عزل وتحديد الخلايا المناعية اكسترافاسكولار للقلب

Summary

ويقدم هذا البروتوكول وسيلة بسيطة وفعالة عزل والتعرف على والتحديد الكمي للخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب الفئران أثناء حالة ثابتة أو التهاب. البروتوكول يجمع الهضم الأنزيمي والميكانيكية لتوليد تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها مزيد من التدفق الخلوي.

Abstract

جهاز المناعة عنصر أساسي لصحة القلب. عضلة القلب موطن لعدد سكان الأغنياء من مجموعات فرعية مختلفة من الخلية المناعية مع التقسيم الوظيفي أثناء حالة ثابتة وأشكال مختلفة من التهاب السواء. حتى وقت قريب، دراسة الخلايا المناعية في القلب المطلوب استخدام الفحص المجهري أو تحديد بروتوكولات المتقدمة سوء الهضم، التي قدمت ما يكفي حساسية أثناء التهاب حاد ولكن لم يتمكنوا من ثقة الصغيرة – لكن الرئيسية – السكان الخلايا أثناء حالة ثابتة. هنا، نحن نناقش أسلوب بسيط الجمع الانزيمية (كولاجيناز والبروتين السكري المثبط الدناز) والهضم الميكانيكي من قلوب مورين يسبقه الإدارة داخل الأوعية المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة التفريق بين الصغيرة ولكن لا مفر منه خلية داخل الأوعية الملوثات. ينشئ هذا الأسلوب تعليق خلايا قابلة للحياة المعزولة التي يمكن تحليلها بواسطة التدفق الخلوي لتحديد الهوية، فينوتيبينج والقياس الكمي، أو تنقية كذلك مع الأسفار تنشيط الخلية فرز أو فصل حبة المغناطيسي النسخي دراسات التحليل أو في المختبر . وندرج مثال لتحليل تدفق خطوة بخطوة سيتوميتريك التفريق بين مفتاح بلعم والسكان الخلايا الجذعية للقلب. لتجربة حجم متوسط (10 قلوب) يتطلب انتهاء الإجراء ح 2 – 3.

Introduction

أشكال مختلفة من احتشاء عضلة القلب من الإجهاد أو الإصابة، بما في ذلك الدماغية (ضخه الاسكيمية أو احتشاء عضلة القلب) وغير الدماغية (ارتفاع ضغط الدم أو التهاب العضلة القلبية)، تشجيع تعيين الخلايا الملتهبة مع الترميمي والحماية، لكن أيضا الخصائص المسببة للأمراض. أقرب 1891، رومبيرغ أول وصف وجود تتسرب الخلوية في عضلة القلب للمرضى المصابين ب التيفوس والحمى القرمزية¹. بيد أن الدراسة التفصيلية للخلايا المناعية القلب يتطلب تطوير تقنيات أكثر تطورا إيمونوفينوتيبينج. نتيجة لذلك، إلا في الآونة الأخيرة قد بدأنا على فهم أن عدد سكان متنوعة من الخلايا المناعية مع أدوار الصيانة الضرورية أثناء حالة ثابتة يتواجد داخل عضلة القلب.

وقد علم الأنسجة، ولا يزال، الأسلوب الأكثر شيوعاً لتوصيف الخلايا المناعية القلب أثناء التهاب. ومع ذلك، حين علم الأنسجة يمثل أداة قيمة لتشخيص، استخدامه في دراسة الخلايا المناعية القلب قد القيود الهامة. تمثل نسبة ضئيلة جداً من مجموع الخلايا الخلايا المناعية المقيمين في عضلة القلب وهي أكثر أو أقل موزعة في مساحة كبيرة نسبيا. وبالمثل، تظهر عدة أشكال من التهاب القلب، مثل فيروسي التهاب العضلة القلبية، أنماط التنسيق من التهاب. وهذا يعني أن التحليل الدقيق للنظام المناعي للقلب غالباً ما تتطلب درجة أعلى من أخذ عينات نسيجية، زيادة التكلفة للحد من التحيز. وعلاوة على ذلك، يوفر علم الأنسجة كمية محدودة جداً من المعلومات يمكن استخدامها في تحديد الخلية (مثل عدد المعلمات). مع عدد متزايد من أي وقت مضى من مجموعات فرعية الخلية التي تتطلب استخدام عدة علامات التعبير (بما في ذلك علامات السطحية أو عوامل النسخ أو جزيئات يفرزها)، التدفق الخلوي أثبتت أنها أقوى أداة إيمونوفينوتيبينج، سبب منخفضة التكلفة وعالية الإنتاجية.

باستخدام تقنيات إيمونوفينوتيبينج يتوقف عن كثب على تطوير كفاءة الهضم البروتوكولات التي تسمح بتحليل خلايا مفردة لإعداد كبيرة من الخلايا. وضع بروتوكولات شاملة لاستخراج خلية فتح نافذة جديدة من الفرص في دراسة علم المناعة القلب. من خلال المزيج من الهضم، والتدفق الخلوي وترانسكريبتوميكس، كان السكان الرئيسية في الضامة، والخلايا الجذعية الذين يقيمون في القلب تتسم^2،3. السكان الأكثر وفرة من الخلايا المناعية القلب أثناء حالة ثابتة هي CD64⁺ميرتك⁺ الضامة، التي يمكن تقسيمها استناداً إلى التعبير عنها من CCR2 أو CD11c². CCR2⁺ الضامة تنبع من هيماتوبويسيس نخاع العظام الكبار، بينما الأغلبية من CCR2 الضامة^– ، التي يمكن أن تعبر عن مستويات عالية أو منخفضة من MHC-ثانيا، هم أساسا من أصل قبل الولادة. الضامة المهام الرئيسية مثل إصلاح⁴ وإزالة الحطام⁵ أثناء الإصابة أو دعم الربط الكهربائي⁶ في حالة مستقرة. خلال أشكال مختلفة من التهاب يحدث تدفقا هاما من Ly6C^مرحبا MHC-ثانيا^لو CD64^int وحيدات، التي تفرق في وقت لاحق في Ly6C^مرحبا CCR2⁺ الضامة^2،7 . عدد سكانها الخلايا المقيمين في عضلة القلب الأشخاص الأصحاء أصغر بكثير، ولكن المهم، يتكون من الخلايا الجذعية^8،9. واتسمت مؤخرا المجموعات الرئيسية اثنين من وحدات تحكم المجال Dc التقليدية القلب (المؤلفان): cDC1 (CD103⁺ وحدات تحكم المجال Dc) و cDC2 (CD11b⁺ وحدات تحكم المجال Dc). وحدات تحكم المجال Dc تلعب أدواراً هامة في الدفاع ضد العدوى⁸ ولكن يمكن أيضا أن تعزز المتمتعة بالحكم الذاتي-الإصابة أثناء التهاب، لا سيما أثناء احتشاء عضلة القلب⁹.

وهنا يصف لنا طريقة بسيطة لعزل الخلايا المناعية القلب قابلة للاستمرار من الماوس عضلة القلب. الأسلوب يجمع بين الهضم الأنزيمي والميكانيكية مع خلية-مصفاة ترشيح بغية الحصول على تعليق خلية مفردة يمكن تحليلها، أو كذلك تنقيته، التدفق الخلوي الفرز أو تخصيب حبة المغناطيسية. تتطلب قياسات دقيقة لخلايا عضلة القلب اكسترافاسكولار القلب نضح من أجل إزالة الملوثات المحتملة من مجرى الدم ميكروفاسكولاتوري القلب. وباﻹضافة إلى ذلك، فإننا نقدم خطوة اختيارية لوسم منتثر داخل الأوعية للخلايا المناعية التي يمكن استخدامها لزيادة التفرقة بين خلايا عضلة القلب من الملوثات داخل الأوعية، على أساس بروتوكول et al. البندقية¹⁰. وأخيراً، نقدم تحليل تدفق أساسية الخلوي لتحديد الفئات السكانية الفرعية بلعم ومركز السيطرة على الأمراض الرئيسية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بيان الأخلاق: تم استعراض هذا البروتوكول والتي أقرتها "اللجنة رعاية الحيوان" في "الشبكة الصحية جامعة" (تورنتو، كندا)، وامتثالا "المجلس الكندي للعناية بالحيوان".

1. إعداد المخزن المؤقت

1. إعداد المخزن المؤقت لسداسي البروم ثنائي الفينيل (موازنة الملح الحل (حبس هانك)، مصل بقرى الحرارة 2% معطل، ألبومين المصل البقري 0.2%). قم بإضافة 10 مل حرارة إبطال ز 1 من ألبومين المصل البقري إلى 500 مل هبس والمصل البقري. تصفية تعقيم من خلال فلتر 0.2 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. إعداد المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، إبطال الحرارة 2% مصل بقرى 1 ملم حمض الإيثيلين (يدتا، pH 8.0)). إضافة الحرارة 10 مل إبطال المصل البقري و 1 مل من 0.5 م أدتا إلى 500 مل من برنامج تلفزيوني. تصفية تعقيم من خلال فلتر 0.2 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: يمكن تخزين الحلول عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.

2-وضع العلامات لتعميم الكريات البيضاء

1. أسيبتيكالي إعداد الماوس المضادة حقن CD45 مع 1 ميكروغرام من جسم مخفف في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) لوحدة تخزين نهائي حقن 200 ميليلتر/الماوس. تحميل وحدة التخزين في محقن الأنسولين ز 28.5 والابتعاد عن الضوء.
   ملاحظة: استخدام اثنين من الأجسام المضادة مختلفة تسمى fluorochrome المضادة-CD45 أجل منتثر داخل الأوعية (الملون من خلال الإدارة رابعا) التفريق بين من تلطيخ intracardiac (ملون بعد الهضم؛ راجع الخطوة 4).
2. قبل الحارة الفئران (8-12 أسابيع من العمر) وذلك بتعريض الذيل إلى مصباح أحمر حرارة لمدة 5 دقائق.
   تنبيه: لا أسخن الحيوان. يبقى المصباح على مسافة آمنة (> 30 سم).
   1. كبح جماح هذا الحيوان في موقف القصية باستخدام جهاز مناسب. فضح واستقرار الذيل باليد غير المهيمنة بشل حركة قاعدة الذيل مع الفهرس والإصبع الأوسط والمنطقة منتصف القاصي الذيل مع الإبهام والبنصر.
      تنبيه: لا تنطبق كثيرا قوة في طرف الذيل كما يمكن سحب الجلد. أدخل الإبرة مع المجسم مشطوف الحواف التي تواجه في هذا السياق. تبقى الإبرة موازية لهذا السياق في جميع الأوقات كما أنه من السهل ثقب في الوريد.
      ملاحظة: قد تحدث الدم إدخال المحاقن وهو علامة على حقنه جيدة. يمكن الانحناء الإبرة بزاوية 90 درجة لتيسير الإدارة رابعا. تأكيد مع مكتب السلامة الخاصة بك كما الإبر الانحناء قد تمثل خطرا.
   2. ضخ 200 ميليلتر عن طريق الوريد في الوريد الذيل. السائل ينبغي أن تتدفق بسهولة ومؤقتا واضحة في السياق.
      تنبيه: لا قوة السائل في إذا تم الوفاء بالمقاومة. وهذا دليل على فقدان الإبرة.
   3. السماح بجسم مضاد لتعميم لمدة 5 دقائق قبل يوثانيزينج إنسانية الماوس.

3-قلب عزل والهضم

1. Euthanize CO₂ باستخدام الماوس أو بواسطة الإجراء القتل الرحيم المقبولة من الناحية الأخرى.
   1. ضع الماوس في الدائرة₂ CO CO₂ القتل الرحيم، وتعيين معدل التعبئة إلى 20 في المائة حجم الدائرة للدقيقة الواحدة (أي، إذا كانت الدائرة هي 10 لتر، التعبئة في 2 لتر في الدقيقة). تشغيل للماوس 2 دقيقة ومراقبة حتى توقف التنفس.
   2. إيقاف CO₂ واترك الماوس للحد أدنى 1-2 إضافية تضمن توقف التنفس قبل فتح الدائرة وأداء قرصه تو لتأكيد الماوس ميت قبل الشروع في عملية الماوس.
2. رذاذ الماوس مع الإيثانول 70%. رفع الجلد في البطن وتشريح الماوس بالقطع على طول خط الوسط البطني بداية على مستوى الوركين حتى القص. فتح البطن ونقل الكبد لفضح الحجاب الحاجز.
3. قطع الحجاب الحاجز، ثم الأضلاع على جانبي خط الوسط، مع الحرص على تجنب ثقب في الرئتين والقلب.
   1. فضح القلب تقشير مرة أخرى على أضلاعه، ثم قطع الأول تليها الاذينين الأيسر الاذينين الأيمن.
      تنبيه: كن حذراً عند قطع الاذينين، ضمان وأصيب لا الشرايين أو الأوردة، كهذا يمكن أن يقلل من كفاءة التنظيف الدم الوارد في الأجهزة.
   2. نتخلل القلب مع 15 – 20 مل من برنامج تلفزيوني الباردة استخدام المحاقن 60 مل مزودة بإبرة ز 21 وبرنامج تلفزيوني الباردة. بلطف فهم قاعدة القلب بالملقط وأدخل الإبرة في البطين الأيسر قرب القمة. كرر الإجراء في البطين الأيمن. النتائج حقن مناسبة في الأبيض الرئتين والكبد شاحبة.
      ملاحظة: ينبغي إجراء نضح خلال 5 دقائق بعد القتل الرحيم تفاديا تخثر الدم، التي يمكن أن تلوث أجهزة الاهتمام بتعميم خلايا.
4. اضغط قاعدة القلب بالملقط ولطف سحب القلب، ثم فصل القلب بقطع الشرايين الرئوية الرئيسية والاوردة والشريان الاورطي وكيس التامور.
   1. تنظيف القلب بعقد القلب بين الإبهام والأصابع الفهرس بلطف بمنشفة ورقية نظيفة خالية من الوبر وسحب قبالة الاذينين وبقايا الشرايين الرئيسية وعروق وأي ملوثات أخرى مع الملقط.
      ملاحظة: تأكد من إزالة بأكملها الاذينين ولا أنسجة أخرى، مثل الرئة أو الأوعية الدموية، وموجودة كهذه الأنسجة الخاصة بهم الخلايا المناعية المقيم. الرئة خاصة يبلغ عدد سكانها كبير خلايا المناعية التي يمكن أن تخفي السكان أصغر من تلك التي تدخل عضلة القلب.
5. مكان القلب في طبق بلاستيك 5 سم مع 50 ميليلتر من برنامج تلفزيوني الباردة.
   1. تخطر على قلب استخدام مقص تشريح منحنية حتى هناك لا أجزاء مرئية ولها وجود اتساق سلس.
      ملاحظة: محاولة لإبقاء القلب في منطقة وارد في الطبق أثناء تقطيع للتقليل من فقدان الأنسجة.
   2. نقل الأنسجة ثيتريتوراتيدهيرت باستخدام الملقط منحنى في أنبوب ميكروسينتريفوجي 2 مل مع النسر المتوسط تعديل (دميم في 800 ميليلتر الباردة دولبيكو).
6. إضافة 450 U/mL أوفكولاجيناسي الأول، 60 يو/مليلتر من البروتين السكري المثبط نوع أنا-S و 60 يو/مليلتر من الدناز-الأول لكل عينة.
   1. احتضان عينات في 37 درجة مئوية في شاكر هزاز 50 لفة في الدقيقة لمدة 45 – 60 دقيقة.
7. بعد الهضم، بإيجاز دوامة عينات (20 ق) ثم ضع فورا على الجليد الاحتفاظ بعينات في 4 درجات مئوية.
   1. استخدام بيبيتور 1 مل، "الماصة؛" عينات صعودا ونزولاً حتى عينات الأنسجة تكون متجانسة ولا تسد نصيحة ماصة.
      ملاحظة: تحديد عدد محدد من المرات "الماصة؛" قد يزيد من إمكانية تكرار نتائج. إذا لم يتم هضمها القلوب على الوجه الأمثل، قد يعرقل قطعة من عضلة القلب الماصة. بلطف طحن نصيحة ماصة ضد أنبوب ميكروسينتريفوجي سيساعد على تجانسه قطعة أكبر من الأنسجة.
8. قبل الرطب 40 ميكرومتر خلية مصفاة توضع في أنبوب 50 مل مخروطية مع 1 مل من البرد سداسي البروم ثنائي الفينيل.
   1. إضافة نموذج المتجانس للتصفية وتغسل من خلال بصب 12 – 14 مل الباردة سداسي البروم ثنائي الفينيل ببطء.
   2. نقل العينات التي تمت تصفيتها إلى أنبوب مخروطي توسم 15 مل والحفاظ على 4 درجة مئوية.
9. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. نضح قبالة المادة طافية.
   1. خلايا الدم الحمراء بإضافة 1 مل من كلوريد الأمونيوم-البوتاسيوم (ACK) تحلل المخزن المؤقت لكل عينة. ريسوسبيند عينات من فورتيكسينج واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   2. وبمجرد الانتهاء من تفسخ، إضافة 5 – 8 مل من متوازن الملح الحل (حبس البرد هانك) لوقف انحلال الدم.
10. الطرد المركزي عينات في غفور 400 x 5 دقيقة في 4 درجات مئوية. نضح قبالة المادة طافية.
11. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لنظام مراقبة الأصول الميدانية لكل عينة ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي توسم 1.5 مل.
    ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا ليصل إلى 2 حاء مع العينات المخزنة في 4 درجات مئوية.

4-التدفق الخلوي تلطيخ والتحليل

1. عينات من أجهزة الطرد المركزي في 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
   1. للحد من جسم غير محدد ملزم، تضعف من 1: 100 المضادة-CD16/CD32 و "مانع الوحيدات" (01:20) (انظر الجدول للمواد) في حساب 50 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية كل عينة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
   2. إعداد حصر تمييع (1: 250 لكل جسم) جسم 50 ميليلتر من نظام مراقبة الأصول الميدانية كل عينة.
      ملاحظة: يمكن تضمين صبغة بقاء في جسم كوكتيل بغية استبعاد الخلايا الميتة. وبدلاً من ذلك، يمكن أن يكون الاستبعاد صغيرة الحجم بتحليل تدفق المستخدمة (الشكل 1ج ود).
   3. دون الغسيل، إضافة 50 ميليلتر من مزيج الرئيسي الأجسام المضادة لكل عينة وخلط.
   4. احتضان العينات عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام.
2. إضافة 600 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية لكل عينة لغسل والطرد المركزي عينات من 400 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
3. نضح قبالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 300 ميليلتر نظام مراقبة الأصول الميدانية. الاحتفاظ بعينات في 4 درجات مئوية في الظلام.
   ملاحظة: تتطلب بعض الأصباغ البقاء، مثل DAPI، تلطيخ داخل 10 دقيقة قبل تشغيل التدفق الخلوي.
4. تحليل من خلال التدفق الخلوي (انظر الأرقام 1 و 2) ضمن ح 3 المقبل. إذا كان وقت أطول التثبيت المطلوبة وقصيرة الأجل باستخدام بارافورمالدهيد تركيز منخفض (0.5 – 1% في برنامج تلفزيوني) يوصي بالحفاظ على تلطيخ.
   ملاحظة: من المستحسن جداً لتصفية عينات من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر قبل بدء التدفق الخلوي التحليل منعا لعرقلة فلويديكس سيتوميتير تدفق.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

حتى الآن، لا توجد طريقة جيدة قد صمم لعزل الخلايا المناعية من مكونات القلب خلية أخرى، مثل كارديوميوسيتيس. ومن ثم يتطلب تحليلاً لتعليق خلية مفردة القلب بالتدفق الخلوي النابضة مسبقاً مع CD45 تحديد السكان الخلايا المناعية، وتليها خلية مفردة، وصغر حجم الاستبعاد النابضة (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

التهاب عضلة القلب، أو التهاب العضلة القلبية، ميزة لأمراض القلب والأوعية الدموية أكثر. بيد أن عضلة القلب لا يخلو من مكوناته المناعية في الحالات غير المرضية. أثناء حالة ثابتة، العديد من الخلايا المناعية الموجودة في عضلة القلب ولعب أدوار أساسية لصون وحماية. لم يكن وصف هؤلاء السكان متنوعة من ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755