Fare pankreatik endokrin hücreleri tek hücre Transcriptomic analizleri

Özet

Embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases tek hücreli RNA sıralama tarafından takip endokrin hücrelerden yalıtım için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, analizleri sağlar pankreatik endokrin lineage gelişimi, heterojen ve transcriptomic dinamikleri hücre.

Özet

Adacıklar içinde kümelenir, pankreatik endokrin hücreleri kan glikoz istikrar ve enerji metabolizmasını düzenler. Adacıkları, insülin salgılayan β hücreleri de dahil olmak üzere farklı hücre tiplerinde ortak endokrin ataları embriyonik evre sırasında farklı. Olgunlaşmamış endokrin hücreleri hücre proliferasyonu ile genişletin ve gelişimsel bir uzun postnatal dönemde olgun. Ancak, bu işlemlerin altında yatan mekanizmaları açıkça tanımlı değil. Tek hücreli RNA-sıralama farklı hücre popülasyonlarının ve izleme hücre lineage farklılaşma yollar karakterizasyonu için umut verici bir yaklaşımdır. Burada, tek hücreli RNA-sıralama izole pankreas β hücre embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases için bir yöntemi açıklanmaktadır.

Giriş

Pankreas memelilerde yaşamsal metabolik bir organdır. Pankreas endokrin ve ekzokrin bölmeleri oluşur. Pankreatik endokrin hücreleri insülin üreten hücrelerin β ve glukagon üreten α hücreleri de dahil olmak üzere, birlikte adacıkları of Langerhans küme ve coordinately sistemik glikoz homeostazı düzenler. Disfonksiyon endokrin hücreleri sonuçlar diyabet mellitus, dünya çapında bir önemli halk sağlığı sorunu haline gelmiştir.

Endokrin pankreas hücreleri Ngn3 elde edilen⁺ ataları embriyogenez¹sırasında. Daha sonra perinatal dönemde endokrin hücreleri için formu olgunlaşmamış adacıkları çoğalırlar. Bu olgunlaşmamış hücreleri devam geliştirmek ve yavaş yavaş zengin kan glikoz homeostazı yetişkin²düzenleyen skarların haline olgun adacıkları haline gelir.

Transkripsiyon faktörleri bir grup, β hücre farklılaşması düzenleyen tespit rağmen β hücrelerinin hassas olgunlaşma yolu hala belli değil. Ayrıca, β hücre olgunlaşma süreci de hücre sayı genişleme^3,4 düzenlenmesi ve hücresel heterojenite^5,6nesil içerir. Ancak, düzenleyici mekanizmaları bu süreçlerin de incelenmiştir değil.

Tek hücreli RNA-sıralama hücre altgrupları profil ve hücre lineage gelişim yolları⁷iz güçlü bir yaklaşımdır. Bu teknoloji, pankreas adacık geliştirme sırasında meydana gelen olayları tek hücre düzeyi⁸' de deşifre anahtar yararlanarak. Tek hücreli RNA-sıralama protokolleri arasında geliştirilmiş hassasiyet ve doğruluk ve daha düşük maliyet⁹standart reaktifler kullanımı tam uzunlukta cDNA nesil akıllı-seq2 sağlar. Akıllı-seq2 sıralama¹⁰için bir cDNA Kütüphanesi oluşturmak için yaklaşık iki gün alır.

Burada, floresans aktif hücre (FACS) sıralama kullanarak bir yöntem pancreases, fetal floresans etiketli β hücrelerinden yetişkin Ins1-RFP transgenik fareler¹¹, yalıtım için önerdiğimiz ve transcriptomic performans analizleri tek hücre düzeyi, akıllı-seq2 teknolojisiyle (Şekil 1). Bu iletişim kuralı tüm pankreatik endokrin hücre tiplerinin normal, patolojik ve yaşlanma Birleşik Devletleri transcriptomes analiz etmek için genişletilebilir.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Pekin Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. pankreas yalıtım

1. E17.5 (embriyonik gün 17,5) embriyo için:
   1. Embriyonik gün 0,5 vajinal tak görüntülendiğinde zaman noktası bakarak tahmin ediyoruz.
   2. Hamile fareler CO₂ yönetim tarafından kurban. Sprey % 70 alkol ile karın kürk.
   3. Genital bölge için kaburga uzanan üzerinden makasla V şeklinde bir kesi yapmak. Bu işlem tamamen karın boşluğu açılacaktır.
   4. Rahim karın boşluğu dışında incelemek ve soğuk PBS içeren bir 10 cm çanak yerleştirin.
   5. Embriyolar rahim üzerinden diğer dokular, plasenta ve göbek kordonu gibi kaldırma bir stereomicroscope altında ince uçlu forseps ile incelemek. Tüm embriyoların soğuk PBS içeren bir 10 cm tabak yerleştirin.
   6. Embriyo karın boşluğu açık gözyaşı ve dirsek cımbız ile visseral doku kazmak. Visseral doku soğuk PBS içeren 6 cm siyah-alt çanak içine aktarın.
   7. Pankreas karın sol üst köşesinde bulunur ve mide, dalak ve oniki parmak bağırsağı ( Şekil 2Asarı noktalı çizgi)¹²' ye ekler. Pancreases forseps kullanarak visseral dokusundan ayırmak ve pankreas dokusu birlikte 5 mL 0.5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi içeren 20 mL şişe havuzu: 0,5 mg/mL collagenase P yalıtım arabelleği (HBSS 10 mM HEPES, 1 mM MgCl₂ içeren 5 mM glikoz, pH 7,4).
2. P0-P15 (Doğum sonrası gün 0-15) fareler için:
   1. Kurban ve bacaklarda benchtop Koruyucu bandı ile bir parça kalarak tarafından fare düzeltmek. Sprey % 70 alkol ile karın kürk.
   2. Tamamen karın boşluğu 1.1.3. adımda açıklandığı gibi açın. Bağırsaklar dışarı ve fare sol tarafına çek. Bu yordamı pankreas, mide, duodenal ve dalak lobları harekete geçirecek. Dikkatle tüm pankreas (Şekil 2B)¹² lobları teşrih ve pankreas dokusu birlikte 5 mL 0.5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi içeren 20 mL şişe havuz.
3. P18-P60 (Doğum sonrası gün 18-60) fareler için:
   1. Collagenase çözüm hazırlamak. Buz üzerinde kullanım için hazır kadar devam et.
   2. Fare kurban ve karın boşluğu (yukarıdaki adım 1.1.2 ve 1.1.3) belirtildiği gibi açın.
      Not: karaciğer zarar vermeyin, herhangi bir yara için karaciğer safra kanalını akış basıncı azaltmak ve aşağıdaki adımı perfüzyon verimliliğini azaltmak.
   3. Xiphoid kaldırın. Dışarı ve sağ tarafa fare bağırsağı çekin ve sol ve sağ orta lob Karaciğer safra kesesi ( Şekil 2Cbeyaz ok) ve ortak safra kanalını ortaya çıkarmak için her tarafına itin.
   4. Küçük gemi Kelepçeler nerede safra kanalını duodenum (Şekil 2B) girer sitesi kanat alt ve üst konumda bir çift ile duodenum kelepçe.
      Not: pankreas gastrik veya dalak lobları kelepçe değil. Collagenase çözüm mide ve dalak lob sabitlenmiş Eğer sonraki adımda pankreasın içine akışı değil.
   5. 5 mL 0.5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi ile bir şırıngaya doldur ve 30 G iğne safra kesesi yerleştirin. Dikkatli ve düzgün, iğneyi ortak safra kanalını aracılığıyla manipüle.
   6. Pankreas 1 – 5 mL fare büyüklüğüne bağlı olarak 0,5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi enjekte edilerek sıvı. Enjeksiyon-meli var olmak yavaş ve sürekli iğne kanal dışına kaymasını önlemek için ve yüksek sıvı basınç altında patlama bağırsak önlemek için. Enjeksiyon pankreas tam olarak genişletilmiş olduğuna ne zaman tamamlanır.
   7. Pankreas ( Şekil2D sarı noktalı çizgi) hemen sonra perfüzyon forseps kullanarak karın boşluğu dışında incelemek. Doku 5 mL 0.5 mg/mL soğuk collagenase çözeltisi içeren 20 mL şişede yerleştirin. Bir kerede birden fazla fare manipüle, fareler tek tek sıvı ve tüm fareler disseke kadar 20 mL şişe soğuk collagenase çözüm içine belgili tanımlık doku havuz.

2. collagenase sindirim ve adacık yalıtım

1. 37 ° C su banyosu pankreas dokusu içeren 20 mL şişe yerleştirin ve kuluçkaya sıcaklık equilibrate 3 dakikadır.
2. Başka bir 3-5 dk için tüp hafifçe sallayın. Pankreas dokusu tamamen şişirilir, nihayet düzgün dağınık olduğunu kadar bu yavaş yavaş küçük doku parçalara ayırmak. Sindirim zaman pankreas boyutuna ve perfüzyon verimliliği bağlı olarak değişir.
3. Sindirilir ürün 0,25 mm naylon süzgeç aracılığıyla yeni bir 50 mL santrifüj tüpüne filtre. Buz gibi PBS içeren 20 mL şırınga kullanarak süzgeç iyice yıkayın.
4. E17.5-P15 pancreases için 3.1 adıma atlayın.
5. P18-P60 pancreases için vasıl 200 x g 1 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. Soğuk PBS ile doku yeniden askıya alma.
6. Doku süspansiyon 5 mL 6 cm siyah-alt çanak içine dökün. Pankreas adacıkları küçük, kompakt, Sütlü beyaz yapılar ve acinar doku gevşek ve yarı saydam beyazdır. Adacıkları 200 μL pipet ile almak ve soğuk PBS küçük bir miktar içeren bir 1,5 mL tüp içine aktarabilirsiniz.

3. tripsin sindirim pankreas dokusu veya adacıkları

1. Pankreas dokusu veya adacıkları 200 x g 4 ° C'de 1 dk. için de içeren tüp santrifüj kapasitesi ve süpernatant Pelet bozmadan atın.
2. Pelet % 0.25 tripsin-EDTA ile yeniden askıya alma ve bir 37 ° C su banyosunda kuluçkaya. Kuluçka 4 dk sonra yavaşça ve zaman zaman (pipet) 200 μL ipuçlarını kullanarak 1dk için Aspire edin.
   Not: E17.5-P3 pancreases için 1 mL tripsin-EDTA ekleyin. P4-P15 pancreases için 3 mL tripsin-EDTA ekleyin. 100-300 adacıkları için 1 mL tripsin-EDTA ekleyin. Tripsin-EDTA doku miktarına göre ses düzeyini ayarlayın.
3. Sindirim 0.4 x birim soğuk fetal Sığır serum (FBS) ekleyerek durdurmak ve nazik girdap tarafından karıştırın.
4. 4 ° C'de 3 dk 250 x g , santrifüj Süpernatant Pelet bozmadan atmak.
5. 200 μL soğuk FACS arabellek içeren hücreleri yeniden askıya alma (HBSS % 1'i içeren FBS, pH 7,4). Hücreleri bir 5 mL FACS tüp aktarın.
6. Hızlı bir şekilde hücre süspansiyon sindirilmemiş büyük doku enkaz kaldırmak için filtreden geçmek izin vermek için FACS tüp spin. Tüp tek hücre süspansiyon şimdi FACS sıralamak için hazırdır.

4. tek hücre lizis

1. Hücre lizis arabellek hazırlayın.
   Not: tüm deneylerin laminar akış ile UV sterilize örtünün altında gerçekleştirin. Bütün borular, plakalar ve pipet ipuçları RNase - meli var olmak / DNaz ücretsiz. Hood ve pipetler kullanmadan önce RNase dış saha çözümü ile dezenfekte etmek.
   1. Reaktifler buz çözme: dNTP (10 mM), oligo-dT astar (10 mikron) ve ERCC stok çözümü (1:20).
   2. ERCC 1:5 x 10 için seyreltik⁵ nükleaz ücretsiz su ile.
   3. Hücre lizis arabellek gerekli hacmi hesaplamak. RNase inhibitörü (40 U/μL), %0,2 (vol/vol) Triton X-100, 1 μL dNTP, 1 μL oligo-dT astar ve her hücre için 4,05 μL son hacmiyle seyreltilmiş ERCC 0,05 μL 1.9 μL 0.1 μL ekleyin.
   4. Aliquot 0.2 mL ince duvar 8-şerit PCR tüpleri veya 96-şey tabak hücre lizis arabelleğine. Tüpler veya tabak 30 santrifüj kapasitesi 4 ° C'de s
      Not: 0.2 mL ince duvar 8-şerit PCR tüpleri 7500 x g ve 96-şey plakaları vasıl 800 x g aşağıdaki adımlarda, santrifüj kapasitesi.
2. Tek hücreli malzeme çekme ve lizis.
   1. El ile çekme FACS FACS arabellek Ins1-RFP⁺ tek kişilik hücrelerde bir 30-40 µm kapiller pipet kullanarak 8-şerit PCR tüpler içine sıralanmış veya doğrudan Ins1-RFP⁺ tek hücreleri 96-şey kalıplara sıralamak. Tek bir hücre içeren birim daha az 0.3 μL olarak kabul edilir.
      Not: Kullanım ileri dağılım yükseklik (FSC-H) vs dağılım alanı (FSC-A) gating stratejisi tamamen ayrımcılık için ileri, FSC-H vs yan dağılım alanı (SSC-A) enkaz ve floresan Ins1-RFP⁺ hücre (Şekil 3A-3C) sıralamak için geçişi için. Malzeme çekme yöntemi için 300 μL FACS arabellek içeren bir 1,5 mL tüp içine hedef hücreleri sıralamak. Uygun son 5-10 hücreler/μL bölgedir. Arabellek sesi buna göre ayarlayın. Plaka toplama yöntemi için tek hücreli bir 96-şey plaka araç manuel takip her kuyuya sıralayın. ^{7 , 13}
   2. Girdap tüpler veya hücreleri parçalayıcı ve RNA serbest bırakmak için tabak. Tüpler veya tabak 30 santrifüj kapasitesi s 4 ° C'de ve hemen onları buza koyun.
      Not: Hücreleri-80 ° C'de bir hafta boyunca saklanır.

5. tek hücreli cDNA amplifikasyon

1. Ters transkripsiyon (RT).
   1. Buz üzerinde RT reaktifler (Tablo 1) çözülme.
   2. 3 dk 72 ° C'de örnekleri kuluçkaya ve hemen koymak borular veya en az 1 dk. buz tabakalarına kısaca tüpler veya tabak 30 santrifüj kapasitesi 4 ° C'de s
      Not: Kullanım bir termal cycler 105 ° C ısıtılmış kapak ile tüm incubations için.
   3. RT mix tüm reaksiyonlar için Tablo 1' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
   4. RT Mix 10 μL toplam için ses getirmek için her örnek için 5,7 μL dağıtmak. Yavaşça girdap karışımı ve santrifüj 30 s 4 ° C'de
   5. Örnekleri termal cycler yerleştirin ve RT programı aşağıdaki gibi başlatın: 90 dakika, 10 döngüsü (2 dk, 42 ° C için 2 dk 50 ° C), 42 ° C 15 dk ve 4 ° C'de tutmak için 70 ° C
2. PCR öncesi amplifikasyon.
   1. PCR reaktif (Tablo 2) buz çözme.
   2. PCR karışımı tüm reaksiyonlar için Tablo 2' de açıklandığı şekilde hazırlayın.
   3. İlk-strand reaksiyonları içerir her örnek için PCR karışımı 15 μL dağıtmak. Yavaşça girdap karışımı ve santrifüj 30 s 4 ° C'de
   4. Örnekleri termal cycler yerleştirin ve aşağıdaki PCR programı Başlat: 3 dk, 18 döngüleri için 98 ° C (98 ° C 20 s, 15 67 ° C s, 6 dk. 72 ° C), 5 min ve tutun 4 ° C'de 72 ° C
      Not: PCR ürünü daha az bir hafta için 4 ° C'de veya -20 ° C/-80 ° C 6 ay saklanabilir.
3. PCR arıtma.
   1. Yeniden askıya alınmış DNA arıtma boncuk (1 x) 25 μL her örnek için önceki adımı ve de tarafından girdap karışımı ekleyin. Sonra hızlı bir şekilde tüp veya tabak oda sıcaklığında sıvı toplamak ama boncuk yerleşim önlemek için spin.
      Not: DNA arıtma boncuk oda sıcaklığına 15dk ve girdap kullanmadan önce iyice Equilibrate.
   2. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
   3. Yer tüp veya uygun bir manyetik plaka kadar çözüm açıktır stand sonra dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
   4. Manyetik standında ise boncuk yıkamak için taze hazırlanmış %80 etanol 200 μL eklemek, 30 için kuluçkaya s, o zaman dikkatle kaldırmak ve etanol çözüm.
      Not: %80 (vol/vol) etanol çözüm her zaman taze hazırlanmalıdır.
   5. 5.3.4 iki yıkar toplam için yineleyin.
   6. Dikkatle kaldırmak ve kalan etanol çözüm ve hava kuru ise tüp boncuk veya manyetik kürsüye plakadır.
      Not: en fazla elüsyon verimliliği sağlamak için boncuk aşırı kurutma önlemek.
   7. 11 μL nükleaz ücretsiz su boncuk DNA hedef elute ve de gönderen vortex karışımı ekleyin. Hızlı bir şekilde, tüp veya plaka spin ve kadar çözüm açıktır manyetik bir stand üzerine koyun. 10 μL örnek için yeni bir PCR tüp aktarın.
      Not: dimer arınma cDNA boyutu dağıtım algılamayı dayalı tek bir turdan sonra varsa tekrar dimer tamamen kaldırmak için arındırmak. Dimer cDNA verim hesaplaması örnek kalmasına izin verirseniz etkileyebilir.
4. CDNA kalite kontrol.
   1. Rastgele bir yer kullanarak cDNA toplam verim algılamaya örnekleri seç.
   2. Gerçek zamanlı PCR (qPCR) (Şekil 4E) tarafından marker gen ifade düzeyini değerlendirin. 1 μL örnek 40 kez sulandırmak ve qPCR 384-şey plaka kullanarak gerçekleştirmek için kaldırın. QPCR mix Tablo 3' te açıklandığı şekilde hazırlayın. Bisiklet koşullarını: 10 min, 45 devir için 95 ° C (95 ° C 10 s, 60 ° C 15 s, 72 ° C 15 s).
   3. Rastgele bir paralel kapiler Elektroforez enstrüman kullanarak boyutu dağıtım algılamaya örnekleri seç.

6. cDNA Kütüphanesi İnşaat

1. Tn5 transposase ile Tagmentation tepki.
   1. QPCR seçili hücrelerden adım bir yer kullanarak 5.4.2 cDNA toplam verimi algılamak. CDNA Başlangıç materyali olarak kullanımı 2 ng.
   2. Buz tagmentation reaksiyon reaktifleri (Tablo 4) çözülme.
   3. Tagmentation reaksiyon 0.2 mL ince duvar 8-şerit PCR tüp içinde Tablo 4, açıklandığı gibi hazırlamak ve girdap tarafından dikkatlice karıştırın. Sonra hızlı bir şekilde çözüm oda sıcaklığında aşağı spin.
   4. Örnekleri 10 dk 55 ° C'de kuluçkaya ve 4 ° C'de tutun
   5. Hemen 5 x TS 2 μL tagmented reaksiyonu durdurmak için DNA içeren her örnek ekleyin. Gönderen vortex dikkatlice karıştırın ve sonra hızlı bir şekilde çözüm oda sıcaklığında aşağı spin.
   6. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. DNA PCR son zenginleştirme için hemen işlenebilir.
2. Bağdaştırıcı bakmaksızın parçaları amplifikasyon.
   1. PCR reaktif (Tablo 5) buz çözme.
   2. Tablo 5, açıklandığı gibi zenginleştirme PCR karışımı hazırlamak ve girdap tarafından dikkatlice karıştırın. Sonra hızlı bir şekilde çözüm oda sıcaklığında aşağı spin.
   3. PCR aşağıdaki program kullanarak gerçekleştirme: 10 min, 30 98 ° C için 72 ° C s, 8 döngüsü (98 ° C 15 s, 30 60 ° C s, 3 dk 72 ° C), 5 min ve tutun 4 ° C'de 72 ° C
      Not: Devir sayısı beklenen Kütüphane DNA miktarına bağlıdır.
3. PCR arıtma ile boyutu seçme.
   1. Yeniden askıya alınmış DNA arıtma boncuk (0.7 x) 14 μL her örnek için önceki adımı ve de tarafından girdap karışımı ekleyin. Sonra hızlı bir şekilde tüp sıvı toplamak ama boncuk yerleşim önlemek için oda sıcaklığında spin.
      Not: DNA arıtma boncuk oda sıcaklığına 15dk ve girdap kullanmadan önce iyice Equilibrate.
   2. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
   3. Kadar çözüm açıktır tüp uygun bir manyetik sandalyesine koyun, dikkatle süpernatant yeni bir tüp striptiz kulübüne transfer ve önceki tüp şerit.
   4. 3 μL yeniden askıya alınmış DNA arıtma boncuk ekleyin (0.15 x) tüp şerit ve karması girdap göre de her örnek için. Sonra hızlı bir şekilde oda sıcaklığında tüpü çevir.
   5. Oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
   6. Yer tüp veya uygun bir manyetik plaka kadar çözüm açıktır stand sonra dikkatle kaldırmak ve süpernatant.
   7. Manyetik standında ise boncuk yıkamak için taze hazırlanmış %80 etanol 200 μL eklemek, 30 için kuluçkaya s, o zaman dikkatle kaldırmak ve etanol çözüm.
      Not: %80 (vol/vol) etanol çözüm her zaman taze hazırlanmalıdır.
   8. 6.3.7 iki yıkar toplam için yineleyin.
   9. Dikkatle kaldırmak ve kalan etanol çözüm ve hava kuru ise tüp boncuk veya manyetik kürsüye plakadır.
      Not: en fazla elüsyon verimliliği sağlamak için boncuk aşırı kurutma önlemek.
   10. 11 μL nükleaz ücretsiz su boncuk DNA hedef elute ve de gönderen vortex karışımı ekleyin. Hızlı bir şekilde, tüp veya plaka spin ve kadar çözüm açıktır manyetik bir stand üzerine koyun. 10 μL örnek için yeni bir tüp şerit aktarın.
4. Kalite kontrol son cDNA Kütüphanesi.
   1. Her kitaplık bir yer kullanarak konsantrasyonu ölçmek ve paralel kapiler Elektroforez enstrüman kullanarak boyutu dağıtım kontrol edin.
      Not: DNA verim her kitaplık için 15-25 ng genellikle arasındadır. 250 arasında değişen parçaları 450 bp bp görülmektedir. 1 x DNA arıtma boncuk dimer boyutu dağıtım denetimi tarafından onaylandı olarak arıtma sonra kalırsa, bir kez daha arındırmak.
5. Kütüphane havuzu oluşturma
   1. Yaklaşık parçası, DNA havuzu eşit miktarda hiç biri N6XX ve N8XX bağdaştırıcıları aynı kombinasyonları içeren sağlamak her örnekten temel.

7. DNA sıralama

1. Konu barkodlu kütüphaneleri yüksek üretilen iş sıralama sistemi kullanılarak 51 bp tek taraflı kenar sıralama için. Üreticinin iletişim kuralı aşağıdaki sıralama gerçekleştirir. Sıralama her hücrenin yaklaşık 1 milyon Ortalama⁸, en az 0,5 milyon hücre¹⁴başı okur okur derinliğidir.

8. Biyoinformatik Analizi

1. Kalite değerlendirme ve hizalama sıralanıyor.
   1. FastQC (v0.11.3)¹⁵ kullanarak aşağıdaki parametreleri ile sıralı okuma kalitesini değerlendirmek: "fastqc--özü -o output_dir input_fastq".
   2. Fare genom komutunu kullanarak ERCC dizileri ile birleştirme "mm10.fa ERCC.fa kedi > mm10_ERCC.fa".
   3. Bowtie2 yapı (v2.2.5)¹⁶ dizin aşağıdaki parametrelerle: "bowtie2-yapı mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
   4. Tophat2 kullanarak okuma hizalamak (v2.1.0)¹⁷ aşağıdaki parametrelerle: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf--transcriptome-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
2. Gen ifade düzeylerini ölçmek.
   1. Eşlenen sayısı okur HTSeq (v 0.6.0)¹⁸ ile aşağıdaki parametreleri kullanarak her gen için: '' htseq-saymak - f bam - r pos -s - bir 30 accepted_hits.bam gene.gtf > read_count.txt''.
   2. Transkript milyon (TPM)¹⁹başına gen ifade düzeylere normalleştirmek.
3. Kalite kontrol hücre.
   1. Az 0.5 milyon eşlenen okuma veya daha az 4.000 genleri içeren hücreleri dışlamak (TPM > 1).
      Not: hücre tipleri ve sıra derinliği dışlama ölçütü bağlıdır.
   2. Endokrin işaretleri (Örneğin, Ins1 β hücrelerinin, Gcg α hücreler için) ifade hücreleri korumak ve endokrin işaretleri (Örneğin, Spi1 için lökosit) ifade hücreleri hariç.
4. Asıl bileşen analizi (PCA)
   1. Son derece değişken gen ERCC spike-ins göre yukarıda açıklanan²⁰tanımlayın.
   2. PCA r "PCA" ile FactoMineR (v1.31.4)²¹, paket işlevini kullanarak gerçekleştirmek log2(TPM + 0.1) son derece değişken gen.
   3. Ggplot2 PCA sonuçlarla görselleştirmek (v2.0.0)²².
5. Hiyerarşik kümeleme.
   1. Genler "dimdesc" işlevi FactoMineR (v1.31.4)²¹kullanılarak en yüksek temel bileşeni (PC) yükleri ile tanımlayın.
   2. Hiyerarşik kümeleme işlevi "heatmap.2" R paket gplots (v3.0.1)²³, log2 ile kullanarak gerçekleştirmek (TPM + 1) göreli değerler yüksek PC genler yükleniyor.

Sonuçlar

Pancreases embriyonik, yenidoğan ve postnatal fareler disseke (Şekil 2A ve 2B). Doğum sonrası gün 18 büyük fareler için sindirim etkisi perfüzyon derecesine bağlıdır; Bu nedenle, enjeksiyon adacık yalıtım için en önemli adımdır (Şekil 2C-2E ve Tablo 6). Kadar collagenase pankreas bu adımı sırasında doldurmak mümkün olduğu kadar enjekte...

Tartışmalar

Bu protokol için tek hücreli ifade profilleri pankreas β hücrelerinin eğitim için etkili ve kullanımı kolay bir yöntemi gösterdi. Bu yöntem embriyonik, yenidoğan ve postnatal pancreases endokrin hücrelerden izole etmek ve tek hücreli transcriptomic analizleri gerçekleştirmek için kullanılabilir.

En önemli adım tek β hücrelerinin yalıtım iyi durumda değil. Tam derin pancreases daha iyi sonraki sindirim için cevap. Genellikle dorsal pankreasta oluşur, yetersiz perfüzy...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase P	Roche	11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Dumont #4 Forceps	Roboz	RS-4904
Dumont #5 Forceps	Roboz	RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
Stereo Microscope	Zeiss	Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope	Zeiss	Stereo Lumar V12
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD-Falcon	352235
96-Well PCR Microplate	Axygen	PCR-96-C
Silicone Sealing Mat	Axygen	AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube	Extragene	P-02X8-CF
Cell sorter	BD Biosciences	BD FACSAria
Capillary pipette	Sutter	B100-58-10
RNaseZap	Ambion	AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix	Life Technologies	4456740
Distilled water	Gibco	10977
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
dNTP mix	New England Biolabs	N0447
Recombinant RNase Inhibitor	Takara	2313
Superscript II reverse transcriptase	Invitrogen	18064-014
First-strand buffer (5x)	Invitrogen	18064-014
DTT	Invitrogen	18064-014
Betaine	Sigma-Aldrich	107-43-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Nuclease-free water	Invitrogen	AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)	KAPA Biosystems	KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads	Vazyme	N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD502	Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina	Vazyme	TD203	Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit	Advanced Analytical Technologies	DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+			138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer			1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer			1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO			5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers			5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer			5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer			5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer			5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer			5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'