7. إضافة 200 ميكروليتر من الإيثانول 80% طازجة لغسل الخرز بينما في موقف المغناطيسية، واحتضان لمدة 30 ثانية، ثم بعناية إزالة وتجاهل الحل الإيثانول.
      ملاحظة: الحل الإيثانول 80% (المجلد/المجلد) ينبغي أن يكون طازج في كل مرة.
   8. كرر الخطوة 6.3.7 لإجمالي يغسل اثنين.
   9. بعناية إزالة وتجاهل الباقي الحل الإيثانول والهواء الجاف الخرز بينما الأنبوب أو لوحة على الوقوف المغناطيسية.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز لضمان الكفاءة القصوى شطف.
   10. إضافة ميكروليتر 11 من المياه خالية من نوكلاس الوت الهدف الحمض النووي من الخرز ومزيج جيد من دوامة. ثم سرعان ما تدور أنبوب أو لوحة ووضعه في موقف مغناطيسي حتى الحل الواضح. نقل 10 ميكروليتر من العينة إلى خط أنبوب جديد.
4. فحص الجودة من مكتبة كدنا النهائي.
   1. قياس تركيز كل مكتبة باستخدام فلوروميتير والتحقق من توزيع حجم استخدام أداة التفريد شعرية موازية.
      ملاحظة: العائد الحمض النووي عادة ما بين 15-25 نانوغرام لكل مكتبة. الشظايا التي تتراوح بين 250 شركة بريتيش بتروليوم إلى 450 يحتفل بي بي. إذا ظلت dimers بعد تنقية، كما أكدته الاختيار توزيع حجم، تنقية مع 1 × الخرز تنقية الحمض النووي مرة أخرى.
5. تجميع مكتبة
   1. استناداً إلى حجم جزء التقريبي، تجمع كميات متساوية من الحمض النووي من كل عينة، ضمان أن أيا منها لا تحتوي على تركيبات نفس محولات N6XX و N8XX.

7. تسلسل الحمض النووي

1. موضوع المكتبات المراقب إلى 51 بي بي واحد في نهاية التسلسل باستخدام نظام تسلسل الفائق. إجراء تسلسل يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. عمق التسلسل كل خلية يقرأ حوالي 1 مليون في المتوسط⁸، مالا يقل عن 0.5 مليون يقرأ كل خلية¹⁴.

8. التحليلات المعلوماتية الحيوية

1. تقييم نوعية التسلسل والمحاذاة.
   1. تقييم جودة ما يلي التسلسل باستخدام فاستقك (v0.11.3)¹⁵ مع المعلمات التالية: "فاستقك-input_fastq output_dir-o استخراج".
   2. دمج الجينوم الماوس مع تسلسل اركك باستخدام الأمر "القط mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
   3. بناء bowtie2 (v2.2.5)¹⁶ مؤشر مع المعلمات التالية: "بناء bowtie2 mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
   4. محاذاة إلى ما يلي: استخدام tophat2 (v2.1.0)¹⁷ مع المعلمات التالية: "tophat2-س output_dir ز-gene.gtf-الترنسكربيتوم-مؤشر trans_index mm10_ERCC input_fastq".
2. قياس مستويات التعبير الجيني.
   1. يقرأ عدد معين لكل الجينات باستخدام هتسيق (v 0.6.0)¹⁸ مع المعلمات التالية: '' هتسيق-العد-أم-نقاط البيع-اللغات الرسمية لا gene.gtf accepted_hits.bam-30 > read_count.txt ''.
   2. تطبيع مستويات التعبير الجيني للنصوص كل مليون (TPM)¹⁹.
3. مراقبة الجودة للخلايا.
   1. استبعاد الخلايا التي تحتوي على أقل من 0.5 مليون القراءات المعينة أو 4,000 أقل من الجينات (TPM > 1).
      ملاحظة: يعتمد معيار الاستبعاد على أنواع الخلايا وعمق التسلسل.
   2. الاحتفاظ بالخلايا معربا عن علامات الغدد الصماء (مثلاً، Ins1 للخلايا β، فريق التنسيق العالمي للخلايا α)، واستبعاد الخلايا معربا عن علامات غير الصماء (مثلاً، Spi1 للكريات البيضاء).
4. تحليل العنصر الرئيسي (PCA)
   1. تحديد الجينات اختلافاً كبيرا حسب اركك سبايك الإضافية، كما هو موضح سابقا²⁰.
   2. إجراء التحكيم باستخدام الدالة "التحكيم" في آر حزمة²¹من فاكتومينير (v1.31.4)، مع log2(TPM + 0.1) من جينات اختلافاً كبيرا.
   3. وضع تصور لنتائج محكمة التحكيم الدائمة مع ggplot2 (v2.0.0)²².
5. هرمي التكتل.
   1. تحديد الجينات مع أحمال المكون الرئيسي (PC) أعلى باستخدام الدالة "ديمديسك" فاكتومينير (v1.31.4)²¹.
   2. القيام بتجميع التسلسل الهرمي باستخدام الدالة "heatmap.2" في جبلوتس (v3.0.1) R حزمة²³، مع log2 (TPM + 1) القيم النسبية لأجهزة الكمبيوتر عالية تحميل الجينات.

النتائج

تم تشريح البنكرياس من الفئران الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة (الشكل 2A و 2 باء). يعتمد تأثير الجهاز الهضمي للفئران الأقدم من يوم الولادة 18، على درجة التروية؛ ولذلك، الحقن هو أهم خطوة لعزله جزيرة ليلى (الشكل 2

Discussion

وفي هذا البروتوكول، أثبتنا طريقة فعالة وسهلة الاستخدام لدراسة ملامح التعبير خلية واحدة من الخلايا β البنكرياس. يمكن استخدام هذا الأسلوب لعزل خلايا الغدد الصماء من البنكرياس الأجنة والأطفال حديثي الولادة وبعد الولادة والقيام بالتحاليل ترانسكريبتوميك خلية واحدة.

أن الخطو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase P	Roche	11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Dumont #4 Forceps	Roboz	RS-4904
Dumont #5 Forceps	Roboz	RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
Stereo Microscope	Zeiss	Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope	Zeiss	Stereo Lumar V12
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD-Falcon	352235
96-Well PCR Microplate	Axygen	PCR-96-C
Silicone Sealing Mat	Axygen	AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube	Extragene	P-02X8-CF
Cell sorter	BD Biosciences	BD FACSAria
Capillary pipette	Sutter	B100-58-10
RNaseZap	Ambion	AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix	Life Technologies	4456740
Distilled water	Gibco	10977
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
dNTP mix	New England Biolabs	N0447
Recombinant RNase Inhibitor	Takara	2313
Superscript II reverse transcriptase	Invitrogen	18064-014
First-strand buffer (5x)	Invitrogen	18064-014
DTT	Invitrogen	18064-014
Betaine	Sigma-Aldrich	107-43-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Nuclease-free water	Invitrogen	AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)	KAPA Biosystems	KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads	Vazyme	N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD502	Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina	Vazyme	TD203	Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit	Advanced Analytical Technologies	DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+			138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer			1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer			1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO			5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers			5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer			5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer			5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer			5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer			5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'