Análisis transcriptómico de unicelular de células endocrinas pancreáticas de ratón

Resumen

Se describe un método para el aislamiento de las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales seguidos por la secuencia de RNA unicelular. Este método permite el análisis del desarrollo del linaje endocrino pancreático, de células dinámicas heterogeneidad y transcriptómicos.

Resumen

Las células endocrinas pancreáticas, que se agrupan en islotes, regulan la estabilidad de la glucosa sanguínea y el metabolismo energético. Los tipos de células distintos en islotes, incluyendo células β secretoras de insulina, se distinguen de los comunes progenitores endocrinos durante la fase embrionaria. Inmaduras células endocrinas amplían a través de la proliferación celular y maduran durante un periodo de desarrollo postnatal largo. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a estos procesos no están claramente definidos. Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque prometedor para la caracterización de poblaciones celulares distintas y las vías de diferenciación de seguimiento celular linaje. Aquí, describimos un método para la secuenciación del RNA unicelular de células β pancreáticas aisladas de páncreas embrionarios, neonatales y postnatales.

Introducción

El páncreas es un órgano vital metabólico en mamíferos. El páncreas está compuesto por compartimientos endocrinos y exocrinos. Las células endocrinas pancreáticas, incluyendo las células β productoras de insulina y células productoras de glucagón α, se agrupan juntos en los islotes de Langerhans y coordinadamente regulan la homeostasis de la glucosa sistémica. Resultados de la disfunción de las células endocrinas en la diabetes mellitus, que se ha convertido en un problema de salud pública importante en todo el mundo.

Las células endocrinas pancreáticas derivan de Ngn3⁺ progenitores durante embriogénesis¹. Más tarde, durante el período perinatal, las células endocrinas proliferan a islotes inmaduro forma. Estas células inmaduras continúan desarrollar y gradualmente se convierten en islotes de madurados, que se convierten en ricamente vascularizados para regular la homeostasis de la glucosa de sangre en adultos².

Aunque se ha identificado un grupo de factores transcripcionales que regulan la diferenciación de la célula β, el camino preciso de la maduración de las células β es todavía confuso. Además, el proceso de maduración de la célula β implica también la regulación de la célula número expansión^3,4 y la generación de heterogeneidad celular^5,6. Sin embargo, los mecanismos de regulación de estos procesos no han sido bien estudiados.

Sola célula secuenciación del RNA es un enfoque potente perfil subpoblaciones celulares y traza de vías del desarrollo de linaje celular⁷. Tomando ventaja de esta tecnología, la clave de los eventos que ocurren durante el desarrollo de islotes pancreáticos pueden ser descifrados en el nivel unicelular⁸. Entre los protocolos de la secuencia de RNA unicelular, Smart-Sec2 permite la generación de cDNA de larga duración con mejor sensibilidad y precisión y el uso de reactivos estándar en menor costo⁹. Smart-Sec2 tarda aproximadamente dos días para construir una biblioteca de cDNA de la secuencia¹⁰.

Aquí proponemos un método para el aislamiento de las células β marcados con fluorescencia desde el páncreas del feto adulto Ins1 RFP ratones transgénicos¹¹usando celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación, y el rendimiento de transcriptómicos analiza en el sola célula nivel, usando la tecnología Smart-Sec2 (figura 1). Este protocolo puede extenderse para analizar los transcriptomas de todos los tipos de células endocrinas pancreáticas en Estados normales, patológicos y el envejecimiento.

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de la Universidad de Pekín.

1. páncreas aislamiento

1. Para embriones E17.5 (día embrionario 17.5):
   1. Estimar embrionario día 0.5 basado en el momento cuando aparece el tapón vaginal.
   2. Sacrificar a los ratones embarazados por la administración de CO₂ . Rocíe la piel abdominal con alcohol al 70%.
   3. Haga una incisión en forma de V con tijera de la ampliación de la zona genital a las costillas. Este proceso abrirá completamente la cavidad abdominal.
   4. Disecar el útero fuera de la cavidad abdominal y colocar en un plato de 10 cm que contiene PBS frío.
   5. Diseccionar los embriones del útero con pinzas con punta fina bajo un estereomicroscopio, eliminación de otros tejidos, como la placenta y del cordón umbilical. Coloque todos los embriones en un plato de 10 cm que contiene PBS frío.
   6. Rasgar abierto la cavidad abdominal de los embriones y sacar el tejido visceral con una pinza de codo. Transferir el tejido visceral en un plato de fondo negro de 6 cm que contiene PBS frío.
   7. El páncreas está situado en la parte superior izquierda del abdomen y se conecta al estómago, el bazo y el duodeno (línea amarilla punteada en la figura 2A)¹². Separar el páncreas de los tejidos viscerales con unas pinzas y el tejido pancreático de la piscina juntos en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL: colagenasa de 0.5 mg/mL P en tampón de aislamiento (HBSS conteniendo 10 mM HEPES, 1 mM MgCl₂ 5 mM de glucosa, pH 7.4).
2. Para los ratones de la P0-P15 (día postnatal 0-15):
   1. Sacrificio y fijar el ratón adhiriendo a las extremidades a un pedazo de banco protector con cinta. Rocíe la piel abdominal con alcohol al 70%.
   2. Abrir completamente la cavidad abdominal como se describe en el paso 1.1.3. Tire el intestino hacia fuera y al lado izquierdo del ratón. Este procedimiento expone los lóbulos esplénicos, gástricos y duodenales del páncreas. Diseccionar todos los lóbulos del páncreas (figura 2B)¹² y piscina el tejido pancreático juntos en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL.
3. Para los ratones P18-P60 (día postnatal 18-60):
   1. Preparar la solución de la colagenasa. Mantenga en hielo hasta que esté listo para su uso.
   2. Sacrificar el ratón y abrir la cavidad abdominal, como se mencionó anteriormente (paso 1.1.2 y 1.1.3).
      Nota: No hacen daño al hígado, cualquier herida en el hígado se reduzca la presión de flujo en el conducto biliar y reducir la eficacia de la perfusión del siguiente paso.
   3. Retire el xifoides. Tire el intestino y a la derecha del ratón y empuje los lóbulos mediales derecho e izquierdos del hígado a cada lado para exponer la vesícula biliar (flecha blanca en la figura 2) y el conducto biliar común.
   4. Sujete el duodeno con un par de vasos de abrazaderas en la posición superior e inferior, que flanquean el sitio donde el conducto biliar entra en el duodeno (Figura 2D).
      Nota: No fije los lóbulos del páncreas gástricos o esplénicos. La solución de colagenasa no fluirá en el lóbulo gástrico y esplénico del páncreas en el paso siguiente si la sujeta.
   5. Llene una jeringa con 5 mL de 0.5 mg/mL de solución de colagenasa frío e inserte una aguja de 30 G en la vesícula biliar. Con cuidado y suavemente, manipular la aguja a través del conducto biliar común.
   6. Perfusión del páncreas mediante la inyección de 1 – 5 mL de solución fría colagenasa de 0.5 mg/mL, dependiendo del tamaño del ratón. La inyección debe ser lenta y constante para evitar que la aguja se deslice fuera del conducto y para evitar que el intestino reviente bajo alta presión de líquido. La inyección es completa cuando el páncreas se expande completamente.
   7. Diseccionar el páncreas (la línea amarilla punteada en la Figura 2D) fuera de la cavidad abdominal utilizando fórceps inmediatamente después de la perfusión. Coloque el tejido en un frasco de 20 mL que contiene 5 mL de solución de colagenasa frío 0,5 mg/mL. Si manipular más de un ratón a la vez, inundar los ratones uno por uno y los tejidos de la piscina en solución de colagenasa frío en un frasco de 20 mL hasta que todos los ratones han sido disecados.

2. colagenasa digestión y aislamiento de islotes pancreáticos

1. Coloque el frasco de 20 mL que contiene el tejido pancreático en un baño de agua de 37 ° C e incubar durante 3 minutos equilibrar la temperatura.
2. Agitar suavemente el tubo para otros 3 a 5 minutos. Si el tejido pancreático está totalmente inflado, poco a poco se disocian en pedazos pequeños de tejido hasta que finalmente se dispersa uniformemente. El tiempo de digestión varía dependiendo del tamaño del páncreas y la eficacia de la perfusión.
3. Filtrar el producto digerido a través de un filtro de nylon de 0.25 mm en un nuevo tubo de centrífuga de 50 mL. Fondo Lave el filtro usando una jeringa de 20 mL con PBS helado.
4. Para páncreas E17.5-P15, vaya al paso 3.1.
5. P18-P60 páncreas, centrifugar a 200 x g durante 1 min y descartar el sobrenadante. Vuelva a suspender el tejido con PBS frío.
6. Vierta 5 mL de la suspensión de tejido en un fondo negro 6 cm. Los islotes pancreáticos son estructuras blanco lechosas, pequeño y compactas y tejido acinar es flojo y translúcido blanco. Elegir islotes con pipeta 200 μL y transferirlos a un tubo de 1,5 mL que contiene una pequeña cantidad de PBS frío.

3. tripsina digestión de tejidos pancreáticos o islotes

1. Centrifugar el tubo que contiene el tejido pancreático o islotes a 200 x g durante 1 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante sin perturbar el pellet.
2. Resuspender el sedimento con 0.25% tripsina-EDTA e incubar en un baño de agua de 37 ° C. Después de 4 min de incubación, suavemente y de vez en cuando aspire (pipeta) durante 1 min, utilizando 200 μL puntas.
   Nota: Para el páncreas E17.5-P3, añadir 1 mL de tripsina-EDTA. Para páncreas P4-P15, añadir 3 mL de tripsina-EDTA. 100-300 islotes, añadir 1 mL de tripsina-EDTA. Ajustar el volumen de tripsina-EDTA según la cantidad de tejido.
3. Detener la digestión mediante la adición de volumen de x 0,4 de frío suero bovino fetal (FBS) y mezclar por vortex suave.
4. Centrifugar a 250 x g durante 3 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante sin perturbar el pellet.
5. Resuspender las células con tampón FACS frío de 200 μL (HBSS conteniendo 1% FBS, pH 7,4). Transferir las células a un tubo de 5 mL FACS.
6. Rápidamente gira el tubo de FACS para permitir la suspensión de células a pasar por el filtro para eliminar los restos de tejido grandes sin digerir. La suspensión de células individuales en el tubo ya está lista para la clasificación de FACS.

4. sola célula Lysis

1. Preparar el tampón de lisis celular.
   Nota: Realizar todos los experimentos bajo una campana de esterilización UV con flujo laminar. Todos los tubos, placas y puntas de pipeta deben ser Rnasa DNasa- libre. Descontamine la campana y pipetas solución lejos de Rnasa antes de su uso.
   1. Descongelar los reactivos en el hielo: dNTP (10 mM), cartilla de oligo-dT (10 μM) y ERCC stock solución (1:20).
   2. Diluir la ERCC 1:5 x 10⁵ con agua libre de nucleasa.
   3. Calcular el volumen de tampón de lisis de la célula necesitada. Agregar 0.1 μL de inhibidor de Rnasa (40 U/μL), 1.9 μL de 0.2% (vol/vol) Tritón X-100, 1 μL de dNTP, 1 μL de cebador oligo-dT y 0.05 μL de ERCC diluido a un volumen final de 4.05 μL de cada celda.
   4. Alícuota del tampón de lisis celular en tubos de PCR de 0.2 mL pared delgada 8 rayas o placas de 96 pocillos. Centrifugar los tubos o placas para 30 s a 4 ° C.
      Nota: Centrifugar tubos de PCR de 0.2 mL pared delgada raya 8 a 7500 x g y placas de 96 pocillos en 800 g de x en los siguientes pasos.
2. Sola célula cosecha y lisis.
   1. Manualmente pick FACS clasifica las células Ins1-RFP⁺ en tampón FACS en tira de 8 tubos PCR con una pipeta capilar de 30 a 40 μm, u ordenar directamente las células Ins1-RFP⁺ en placas de 96 pocillos. El volumen que contiene una sola célula se considera menos de 0,3 μL.
      Nota: Uso forward scatter (FSC-H) de altura vs avance área de scatter (FSC-A) bloquea estrategia de discriminación de doblete, FSC-H vs lado área de dispersión (SSC-A) para la ruina y fluorescencia gating Ins1-RFP⁺ celular (Figura 3A-3C) clasificación. Para el método de cosecha, clasificar las células blanco en un tubo de 1,5 mL con 300 μL tampón de FACS. La concentración final adecuada es 5-10 células/μL. Ayuste el volumen de tampón. Para el método de colección de placa, ordenar una sola celda en cada pocillo de una placa de 96 pocillos siguiendo el manual del instrumento. ^{7 , 13}
   2. Vórtex los tubos o placas para lyse las células y liberar el ARN. Centrifugar los tubos o placas para 30 s a 4 º C e inmediatamente coloca en hielo.
      Nota: Las células pueden almacenarse a-80 ° C durante una semana.

5. unicelular cDNA amplificación

1. Transcripción reversa (RT).
   1. Descongelar los reactivos de RT (tabla 1) en el hielo.
   2. Incubar las muestras a 72 ° C por 3 min y poner de inmediato los tubos o placas de hielo durante al menos 1 min brevemente Centrifugue los tubos o placas para 30 s a 4 ° C.
      Nota: Utilice un termociclador con una tapa de 105 ° C calentado para incubaciones todos.
   3. Preparar la mezcla de RT para todas las reacciones, como se describe en la tabla 1.
   4. Dispense 5.7 μL de mezcla de RT a cada muestra para llevar el volumen a un total de 10 μL. Suavemente la mezcla de vortex y centrifugar durante 30 s a 4 ° C.
   5. Coloque las muestras en un termociclador e inicia el programa de RT como sigue: 42 ° C por 90 min, 10 ciclos (50 ° C por 2 min, 42 ° C por 2 min), 70 ° C por 15 minutos y mantenga a 4 º C.
2. La amplificación por PCR.
   1. Descongelar los reactivos de PCR (tabla 2) en el hielo.
   2. Preparar la mezcla PCR para todas las reacciones, como se describe en la tabla 2.
   3. Dispensar 15 μL de la mezcla PCR para cada muestra, que contiene las reacciones de primera línea. Suavemente la mezcla de vortex y centrifugar durante 30 s a 4 ° C.
   4. Coloque las muestras en un termociclador y comenzar el siguiente programa PCR: 98 ° C por 3 min, 18 ciclos (98 ° C por 20 s, 67 ° C por 15 s, 72 ° C durante 6 min.), 72 ° C por 5 min y mantener a 4 ° C.
      Nota: El producto PCR puede almacenarse a 4 ° C durante menos de una semana o a-20 ° C /-80 ° C hasta por 6 meses.
3. Purificación de la polimerización en cadena.
   1. Añadir 25 μL de suspende de nuevo cuentas de purificación de ADN (1 x) para cada muestra del paso anterior y mezclar bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placas a temperatura ambiente para recoger el líquido, pero evite la solución de los abalorios.
      Nota: Equilibrar cuentas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 15 minutos y agitar bien antes de usar.
   2. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
   3. Lugar el tubo o placa en un magnética hasta que la solución es clara, entonces cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
   4. Añadir 200 μL de etanol de 80% recién preparado para lavar los granos mientras que en el soporte magnético, incube durante 30 s, luego retire con cuidado y deseche la solución de etanol.
      Nota: La solución de etanol 80% (vol/vol) debe estar preparada fresco cada vez.
   5. Repita el paso 5.3.4 para un total de dos lavados.
   6. Cuidadosamente retire y deseche el resto de solución de etanol y aire secan los granos mientras que el tubo o placa es en soporte magnético.
      Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos para asegurar la eficacia máxima de la elución.
   7. Añadir 11 μL de agua libre de nucleasa para eluir el destino del ADN de los granos y mezclar por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placa y colocarlo en un soporte magnético hasta que la solución es clara. Transferir 10 μL de la muestra a un nuevo tubo PCR.
      Nota: Si existen dímeros después de una sola ronda de purificación, basado en la detección de distribución de tamaño de cDNA, purificar nuevamente para eliminar totalmente los dímeros. Los dímeros pueden influir en el cálculo de la producción de cDNA si permanecen en la muestra.
4. Control de calidad del cDNA.
   1. Elegir al azar las muestras para detectar la producción total de cDNA usando un fluorómetro.
   2. Evaluar los niveles de expresión del gen marcador por PCR en tiempo real (qPCR) (figura 4E). Quitar 1 μL de la muestra y diluir 40 veces y realizar qPCR utilizando una placa de 384 pozos. Preparar la mezcla de qPCR como se describe en la tabla 3. Condiciones de ciclismo: 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos (95 ° C durante 10 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C por 15 s).
   3. Elegir al azar las muestras para detectar la distribución de tamaño utilizando un instrumento de electroforesis capilar en paralelo.

6. construcción de la biblioteca de cDNA

1. Reacción de Tagmentation por el Tn5 transposasa.
   1. Detectar el rendimiento total de cDNA de células seleccionadas de qPCR de paso 5.4.2 con un fluorómetro. Uso 2 ng de cDNA como material de partida.
   2. Descongelar los reactivos de la reacción de tagmentation (tabla 4) en el hielo.
   3. Preparar la reacción de tagmentation en un tubo PCR 0.2 mL pared delgada 8-raya, como se describe en la tabla 4y mezclar cuidadosamente en el vórtex. Luego, girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
   4. Incubar las muestras a 55 ° C durante 10 minutos y mantener a 4 ° C.
   5. Inmediatamente añadir 2 μL de TS x 5 para cada muestra que contiene el tagmented ADN para detener la reacción. Mezclar cuidadosamente por vortex y luego girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
   6. Incubar la mezcla durante 5 minutos a temperatura ambiente. El ADN debe procesarse inmediatamente para el enriquecimiento final PCR.
2. Amplificación de fragmentos de ligarse por el adaptador.
   1. Descongelar los reactivos de PCR (tabla 5) en el hielo.
   2. Preparar la mezcla PCR de enriquecimiento, como se describe en la tabla 5y mezclar cuidadosamente en el vórtex. Luego, girar rápidamente por la solución a temperatura ambiente.
   3. Llevar a cabo la polimerización en cadena con el siguiente programa: 72 ° C por 10 min, 98 ° C por 30 s, 8 ciclos (98 ° C por 15 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C por 3 min), 72 ° C por 5 min y mantener a 4 ° C.
      Nota: El número de ciclos depende de la cantidad de ADN de la biblioteca prevista.
3. Purificación de PCR con selección de tamaño.
   1. Añadir 14 μL de granos de purificación de ADN suspendidos de nuevo (x 0.7) para cada muestra del paso anterior y mezclar bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo a temperatura ambiente para recoger el líquido, pero evite la solución de los abalorios.
      Nota: Equilibrar cuentas de purificación de ADN a temperatura ambiente durante 15 minutos y agitar bien antes de usar.
   2. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
   3. Coloque el tubo sobre un soporte magnético apropiado hasta que la solución es clara, cuidadosamente transferir el sobrenadante a una nueva tira de tubo y descartar la anterior banda de tubo.
   4. Agregar 3 μL de suspende de nuevo cuentas de purificación de ADN (0.15 x) a cada muestra en la banda tubo y mezcle bien por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo a temperatura ambiente.
   5. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.
   6. Lugar el tubo o placa en un magnética hasta que la solución es clara, entonces cuidadosamente retire y descarte el sobrenadante.
   7. Añadir 200 μL de etanol de 80% recién preparado para lavar los granos mientras que en el soporte magnético, incube durante 30 s, luego retire con cuidado y deseche la solución de etanol.
      Nota: La solución de etanol 80% (vol/vol) debe estar preparada fresco cada vez.
   8. Repita el paso 6.3.7 para un total de dos lavados.
   9. Cuidadosamente retire y deseche el resto de solución de etanol y aire secan los granos mientras que el tubo o placa es en soporte magnético.
      Nota: Evitar que se sequen demasiado los granos para asegurar la eficacia máxima de la elución.
   10. Añadir 11 μL de agua libre de nucleasa para eluir el destino del ADN de los granos y mezclar por vortex. Entonces, rápidamente hacer girar el tubo o placa y colocarlo en un soporte magnético hasta que la solución es clara. Transferir 10 μL de la muestra a una banda nueva de tubo.
4. Control de calidad de la biblioteca del cDNA final.
   1. Medir la concentración de cada biblioteca con un fluorómetro y verificar la distribución de tamaño utilizando un instrumento de electroforesis capilar en paralelo.
      Nota: El rendimiento de ADN es normalmente entre 15-25 ng de cada biblioteca. Los fragmentos que van desde 250 bp a 450 bp se observará. Si dímeros permanecen después de la purificación, según lo confirmado por el control de la distribución de tamaño, purificar con 1 x granos de purificación de ADN una vez más.
5. Agrupación de biblioteca
   1. Basado en el tamaño del fragmento aproximado, de cantidades iguales de la piscina del ADN de cada muestra, asegurándose que ninguno de ellos contiene las mismas combinaciones de adaptadores N6XX y N8XX.

7. secuencia de ADN

1. Tema bibliotecas de código de barras para 51 secuencia de fin single bp utiliza un sistema de secuenciación de alto rendimiento. Realizar la secuenciación siguiendo el protocolo del fabricante. La profundidad de la secuencia de cada célula es aproximadamente 1 millón en promedio Lee⁸, Lee al menos 0,5 millones por celular¹⁴.

8. bioinformática análisis

1. Evaluación de la calidad de la secuencia y la alineación.
   1. Evaluar la calidad de la secuencia Lee con FastQC (v0.11.3)¹⁵ de los siguientes parámetros: "fastqc - extracto -o output_dir input_fastq".
   2. El genoma del ratón se funden con las secuencias de la ERCC mediante el comando "cat mm10.fa ERCC.fa > mm10_ERCC.fa".
   3. Construir bowtie2 (v2.2.5)¹⁶ índice con los siguientes parámetros: "construir bowtie2 mm10_ERCC.fa mm10_ERCC".
   4. Alinear utilizando tophat2 Lee (2.1.0)¹⁷ con los siguientes parámetros: "tophat2 -o output_dir -G gene.gtf - transcriptoma-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
2. Cuantificar los niveles de expresión génica.
   1. Lee cuenta asignada para cada gen usando HTSeq (v 0.6.0)¹⁸ con los siguientes parámetros: '' htseq-Conde - f bam - r pos -s no - a 30 gene.gtf de accepted_hits.bam > read_count.txt''.
   2. Normalizar los niveles de expresión génica de las transcripciones por millones (TPM)¹⁹.
3. Control de calidad de las células.
   1. Excluir las células con menos de 0,5 millones de lecturas asignadas o menos de 4.000 genes (TPM > 1).
      Nota: el criterio de exclusión depende de los tipos de la célula y la profundidad de la secuencia.
   2. Conservar las células que expresan marcadores endocrinos (por ejemplo, Ins1 para las células β, Gcg para células α) y excluir las células que expresan marcadores no-endocrina (e.g., Spi1 para leucocitos).
4. Análisis de componentes principales (PCA)
   1. Identificar genes altamente variables según ERCC punto-ins, como se describió anteriormente²⁰.
   2. Realizar PCA usando la función "PCA" en la R paquete FactoMineR (v1.31.4)²¹, con el log2(TPM + 0.1) de genes altamente variables.
   3. Visualizar los resultados PCA con ggplot2 (v2.0.0)²².
5. Jerárquico de agrupamiento.
   1. Identificar genes con las más altas cargas de componentes principales (PC) utilizando la función "dimdesc" FactoMineR (v1.31.4)²¹.
   2. Realizar clustering jerárquico con la función "heatmap.2" en el paquete de R gplots (v3.0.1)²³, log2 (TPM + 1) valores relativos de PC alta carga de genes.

Resultados

Se disecaron páncreas de ratones embrionarios, neonatales y postnatales (figura 2A y 2B). Para los ratones mayores de postnatal día 18, el efecto digestivo depende del grado de perfusión; por lo tanto, la inyección es el paso más importante para el aislamiento de islotes pancreáticos (figura 2-2E y tabla 6). Se inyectó tanto colagenasa como fue posible ll...

Discusión

En este protocolo, hemos demostrado un método efectivo y fácil de usar para el estudio de los perfiles de expresión de la sola célula de las células β pancreáticas. Este método podría utilizarse para aislar las células endocrinas del páncreas embrionarios, neonatales y postnatales y realizar análisis transcriptómico de unicelulares.

El paso más crítico es el aislamiento de las células β solo en buen estado. Páncreas totalmente inundadas responden mejor a la digestión subsigu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase P	Roche	11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Fetal bovine serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Dumont #4 Forceps	Roboz	RS-4904
Dumont #5 Forceps	Roboz	RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length	BD	305106
Stereo Microscope	Zeiss	Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope	Zeiss	Stereo Lumar V12
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge	Eppendorf	5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap	BD-Falcon	352235
96-Well PCR Microplate	Axygen	PCR-96-C
Silicone Sealing Mat	Axygen	AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube	Extragene	P-02X8-CF
Cell sorter	BD Biosciences	BD FACSAria
Capillary pipette	Sutter	B100-58-10
RNaseZap	Ambion	AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix	Life Technologies	4456740
Distilled water	Gibco	10977
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
dNTP mix	New England Biolabs	N0447
Recombinant RNase Inhibitor	Takara	2313
Superscript II reverse transcriptase	Invitrogen	18064-014
First-strand buffer (5x)	Invitrogen	18064-014
DTT	Invitrogen	18064-014
Betaine	Sigma-Aldrich	107-43-7
MgCl2	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Nuclease-free water	Invitrogen	AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x)	KAPA Biosystems	KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads	Vazyme	N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix	Vazyme	Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina	Vazyme	TD502	Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina	Vazyme	TD203	Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit	Advanced Analytical Technologies	DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+			138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer			1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer			1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6297
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5655
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G5767
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Oligo-dT30VN primer			5'-AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO			5'-AAGCAGTGGTATCAAC GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers			5'-AAGCAGTGGTAT CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer			5'-ATGGTGAAGGTC GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer			5'-GCCTTGACT GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer			5'-TGGCTTCTTC TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer			5'-TCTAGTTGCA GTAGTTCTCCA-3'