小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞 Transcriptomic 分析

摘要

我们描述了一种方法, 从胚胎, 新生儿和产后胰腺的内分泌细胞分离, 其次是单细胞 RNA 测序。这种方法可以分析胰腺内分泌谱系的发展, 细胞异质性和 transcriptomic 动力学。

摘要

胰腺内分泌细胞聚集在胰岛, 调节血糖稳定性和能量代谢。胰岛细胞的不同类型, 包括胰岛素分泌β细胞, 在胚胎阶段与常见的内分泌祖先分化。未成熟的内分泌细胞通过细胞增殖和成熟在长时间的产后发育期内扩张。然而, 这些进程所依据的机制并没有明确界定。单细胞 RNA 测序是一种很有希望的方法来表征不同的细胞种群和追踪细胞谱系分化途径。在这里, 我们描述了从胚胎, 新生儿和产后胰腺分离的胰β细胞单细胞 RNA 序列的方法。

引言

胰腺是哺乳动物重要的代谢器官。胰腺由内分泌和外分泌的隔间组成。胰腺内分泌细胞, 包括产生胰岛素的β细胞和胰高血糖素生成α细胞, 聚集在胰岛并协调调节系统葡萄糖稳态。内分泌细胞功能失调导致糖尿病, 这已成为世界上一个重要的公共卫生问题。

胰腺内分泌细胞在胚胎发生¹期间由 Ngn3⁺祖祖先衍生。后期, 在围产期, 内分泌细胞增殖形成未成熟的胰岛。这些不成熟的细胞继续发展, 逐渐成为成熟的胰岛, 这成为丰富的血管化调节血糖动态平衡在成人²。

虽然已经确定了一组转录因子来调节β细胞分化, 但β细胞的精确成熟途径还不清楚。此外, β细胞的成熟过程也涉及到细胞数量扩展^3,4和细胞异质性的生成^5,6。然而, 这些过程的监管机制还没有得到很好的研究。

单细胞 RNA 测序是一种强有力的方法, 可以分析细胞亚群和跟踪细胞谱系发展途径⁷。利用这一技术, 在胰岛发育过程中发生的关键事件可以在单细胞⁸级破译出来。在单细胞 RNA 测序协议中, Smart-seq2 允许生成全长 cDNA, 提高灵敏度和准确度, 并使用标准试剂降低成本⁹。Smart-seq2 大约需要两天时间来构建一个用于序列¹⁰的 cDNA 文库。

在这里, 我们提出了一种方法, 从胎儿胰腺的荧光标记β细胞分离到成年 Ins1-RFP 转基因小鼠¹¹, 使用荧光活化细胞分类 (资产管制署), 并在 transcriptomic 分析的性能单细胞水平, 使用 Smart-seq2 技术 (图 1)。该协议可推广到所有胰腺内分泌细胞类型在正常、病理和衰老状态下的 transcriptomes 分析。

研究方案

这里所描述的所有方法都已获得北京大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。

1. 胰腺隔离

1. 为 E17.5 (胚胎天 17.5) 胚胎:
   1. 估计胚胎日0.5 根据时间点时, 阴道插头出现。
   2. 通过₂的管理, 牺牲怀孕的老鼠。用70% 酒精喷雾腹部毛皮。
   3. 用剪刀从延伸到肋骨的生殖器区做一个 V 形切口。这个过程将完全打开腹腔。
   4. 解剖子宫出腹腔, 并把它放在一个10厘米的菜, 包含冷 PBS。
   5. 在显微镜下用薄尖钳解剖子宫内的胚胎, 去除其他组织, 如胎盘和脐带。将所有胚胎放置在含有冷 PBS 的10厘米盘中。
   6. 撕开胚胎的腹腔, 用肘钳挖出内脏组织。将内脏组织移植到含有冷 PBS 的6厘米黑底盘中。
   7. 胰腺位于腹部的左上半部, 附着于胃、脾脏和十二指肠 (图 2A中的黄虚线)¹²。用镊子将胰腺从内脏组织中分离出来, 将胰腺组织组合成一个20毫升的小瓶, 含有5毫升0.5 毫克/毫升的冷胶原酶溶液: 0.5 毫克/毫升胶原酶 P 在隔离缓冲 (HBSS 含10毫米 HEPES, 1 毫米氯化镁₂, 5 毫米葡萄糖, pH 值 7.4)。
2. 为 P0-P15 (产后天 0-15) 小鼠:
   1. 用胶带将四肢附着在台式保护器上, 以牺牲和修复鼠标。用70% 酒精喷雾腹部毛皮。
   2. 完全打开腹腔, 如步骤1.1.3 所述。把肠子从老鼠的左边拉出来。这一过程将暴露胰腺的十二指肠, 胃和脾脏裂片。仔细解剖胰腺的所有裂片 (图 2B)¹² , 并将胰腺组织组合成一个20毫升的小瓶, 含有5毫升的0.5 毫克/毫升冷胶原酶溶液。
3. 为 P18-P60 (产后天 18-60) 小鼠:
   1. 准备胶原酶溶液。保持冰块, 直到准备使用。
   2. 牺牲鼠标, 打开腹腔如上所述 (步骤1.1.2 和 1.1.3)。
      注意: 不要伤害肝脏, 任何伤口对肝脏会减少流压入胆管和降低灌注效率的以下步骤。
   3. 删除剑突。将肠道拉出并向右移动鼠标, 并将肝脏的左、右内侧裂片推至两侧, 以暴露胆囊 (图 2C中的白色箭头) 和普通胆总管。
   4. 用一对小容器钳夹在十二指肠的上、下位置, 在胆管进入十二指肠的部位侧侧 (图 2D)。
      注意: 不要夹住胰腺的胃或脾叶。如果夹紧, 胶原酶溶液不会流入胰腺的胃和脾叶。
   5. 用5毫升的0.5 毫克/毫升冷胶原酶溶液填充注射器, 将30克针插入胆囊。小心和顺利, 操作针通过胆总管。
   6. 灌注胰腺通过注射1–5毫升0.5 毫克/毫升冷胶原酶溶液, 取决于大小的鼠标。注射应该是缓慢和恒定的, 以防止针从导管滑出和防止肠道爆裂在高液体压力下。当胰腺完全膨胀时, 注射完成。
   7. 在灌注后立即用镊子解剖胰腺 (图 2D中的黄色虚线)。将组织放置在含有5毫升0.5 毫克/毫升冷胶原酶溶液的20毫升瓶中。如果一次操作不止一只鼠标, 灌注小鼠, 然后将这些组织放入20毫升瓶中的冷胶原酶溶液中, 直到所有的老鼠都被解剖。

2. 胶原酶消化和胰岛分离

1. 将含有胰腺组织的20毫升小瓶放入37摄氏度水浴中, 孵育3分钟以平衡温度。
2. 轻轻地摇动管子3到5分钟。如果胰腺组织完全膨胀, 它将逐渐分离成小的组织块, 直到它最终被均匀地分散。消化时间根据胰腺大小和灌注效率而变化。
3. 将所消化的产品通过0.25 毫米尼龙过滤器过滤成一个新的50毫升离心管。用装有冰冷 PBS 的20毫升注射器彻底清洗过滤器。
4. 对于 E17.5-P15 胰腺, 请跳到步骤3.1。
5. 对于 P18-P60 胰腺, 离心机在 200 x g 1 分钟, 并丢弃上清。用冷 PBS 重新悬浮组织。
6. 将5毫升的组织悬浮液倒入6厘米的黑底盘中。胰岛小, 紧凑, 乳白色结构和腺泡组织松散和半透明白色。选择胰岛与 200 ul 吸管和转移到一个1.5 毫升的管含有少量的冷 PBS。

3. 胰组织或胰岛的胰蛋白酶消化

1. 离心管含有胰腺组织或胰岛在 200 x g 1 分钟4摄氏度, 并放弃上清, 不干扰颗粒。
2. 在37°c 的水浴中, 用0.25% 胰蛋白酶-EDTA 重新悬浮颗粒, 孵育。经过4分钟的孵化, 轻轻地和偶尔吸 (吸管) 1 分钟使用 200 ul 提示。
   注: 对于 E17.5-P3 胰腺, 加入1毫升胰蛋白酶-EDTA。P4-P15 胰腺, 加入3毫升胰蛋白酶-EDTA。100-300 个胰岛, 加入1毫升胰蛋白酶-EDTA。根据组织量调整胰蛋白酶-EDTA 的体积。
3. 通过增加0.4x 体积的冷胎牛血清 (血清), 并通过柔和的漩涡混合, 停止消化。
4. 离心机在 250 x g 3 分钟在4摄氏度。在不干扰球团的情况下丢弃上清液。
5. 用 200 ul 冷的 HBSS 缓冲器 (含有1% 的血清, pH 7.4) 重新悬浮细胞。将细胞转移到5毫升的流式管。
6. 快速旋转转管, 使细胞悬浮通过过滤器去除未消化的大组织碎片。管中的单细胞悬浮液现在已经准备好进行分类。

4. 单细胞裂解

1. 准备细胞裂解缓冲液。
   注: 在带层流的紫外线灭菌罩下进行所有实验。所有的管, 板和吸管的提示应 RNase-/DNase 免费。使用前, 用 RNase 离开溶液来清除罩和吸管。
   1. 解冻在冰上的试剂: dNTP (10 毫米), 寡聚 dT 底漆 (10 微米), 和 ERCC 的库存解决方案 (1:20)。
   2. 将 ERCC 稀释至 1:5 x 10⁵ , 核酸酶无水。
   3. 计算所需的细胞裂解缓冲容积。添加 0.1 ul 的 RNase 抑制剂 (40 U/ul), 1.9 ul 0.2% (卷/卷) 海卫 X-100, 1 ul 的 dNTP, 1 ul 的寡 dT 底漆, 和 0.05 ul 稀释 ERCC 到最后量 4.05 ul 为每个细胞。
   4. 将细胞裂解缓冲液整除0.2 毫升薄壁8条带 PCR 管或96井板。离心管或板材为三十年代在4°c。
      注: 离心机0.2 毫升薄壁8条带 PCR 管在 7500 x g 和96井板在 800 x g 在以下步骤。
2. 单细胞采摘和裂解。
   1. 使用30–40µm 毛细管吸管, 手动选取将 Ins1-RFP⁺单细胞转化为8条带 PCR 管, 或直接将 Ins1-RFP⁺单细胞分类为96井板。包含单个单元格的卷被视为少于 0.3 ul。
      注: 使用正向散射高度 (fsc h) 与前向散射区 (fsc a) 的双重判别的门控策略, fsc-H vs 侧散射区 (SSC) 用于 Ins1-RFP⁺单元格的碎片和荧光门 (图 3A-3C) 排序。对于拾取方法, 将目标单元格分类为1.5 毫升管, 其中包含 300 ul 的外地资产控制缓冲区。适当的最后浓度是5–10细胞/ul。相应地调整缓冲卷。对于板材的采集方法, 在仪器的说明书之后, 将单个单元分为96井板的每个井。^7,13
   2. 涡流管或板块溶解细胞并释放 RNA。离心管或板材为三十年代在4°c 并且立刻安置他们在冰。
      注: 细胞可以储存在-80 摄氏度的一个星期。

5. 单细胞 cDNA 扩增

1. 反转转录 (RT)。
   1. 在冰上解冻 RT 试剂 (表 1)。
   2. 在72摄氏度孵育样品3分钟, 然后立即将管子或盘子放在冰上至少1分钟. 简要离心机管子或板材为三十年代在4°c。
      注: 使用热循环仪与105°c 加热盖子为所有孵化。
   3. 为所有反应准备 RT 组合, 如表 1所述。
   4. 分配 5.7 ul 的 RT 混合到每个样本, 使该卷总共 10 ul。轻轻涡旋混合和离心机为三十年代在4°c。
   5. 将样品放到热循环仪中, 然后启动 RT 程序, 如下所示:42 °c 为90分钟, 10 个周期 (50 °c 为2分钟, 42 °c 为2分钟), 70 °c 为15分钟和举行在4°c。
2. PCR 预扩。
   1. 在冰上解冻 PCR 试剂 (表 2)。
   2. 为所有反应准备 PCR 组合, 如表 2所述。
   3. 分配 15 ul 的 PCR 混合到每个样本, 其中包含第一股反应。轻轻涡旋混合和离心机为三十年代在4°c。
   4. 放置样品到热循环仪和开始以下 PCR 计划:98 °c 为3分钟, 18 个周期 (98 °c 为二十年代, 67 °c 为十五年代, 72 °c 为6分钟), 72 °c 为5分钟和举行在4°c。
      注: PCR 产品可储存在4摄氏度, 不到一周或在-20 摄氏度/-80 摄氏度, 长达6月。
3. PCR 纯化。
   1. 添加 25 ul 的重新悬浮 DNA 纯化珠 (1x) 的每个样品从上一步, 并混合良好的漩涡。然后, 快速旋转管或在室温下的板, 以收集液体, 但避免解决的珠子。
      注: 平衡 DNA 净化珠至室温为15分钟, 并在使用前彻底涡流。
   2. 室温下孵育5分钟。
   3. 将管子或盘子放在适当的磁架上, 直到溶液清晰, 然后小心地除去并丢弃上清。
   4. 添加 200 ul 的新鲜准备80% 乙醇洗珠, 而在磁性的立场, 孵化三十年代, 然后小心地去除和丢弃乙醇溶液。
      注: 80% (卷/卷) 乙醇溶液应每一次新鲜准备。
   5. 重复步骤 5.3.4, 共洗两次。
   6. 小心除去和丢弃剩余的乙醇溶液, 空气干燥的珠子, 而管或板块是在磁性立场。
      注意: 避免过干燥的珠子, 以确保最大的洗脱效率。
   7. 添加 11 ul 的核酸酶水, 洗脱的 DNA 目标从珠子和混合良好的涡旋。然后, 迅速旋转的管或板, 并把它放在一个磁性的立场, 直到解决方案是明确的。将样品的 10 ul 转移到新的 PCR 管上。
      注: 如果脂肪酸在单轮纯化后存在, 则基于 cDNA 粒径分布检测, 再净化彻底去除脂肪酸。如果允许留在样品中, 脂肪酸可以影响 cDNA 的产量计算。
4. cDNA 的质量检查。
   1. 随机选择样本, 用荧光计检测 cDNA 的总产量。
   2. 应用实时 PCR (qPCR) 评价标记基因的表达水平 (图 4E)。删除 1 ul 的样品稀释40倍, 并执行 qPCR 使用384井板。如表 3所述, 准备 qPCR 组合。自行车条件:95 °c 为10分钟, 45 个周期 (95 °c 为十年代, 60 °c 为十五年代, 72 °c 为十五年代)。
   3. 采用平行毛细管电泳仪, 随机选取样品进行尺寸分布检测。

6. cDNA 文库建设

1. Tagmentation 反应由 Tn5 transposase。
   1. 用荧光计检测 qPCR 中选定细胞的 cDNA 总收率。用2的 cDNA 作为起始材料。
   2. 在冰上解冻 tagmentation 反应试剂 (表 4)。
   3. 在0.2 毫升的薄壁8条带 PCR 管中制备 tagmentation 反应, 如表 4所述, 然后用涡旋仔细混合。然后, 快速地在室温下旋转溶液。
   4. 在55摄氏度孵化样品10分钟, 并保持在4摄氏度。
   5. 立即添加 2 ul 5x TS 的每个样本包含 tagmented DNA, 以停止反应。用涡旋仔细地混合, 然后在室温下快速地旋转溶液。
   6. 在室温下孵育混合物5分钟。DNA 应立即进行最终浓缩 PCR 处理。
2. 放大适配器-结扎片段。
   1. 在冰上解冻 PCR 试剂 (表 5)。
   2. 准备浓缩 PCR 组合, 如表 5所述, 并小心地混合涡。然后, 快速地在室温下旋转溶液。
   3. 使用以下程序执行 PCR:72 °c 为10分钟, 98 °c 为三十年代, 8 个周期 (98 °c 为十五年代, 60 °c 为三十年代, 72 °c 为3分钟), 72 °c 为5分钟和举行在4°c。
      注: 周期数取决于预期的库 DNA 数量。
3. PCR 纯化与大小选择。
   1. 添加 14 ul 的重新悬浮 DNA 净化珠 (0.7 x) 的每个样品从上一步, 并混合良好的涡。然后, 快速旋转管在室温下收集的液体, 但避免解决的珠子。
      注: 平衡 DNA 净化珠至室温为15分钟, 并在使用前彻底涡流。
   2. 室温下孵育5分钟。
   3. 将管子放在适当的磁支架上, 直到溶液清晰, 小心地将上清转移到新的管条上, 然后丢弃前管条纹。
   4. 添加 3 ul 的重新悬浮 DNA 纯化珠 (0.15x) 到每个样品的管状条纹和混合良好的涡。然后, 在室温下快速旋转管子。
   5. 室温下孵育5分钟。
   6. 将管子或盘子放在适当的磁架上, 直到溶液清晰, 然后小心地除去并丢弃上清。
   7. 添加 200 ul 的新鲜准备80% 乙醇洗珠, 而在磁性的立场, 孵化三十年代, 然后小心地去除和丢弃乙醇溶液。
      注: 80% (卷/卷) 乙醇溶液应每一次新鲜准备。
   8. 重复步骤 6.3.7, 共洗两次。
   9. 小心除去和丢弃剩余的乙醇溶液, 空气干燥的珠子, 而管或板块是在磁性立场。
      注意: 避免过干燥的珠子, 以确保最大的洗脱效率。
   10. 添加 11 ul 的核酸酶水, 洗脱的 DNA 目标从珠子和混合良好的涡旋。然后, 迅速旋转的管或板, 并把它放在一个磁性的立场, 直到解决方案是明确的。将样品的 10 ul 转移到新的管条上。
4. 最终 cDNA 文库的质量检查。
   1. 使用荧光计测量每个库的浓度, 并使用平行毛细管电泳仪检查大小分布。
      注: DNA 产率通常介于每个库的15–25之间。从 250 bp 到 450 bp 的碎片将被观察到。如果脂肪酸留在纯化后, 经尺寸分布检查确认, 再用 1 x DNA 纯化珠一次提纯。
5. 库池
   1. 根据近似片段大小, 池中每个样本的 DNA 数量相等, 以确保它们中没有一个包含相同的 N6XX 和 N8XX 适配器的组合。

7. DNA 测序

1. 主题条形码库到 51 bp 单端排序使用高通量测序系统。按照制造商的协议执行排序。每个单元的测序深度平均为⁸, 每单元¹⁴的读数至少为50万读100万。

8. 生物信息学分析

1. 排序质量评估和校准。
   1. 使用 FastQC (v0.11.3)¹⁵对顺序读取的质量进行评估, 其参数如下: "FastQC--output_dir input_fastq"。
   2. 将鼠标基因组与 ERCC 序列结合使用命令 "cat mm10 ERCC. 法 > mm10_ERCC 法"。
   3. 使用以下参数生成 bowtie2 (v2.2.5)¹⁶索引: "bowtie2-build mm10_ERCC. fa mm10_ERCC"。
   4. 使用 tophat2 (v2.1.0)¹⁷与以下参数对齐读取: "tophat2 output_dir-G 基因. gtf 转录 trans_index 指数 mm10_ERCC"。
2. 量化基因表达水平。
   1. 使用 HTSeq (v 0.6.0)¹⁸对每个基因的映射读取进行计数, 其参数为: "HTSeq 计数-\r pos-s 不为 30 accepted_hits. bam 基因 gtf > read_count .txt"。
   2. 将基因表达水平正常化为每百万 (TPM)¹⁹的成绩单。
3. 细胞的质量控制。
   1. 排除少于50万个映射读数或少于4000个基因的单元格 (TPM > 1)。
      注意: 排除的标准取决于单元类型和序列深度。
   2. 保留表达内分泌标记的细胞 (例如, β细胞的 Ins1, α细胞的Gcg ), 并排除表达非内分泌标记物的细胞 (如白细胞的Spi1 )。
4. 主成分分析 (PCA)
   1. 根据 ERCC, 如前所述²⁰, 确定高度可变基因。
   2. 使用 R 包 FactoMineR (v1.31.4)²¹中的函数 "pca" 执行 pca, 具有高度可变基因的 log2 (TPM + 0.1)。
   3. 用 ggplot2 (v2.0.0)²²可视化 PCA 结果。
5. 分层聚类。
   1. 使用 "dimdesc" 函数 FactoMineR (v1.31.4)²¹确定具有最高主成分 (PC) 载荷的基因。
   2. 使用 R 封装 gplots (v3.0.1)²³中的函数 "热图 2" 执行分层聚类, 具有 log2 (TPM + 1) 高 PC 加载基因的相对值。

结果

胰腺从胚胎, 新生儿和产后小鼠 (图 2A 和2B) 进行解剖。对于18岁以上的小鼠, 消化作用取决于灌注程度;因此, 注射是胰岛隔离的最重要步骤 (图 2C-2E和表 6)。在这一步中, 尽可能多地注射胶原酶来填充胰腺。完全膨胀的胰腺如图 2D所示。如果灌注不成功 (

讨论

在本协议中, 我们展示了一种有效且易于使用的方法来研究胰β细胞的单细胞表达谱。该方法可用于分离胚胎、新生儿和产后胰腺的内分泌细胞, 并进行单细胞 transcriptomic 分析。

最关键的步骤是在良好的条件下隔离单个β细胞。充分灌注胰腺对后续消化反应较好。灌注不足, 通常发生在背胰, 将导致低胰岛产量。灌注后, 消化时间和晃动强度需要特别注意。过度消化, 由于长时间...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase P	Roche	11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Dumont #4 Forceps	Roboz	RS-4904
Dumont #5 Forceps	Roboz	RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
Stereo Microscope	Zeiss	Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope	Zeiss	Stereo Lumar V12
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD-Falcon	352235
96-Well PCR Microplate	Axygen	PCR-96-C
Silicone Sealing Mat	Axygen	AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube	Extragene	P-02X8-CF
Cell sorter	BD Biosciences	BD FACSAria
Capillary pipette	Sutter	B100-58-10
RNaseZap	Ambion	AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix	Life Technologies	4456740
Distilled water	Gibco	10977
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
dNTP mix	New England Biolabs	N0447
Recombinant RNase Inhibitor	Takara	2313
Superscript II reverse transcriptase	Invitrogen	18064-014
First-strand buffer (5x)	Invitrogen	18064-014
DTT	Invitrogen	18064-014
Betaine	Sigma-Aldrich	107-43-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Nuclease-free water	Invitrogen	AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)	KAPA Biosystems	KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads	Vazyme	N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD502	Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina	Vazyme	TD203	Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit	Advanced Analytical Technologies	DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+			138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer			1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer			1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO			5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers			5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer			5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer			5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer			5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer			5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'