Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Resumo

Nós descrevemos um método para o isolamento de células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal, seguidos por sequenciação do ARN de célula única. Esse método permite que as análises do desenvolvimento de linhagem endócrina do pâncreas, heterogeneidade e transcriptomic dinâmica de células.

Resumo

Células endócrinas no pâncreas, que são agrupadas em Ilhéus, regulam a estabilidade de glicose do sangue e metabolismo energético. Os tipos de células distintas em Ilhéus, incluindo células secretoras de insulina β, são diferenciados de progenitores endócrinas comuns durante a fase embrionária. Células endócrinas imaturas expandir através da proliferação celular e amadurecem durante um período de tempo pós-natal do desenvolvimento. No entanto, os mecanismos subjacentes a esses processos não estão claramente definidos. A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem promissora para a caracterização das populações de células distintas e vias de diferenciação de linhagem de célula rastreamento. Aqui, descrevemos um método para a célula única-a sequenciação do ARN de células β do pâncreas isolado de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal.

Introdução

O pâncreas é um órgão vital metabólico em mamíferos. O pâncreas é composto por compartimentos endócrinos e exócrinas. Células endócrinas no pâncreas, incluindo células β produtoras de insulina e glucagon-produzindo células α, cluster juntos em ilhotas de Langerhans e coordenada regulam a homeostase de glicose sistémica. Disfunção das células endócrinas resulta em diabetes mellitus, que se tornou uma questão de saúde pública em todo o mundo.

Células endócrinas do pâncreas são derivadas de Ngn3⁺ progenitores durante a embriogênese¹. Mais tarde, durante o período perinatal, as células endócrinas proliferaram para Ilhéus imaturo de formulário. Estas células imaturas continuam a desenvolver e tornar-se progressivamente ilhotas maduras, que se tornam ricamente vascularizadas regular homeostase de glicose do sangue em adultos².

Embora foi identificado um grupo de fatores de transcrição que regulam a diferenciação de células β, o caminho exato de maturação das células β é ainda incerto. Além disso, o processo de maturação de células β envolve também o Regulamento da cela número expansão^3,4 e a geração de heterogeneidade celular^5,6. No entanto, os mecanismos de regulação desses processos não foram bem estudados.

A sequenciação do ARN-célula única é uma abordagem poderosa que pode perfil subpopulações de células e rastrear celular linhagem caminhos do desenvolvimento⁷. Aproveitando esta tecnologia, a chave de eventos que ocorrem durante o desenvolvimento de ilhotas pancreáticas podem ser decifrados a célula única nível⁸. Entre os protocolos de célula única-a sequenciação do ARN, Smart-seq2 permite a geração de cDNA completo com sensibilidade melhorada e precisão e a utilização de reagentes padrão no menor custo⁹. Inteligente-seq2 leva cerca de dois dias para construir uma biblioteca de cDNA para sequenciamento¹⁰.

Aqui, propomos um método para o isolamento de células β fluorescência-etiquetada dos pancreases de fetal adulto Ins1-RFP¹¹ratos transgénicos, usando fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e o desempenho de transcriptomic analisa na nível de célula única, usando a tecnologia Smart-seq2 (Figura 1). Este protocolo pode ser estendido para analisar a transcriptomes de todos os tipos de célula endócrina do pâncreas em Estados normais, patológicos e envelhecimento.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) da Universidade de Pequim e institucional Cuidado Animal.

1. pâncreas isolamento

1. Embriões de E17.5 (dia embrionário 17,5):
   1. Estime dia embrionário 0.5 baseado no ponto de tempo, quando aparece o plug vaginal.
   2. Sacrifica os ratos grávidas pela administração de CO₂ . Pulverize a pele abdominal com álcool a 70%.
   3. Faça uma incisão em forma de V com uma tesoura da área genital, estendendo para as costelas. Este processo será completamente aberto na cavidade abdominal.
   4. Dissecar o útero fora da cavidade abdominal e coloque-o em um prato de 10 cm contendo PBS frio.
   5. Disse os embriões do útero com pinça de ponta fina sob um estereomicroscópio, remoção de outros tecidos, tais como a placenta e cordão umbilical. Coloque todos os embriões em um prato de 10 cm contendo PBS frio.
   6. Abrir a cavidade abdominal dos embriões e desenterrar o tecido visceral com uma pinça de cotovelo. Transferi o tecido visceral para uma placa de fundo preto de 6 cm contendo PBS frio.
   7. O pâncreas situa-se na parte superior esquerda do abdômen e anexa o estômago, baço e duodeno (linha amarela pontilhada na Figura 2A)¹². Desanexe os pancreases do tecido visceral usando fórceps e juntar o tecido pancreático dentro de um frasco de 20 mL contendo 5 mL da solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL: colagenase de 0,5 mg/mL P no buffer de isolamento (HBSS contendo 10 mM HEPES, 1 mM MgCl₂ 5 mM de glicose, pH 7,4).
2. Para os ratos P0-P15 (dia pós-natal 0-15):
   1. Sacrifício e corrigir o mouse aderindo os membros de um pedaço de protetor de bancada com fita. Pulverize a pele abdominal com álcool a 70%.
   2. Abra completamente a cavidade abdominal como descrito na etapa 1.1.3. Puxe o intestino para fora e para o lado esquerdo do mouse. Este procedimento irá expor os lóbulos esplênico, gástricos e duodenais do pâncreas. Cuidadosamente, dissecar todos os lóbulos do pâncreas (Figura 2B)¹² e juntar o tecido pancreático dentro de um frasco de 20 mL contendo 5 mL da solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL.
3. Para os ratos P18-P60 (18-60 dias pós-parto):
   1. Prepare a solução de colagenase. Manter em gelo até que esteja pronto para uso.
   2. Sacrificar o mouse e abrir a cavidade abdominal, como mencionado acima (passo 1.1.2 e 1.1.3).
      Nota: Não ferir o fígado, qualquer ferida no fígado irá reduzir a pressão de fluxo no ducto biliar e reduzir a eficiência de perfusão da etapa seguinte.
   3. Remova o xifoide. Puxe o intestino para fora e para o lado direito do mouse e empurre os lóbulos medial direito e esquerdos do fígado para cada lado para expor a vesícula biliar (seta branca na Figura 2) e o ducto biliar comum.
   4. Prenda o duodeno com um par de pinças de pequeno vaso na posição superior e inferior, flanqueando o site onde o ducto biliar entra no duodeno (Figura 2D).
      Nota: Não fixe os lóbulos gástricos ou esplênico do pâncreas. A solução de colagenase não fluirá para o lobo gástrico e esplênico do pâncreas na próxima etapa se pinçada.
   5. Encher uma seringa com 5 mL de solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL e inserir uma agulha 30G na vesícula biliar. Cuidadosamente e suavemente, manipule a agulha através do ducto biliar comum.
   6. Perfundir o pâncreas através da injeção de 1 a 5 mL de solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL, dependendo do tamanho do mouse. A injeção deve ser lenta e constante para evitar que a agulha deslizando para fora do duto e impedir que o intestino estourando sob alta pressão de líquido. A injeção é completa quando o pâncreas é totalmente expandido.
   7. Disse o pâncreas (amarelo linha pontilhada na Figura 2D) fora da cavidade abdominal usando fórceps imediatamente após a perfusão. Coloque o tecido em um frasco de 20 mL contendo 5 mL da solução de colagenase frio de 0,5 mg/mL. Se manipular mais de um rato de cada vez, perfundir os ratos um por um e juntar os tecidos em solução fria de colagenase em um frasco de 20 mL até todos os mouses têm sido dissecados.

2. colagenase digestão e isolamento ilhéu

1. Coloque o frasco de 20 mL contendo o tecido pancreático em banho maria a 37 ° C e incube por 3 min equilibrar a temperatura.
2. Agite o tubo por outro 3 a 5 min. Se o tecido pancreático é totalmente inflado, gradualmente vou apartar em pedaços pequenos de tecido até que finalmente se dispersa uniformemente. O tempo de digestão varia dependendo do tamanho do pâncreas e a eficiência de perfusão.
3. Filtre o produto digerido através de um filtro de nylon 0,25 mm para um novo tubo de centrifugação de 50 mL. Lave completamente o filtro usando uma seringa de 20 mL contendo PBS gelado.
4. Para E17.5-P15 pancreases, pule para o passo 3.1.
5. Para P18-P60 pancreases, centrifugar a 200 x g por 1 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender o tecido com PBS frio.
6. Despeje a 5 mL de suspensão de tecido em um prato fundo preto de 6 cm. As ilhotas pancreáticas são estruturas brancas pequenas, compactas, leitosas e tecido acinares é solto e translúcido branco. Escolha ilhotas com uma pipeta de 200 μL e transferi-los para um tubo de 1,5 mL contendo uma pequena quantidade de PBS frio.

3. tripsina digestão do tecido pancreático ou ilhotas

1. Centrifugar o tubo contendo tecido pancreático ou ilhotas a 200 x g por 1 min a 4 ° C e descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
2. Ressuspender o sedimento com 0,25% do trypsin-EDTA e incubar em banho maria a 37 ° C. Após 4 minutos de incubação, suavemente e, ocasionalmente, Aspire (pipeta) por 1 min usando 200 μL de dicas.
   Nota: Para E17.5-P3 pancreases, adicione 1 mL do trypsin-EDTA. Para P4-P15 pancreases, adicione 3 mL do trypsin-EDTA. Para 100-300 ilhotas, adicione 1 mL do trypsin-EDTA. Ajuste o volume da tripsina-EDTA, de acordo com a quantidade de tecido.
3. Parar a digestão adicionando volume de 0,4 x de frio de soro fetal bovino (FBS) e misture por suave vórtice.
4. Centrifugar a 250 x g por 3 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
5. Ressuspender as células com 200 μL frio FACS o buffer (HBSS contendo 1% FBS, pH 7,4). Transfira as células para um tubo de 5 mL FACS.
6. Rapidamente gire o tubo de FACS para permitir a suspensão de células para passar através do filtro para remover os restos de tecido grande não digerido. A suspensão de célula única no tubo está agora pronta para classificação de FACS.

4. single-cell Lysis

1. Prepare o tampão de lise celular.
   Nota: Execute todas as experiências sob uma capa de UV-esterilizados com fluxo laminar. Todos os tubos, chapas e pontas de pipetas devem ser RNase- / livre de DNase. Descontaminar o capô e pipetas com solução fora de RNase antes do uso.
   1. Descongele os reagentes no gelo: dNTP (10 mM), oligo-dT primeira demão (10 μM) e ERCC estoque solução (01:20).
   2. Diluir o ERCC a 1:5 x 10⁵ com água livre de nuclease.
   3. Calcule o volume de tampão de lise celular necessária. Adicione 0,1 μL de inibidor de RNase (40 U/μL), 1.9 μL de 0,2% (vol/vol) Triton X-100, 1 μL de dNTP, 1 μL de primer oligo-dT e 0,05 μL do ERCC diluído até um volume final de 4,05 μL de cada célula.
   4. Alíquota da lise celular em 0,2 mL parede fina listra-8 PCR tubos ou placas de 96 poços. Centrifugar os tubos ou placas por 30 s a 4 ° C.
      Nota: 0,2 mL parede fina listra-8 PCR tubos de centrifuga em 7500 x g e placas de 96 poços a 800 x g nas etapas a seguir.
2. Célula única colheita e Lise.
   1. Escolha FACS classificados células únicas Ins1-RFP⁺ no buffer de FACS em 8-tira da polimerase usando uma pipeta capilar µm de 30 – 40, ou manualmente diretamente classificar células únicas Ins1-RFP⁺ em placas de 96 poços. O volume que contém uma única célula é considerado menos de 0.3 μL.
      Nota: Uso frente dispersão altura (FSC-H) vs encaminhar área de dispersão (FSC-A) estratégia associada para a discriminação de gibão, FSC-H vs lado a área de dispersão (SSC-A) para resíduos e retenção de fluorescência para classificação de célula (Figura 3A-3C)⁺ Ins1-RFP. Para o método de colheita, classificar as células de destino em um tubo de 1,5 mL contendo 300 μL FACS buffer. A concentração final adequada é de 5 – 10 células/μL. Ajuste o volume de reserva de acordo. Para o método de coleta de placa, classificar uma única célula em cada poço de uma placa de 96 poços, seguindo o manual do instrumento. ^{7 , 13}
   2. Vórtice de tubos ou placas para lisar as células e liberar o RNA. Centrifugar os tubos ou placas por 30 s a 4 ° C e imediatamente colocá-los no gelo.
      Nota: As células podem ser armazenadas a-80 ° C durante uma semana.

5. célula única cDNA amplificação

1. Transcrição reversa (RT).
   1. Descongele os reagentes RT (tabela 1) no gelo.
   2. Incubar as amostras a 72 ° C por 3 min e colocar imediatamente os tubos ou placas no gelo pelo menos 1 min. brevemente centrifugar os tubos ou placas por 30 s a 4 ° C.
      Nota: Use um termociclador com uma tampa de 105 ° C aquecida para incubação do todo.
   3. Prepare a mistura de RT para todas as reações, conforme descrito na tabela 1.
   4. Dispense a 5.7 μL de mistura de RT para cada amostra para trazer o volume para um total de 10 μL. Delicadamente a mistura de vórtice e centrifugar por 30 s a 4 ° C.
   5. Colocar as amostras em um termociclador e iniciar o programa de RT da seguinte forma: 42 ° C por 90 min, 10 ciclos (50 ° C por 2 min, 42 ° C por 2 min), 70 ° C durante 15 min e espera a 4 ° C.
2. Pré-amplificação por PCR.
   1. Descongele os reagentes PCR (tabela 2) no gelo.
   2. Prepare a mistura PCR para todas as reações, conforme descrito na tabela 2.
   3. Dispense 15 μL de mistura PCR para cada amostra, que contém as reações da primeira vertente. Delicadamente a mistura de vórtice e centrifugar por 30 s a 4 ° C.
   4. Colocar as amostras em um termociclador e iniciar o seguinte programa de PCR: 98 ° C por 3 min, 18 ciclos (98 ° C por 20 s, 67 ° C por 15 s, 72 ° C por 6 min), 72 ° C por 5 min e espera a 4 ° C.
      Nota: O produto do PCR pode ser armazenado a 4 ° C para menos de uma semana ou a-20 ° C /-80 ° C por até 6 meses.
3. Purificação do PCR.
   1. Adicione 25 μL de grânulos de purificação de DNA re-suspensos (1x) para cada amostra do passo anterior e mistura bem pelo vórtice. Em seguida, rapidamente gire o tubo ou placas à temperatura ambiente para coletar o líquido, mas evitar a liquidação de contas.
      Nota: Equilibrar grânulos de purificação de DNA à temperatura ambiente por 15 min e vórtice cuidadosamente antes de usar.
   2. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
   3. Lugar do tubo ou placa magnética em um apropriado ficar até que a solução é clara, em seguida, Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
   4. Adicionar 200 μL de etanol a 80% recentemente preparada para lavar os grânulos enquanto no suporte magnético, incube durante 30 s, então cuidadosamente remova e descarte a solução de etanol.
      Nota: A solução de etanol 80% (vol/vol) deve ser preparada de cada vez.
   5. Repita a etapa 5.3.4 para um total de duas lavagens.
   6. Cuidadosamente remova e descarte o restante da solução de etanol e ar seco as contas enquanto o tubo ou placa é o suporte magnético.
      Nota: Evite ressecamento as contas para assegurar a eficiência máxima de eluição.
   7. Adicione 11 μL de água nuclease livre para Eluir o alvo do DNA da missanga e misture bem por vórtice. Em seguida, rapidamente girar o tubo ou a placa e colocá-lo num suporte magnético até que a solução é clara. Transferi 10 μL da amostra para um tubo novo de PCR.
      Nota: Se dímeros existirem após uma única rodada de purificação, baseada na deteção de distribuição do tamanho de cDNA, purifica novamente para remover os dímeros completamente. Os dímeros podem influenciar o cálculo de rendimento de cDNA, se permitido permanecer na amostra.
4. Verificação da qualidade do cDNA.
   1. Escolha aleatoriamente amostras para detectar o rendimento total do cDNA usando um dados.
   2. Avalie os níveis de expressão de gene marcador por PCR em tempo real (qPCR) (Figura 4E). Remova 1 μL da amostra para diluir 40 vezes e executar qPCR usando uma placa de 384. Prepare a mistura de qPCR conforme descrito na tabela 3. Condições de ciclismo: 95 ° C por 10 min, 45 ciclos (95 ° C, durante 10 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C por 15 s).
   3. Escolha aleatoriamente amostras para detectar a distribuição de tamanho usando um instrumento paralelo eletroforese capilar.

6. construção de biblioteca de cDNA

1. Reação de Tagmentation pelo transposase Tn5.
   1. Detecta o rendimento total do cDNA de qPCR-selecionado células da etapa 5.4.2 usando um dados. Uso 2 ng de cDNA como matérias-primas.
   2. Descongele os reagentes da reação tagmentation (tabela 4) no gelo.
   3. Preparar a reação de tagmentation em um tubo PCR 0,2 mL parede fina listra-8, conforme descrito na tabela 4e misturar cuidadosamente pelo vórtice. Em seguida, rapidamente spin para baixo a solução à temperatura ambiente.
   4. Incubar as amostras a 55 ° C por 10 min e manter a 4 ° C.
   5. Imediatamente adicione 2 μL de 5 x TS para cada amostra contendo o tagmented DNA para parar a reação. Misturar cuidadosamente pelo vórtice e então rapidamente spin para baixo a solução à temperatura ambiente.
   6. Incube a mistura durante 5 min à temperatura ambiente. O DNA deve ser processado imediatamente para o enriquecimento final do PCR.
2. Amplificação de fragmentos de adaptador-ligados.
   1. Descongele os reagentes PCR (tabela 5), no gelo.
   2. Prepare a mistura PCR de enriquecimento, como descrito na tabela 5e misturar cuidadosamente pelo vórtice. Em seguida, rapidamente spin para baixo a solução à temperatura ambiente.
   3. Realizar o PCR usando o seguinte programa: 72 ° C por 10 min, 98 ° C por 30 s, 8 ciclos (98 ° C por 15 s, 60 ° C por 30 s, 72 ° C por 3 min), 72 ° C por 5 min e espera a 4 ° C.
      Nota: O número de ciclos depende da quantidade de DNA de biblioteca esperado.
3. Purificação de PCR com seleção de tamanho.
   1. Adicione 14 μL de grânulos de purificação de DNA re-suspensos (0,7 x) para cada amostra da etapa anterior e mistura bem pelo vórtice. Em seguida, rapidamente gire o tubo à temperatura ambiente para coletar o líquido, mas evitar a liquidação de contas.
      Nota: Equilibrar grânulos de purificação de DNA à temperatura ambiente por 15 min e vórtice cuidadosamente antes de usar.
   2. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
   3. Colocar o tubo em um carrinho magnético apropriado até que a solução é clara, cuidadosamente transferir o sobrenadante para uma nova tira do tubo e descartar a listra de tubo anterior.
   4. Adicionar 3 μL de grânulos de purificação de DNA re-suspensos (0,15 x) para cada amostra na listra do tubo e misture bem por vórtice. Em seguida, rapidamente gire o tubo à temperatura ambiente.
   5. Incube durante 5 min à temperatura ambiente.
   6. Lugar do tubo ou placa magnética em um apropriado ficar até que a solução é clara, em seguida, Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.
   7. Adicionar 200 μL de etanol a 80% recentemente preparada para lavar os grânulos enquanto no suporte magnético, incube durante 30 s, então cuidadosamente remova e descarte a solução de etanol.
      Nota: A solução de etanol 80% (vol/vol) deve ser preparada de cada vez.
   8. Repita a etapa 6.3.7 para um total de duas lavagens.
   9. Cuidadosamente remova e descarte o restante da solução de etanol e ar seco as contas enquanto o tubo ou placa é o suporte magnético.
      Nota: Evite ressecamento as contas para assegurar a eficiência máxima de eluição.
   10. Adicione 11 μL de água nuclease livre para Eluir o alvo do DNA da missanga e misture bem por vórtice. Em seguida, rapidamente girar o tubo ou a placa e colocá-lo num suporte magnético até que a solução é clara. Transferi 10 μL da amostra para uma nova faixa de tubo.
4. Verificação da qualidade da biblioteca de cDNA final.
   1. Medir a concentração de cada biblioteca usando um dados e verificar a distribuição de tamanho usando um instrumento paralelo eletroforese capilar.
      Nota: O rendimento do ADN é normalmente entre 15-25 ng para cada biblioteca. Os fragmentos que variam de 250 bp para 450 bp será observado. Se dímeros permanecem após a purificação, como confirmado pela verificação de distribuição de tamanho, purifica com 1 x grânulos de purificação de DNA, mais uma vez.
5. Pool de biblioteca
   1. Baseado no tamanho aproximado de fragmento, quantidades iguais de pool de DNA de cada amostra, garantindo que nenhum deles contêm as mesmas combinações de adaptadores N6XX e N8XX.

7. sequenciamento de DNA

1. Bibliotecas de código de barras assunto para sequenciamento de único-extremidade 51 bp usando um sistema de sequenciamento de alto rendimento. Realize o sequenciamento seguindo o protocolo do fabricante. A profundidade de sequenciamento de cada célula é de aproximadamente 1 milhão lê em média⁸, pelo menos 0,5 milhões lê por célula¹⁴.

8. análises de bioinformática

1. Avaliação da qualidade de sequenciamento e alinhamento.
   1. Avaliar a qualidade das leituras sequenciais usando FastQC (v0.11.3)¹⁵ , com os seguintes parâmetros: "fastqc - extrato -o output_dir input_fastq".
   2. Mesclar o genoma do rato com as ERCC sequências usando o comando "cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
   3. Construir bowtie2 índice de¹⁶ (v2.2.5) com os seguintes parâmetros: "bowtie2-compilação mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
   4. Alinhar as leituras usando tophat2 (2.1.0)¹⁷ com os seguintes parâmetros: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf - transcriptoma-índice trans_index mm10_ERCC input_fastq".
2. Quantificar os níveis de expressão do gene.
   1. Contagem mapeada lê para cada gene usando HTSeq (v 0.6.0)¹⁸ com os seguintes parâmetros: ' htseq-contagem - f bam - r pos -s não - um 30 gene.gtf accepted_hits.bam > read_count.txt '.
   2. Normalize os níveis de expressão do gene para transcrições por milhão (TPM)¹⁹.
3. Controle de qualidade das células.
   1. Excluir células com menos de 0,5 milhões de leituras mapeadas ou menos de 4.000 genes (TPM > 1).
      Nota: o critério de exclusão depende os tipos de células e profundidade de sequência.
   2. Manter células expressando marcadores endócrinos (por exemplo, Ins1 para as células β, Gcg para células α) e excluir células expressando marcadores não-endócrina (por exemplo, Spi1 para leucócitos).
4. Análise de componentes principais (PCA)
   1. Identifica genes altamente variáveis de acordo com o ERCC espiga-ins, como descrito anteriormente,²⁰.
   2. Executar o PCA usando a função "PCA" no R pacote FactoMineR (v1.31.4)²¹, com log2(TPM + 0.1) de genes altamente variáveis.
   3. Visualizar os resultados da PCA com ggplot2 (v 2.0.0)²².
5. Hierárquica de clustering.
   1. Identifica os genes com as mais alta cargas de componente principal (PC) usando a função "dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)²¹.
   2. Executar a clusterização hierárquica usando a função "heatmap.2" no R pacote gplots (v 3.0.1)²³, com log2 (TPM + 1) valores relativos do PC alta carga de genes.

Resultados

Pancreases foram dissecados de ratos embrionários, Neonatais e pós-natal (Figura 2A e 2B). Para os ratos mais velhos que pós-Natal dia 18, o efeito digestivo depende do grau de perfusão; Portanto, a injeção é o passo mais importante para isolamento ilhéu (Figura 2-2E e tabela 6). Tanto colagenase foi injetado como era possível preencher o pâncreas dura...

Discussão

Neste protocolo, temos demonstrado um método eficaz e fácil de usar para estudar os perfis de expressão de célula única das células β do pâncreas. Esse método pode ser usado para isolar células endócrinas de pancreases embrionárias, Neonatais e pós-natal e realizar análises de transcriptomic de célula única.

O passo mais crítico é o isolamento das células β único em boas condições. Totalmente perfundidos pancreases respondem melhor à digestão subsequente. Insuficiente ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase P	Roche	11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Dumont #4 Forceps	Roboz	RS-4904
Dumont #5 Forceps	Roboz	RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
Stereo Microscope	Zeiss	Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope	Zeiss	Stereo Lumar V12
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD-Falcon	352235
96-Well PCR Microplate	Axygen	PCR-96-C
Silicone Sealing Mat	Axygen	AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube	Extragene	P-02X8-CF
Cell sorter	BD Biosciences	BD FACSAria
Capillary pipette	Sutter	B100-58-10
RNaseZap	Ambion	AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix	Life Technologies	4456740
Distilled water	Gibco	10977
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
dNTP mix	New England Biolabs	N0447
Recombinant RNase Inhibitor	Takara	2313
Superscript II reverse transcriptase	Invitrogen	18064-014
First-strand buffer (5x)	Invitrogen	18064-014
DTT	Invitrogen	18064-014
Betaine	Sigma-Aldrich	107-43-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Nuclease-free water	Invitrogen	AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)	KAPA Biosystems	KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads	Vazyme	N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD502	Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina	Vazyme	TD203	Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit	Advanced Analytical Technologies	DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+			138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer			1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer			1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO			5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers			5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer			5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer			5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer			5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer			5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'