Изоляция и определение внесосудистой иммунных клеток сердца

Резюме

Этот протокол предоставляет простой и эффективный метод, чтобы изолировать, выявлять и количественно иммунные клетки, проживающих в миокарде мышей при установившемся или воспаления. Протокол сочетает в себе ферментативные и механических пищеварение для поколения подвеска одну ячейку, которая может быть далее проанализирован подачей cytometry.

Аннотация

Иммунная система является важным компонентом здорового сердца. Миокарда является домом для богатых населения различных иммунных клеток подмножеств с функциональной сегментации, как при стационарном, так и в ходе различных форм воспаления. До недавнего времени, исследование иммунных клеток в самом сердце требует использование микроскопии или слабо развита пищеварение протоколы, которые представили достаточно чувствительности во время тяжелое воспаление, но смогли уверенно выявить небольшие — но ключа — население клетки в стационарном состоянии. Здесь мы рассмотрим простой метод комбинирования ферментативный (коллагеназа, гиалуронидаза и DNAse) и механических переваривания мышиных сердца предшествует внутрисосудистого администрации дневно помечены антител к дифференцировать малые но неизбежным внутрисосудистые клеток загрязнений. Этот метод создает подвеска изолированных жизнеспособных клеток, которые могут быть проанализированы проточной цитометрии для идентификации, фенотипа и количественной оценки, или Далее очищенный с сортировки активирован флуоресценции клеток или разделения магнитный шарик для транскрипционный анализ анализ или в пробирке исследования. Мы включить пример анализа гранулярных пошаговые потока дифференцировать ключевых макрофаги и дендритные клетки населения сердца. Для среднего размера эксперимента (10 сердца) завершение процедуры требует 2-3 ч.

Введение

Различные формы миокарда стресса или травмы, включая ишемического (ишемии-реперфузии или инфаркт миокарда) и не связанная с ИБС (гипертонии или миокардит), поощрять набор воспалительных клеток с репаративные и защитные, но и патогенные свойства. Еще в 1891 Ромберга впервые описал наличие клеточных инфильтратов в миокарде больных, инфицированных тифа и скарлатина¹. Однако детальное изучение сердца иммунных клеток требует разработки методов более продвинутые Иммунофенотипирование. Как следствие только недавно мы начали понимать, что разнообразие населения иммунных клеток с важным поддержание роли при установившемся находится в миокарде.

Гистология был и до сих пор является наиболее распространенным методом характеризовать сердечной клетки иммунной системы во время воспаления. Однако хотя Гистологическая картина представляет собой ценный инструмент диагностики, его использование в изучении сердечной иммунных клеток имеет важные ограничения. Иммунные клетки, проживающих в миокарде представляют собой весьма незначительную часть общего числа клеток и более или менее равномерно распределены в пропорционально необъятный космос. Аналогично некоторые формы сердца воспаления, таких как вирусный миокардит, показывают координационных структур воспаления. Это означает, что точный анализ иммунной системы сердца часто требуют более высокой степени гистологической выборки, увеличивая стоимость снижения отклонений. Кроме того гистология обеспечивает очень ограниченное количество полезной информации в ячейки идентификации (например , количество параметров). С постоянно растущим числом подмножеств клеток, которые требуют использования нескольких маркеров выражение (в том числе поверхностных маркеров, факторы транскрипции или выделяется молекул) проточной цитометрии зарекомендовал себя как самый мощный инструмент для иммунофенотипирование, Благодаря низкой стоимости и высокой пропускной способности.

Использование методов Иммунофенотипирование тесно зависит от развития эффективного переваривания протоколов, разрешенных для одного клетки анализа большого числа клеток. Разработка исчерпывающие протоколы клетки добычи открыл новое окно возможностей в исследовании сердца иммунологии. Благодаря сочетанию пищеварение, проточной цитометрии и transcriptomics основных популяций макрофаги и дендритные клетки, проживающих в самом сердце были характерны^2,3. Наиболее распространенным населения сердечной иммунных клеток во время устойчивого состояния являются CD64⁺MerTK⁺ макрофаги, которые могут быть далее разделены на основе их выражения CCR2 или CD11c². CCR2⁺ макрофаги происходят от взрослого костного кроветворения, тогда как большинство из CCR2^– макрофаги, которые выражают высокий или низкий уровень MHC-II, в основном дородовой происхождения. Макрофаги выполняют ключевые функции, такие как ремонт⁴ и удаления мусора⁵ во время травмы или поддержки электрические подключения⁶ в стационарном состоянии. Во время различных форм воспаления происходят важные приток Ly6C^Привет MHC-II^Ло CD64^int моноцитов, который позже дифференцироваться в Ly6C^Привет CCR2⁺ макрофаги^2,7 . Значительно меньше, но важно, популяция клеток, проживающих в миокарде здоровых людей состоит из дендритные клетки^8,9. Два основных подмножества сердечной обычных DCs (cDCs) недавно характеризовались: cDC1 (CD103⁺ DCs) и cDC2 (CD11b⁺ DCs). РСУ играют важную роль в обороне против инфекции⁸ , но могут также способствовать самоповреждения во время воспаления, особенно во время инфаркта миокарда⁹.

Здесь мы опишем простой метод для изоляции жизнеспособных сердца иммунных клеток от мыши миокарда. Метод сочетает в себе ферментативные и механических пищеварение с фильтрацией клетки фильтр для того, чтобы получить одну ячейку подвеска, которая может быть проанализирована, или неразделимая, поток цитометрии сортировки или магнитный шарик обогащения. Точные измерения внесосудистой клеток миокарда требуют сердца перфузии для удаления возможных загрязнений из крови сердца microvasculature. Кроме того мы представляем необязательный шаг внутрисосудистого маркировки иммунных клеток, которые могут использоваться для дальнейшего дифференцировать миокарда клетки от внутрисосудистого загрязняющих веществ, основанный на Галкина et al. протокол¹⁰. Наконец мы представляем основной поток cytometry анализ для выявления основных субпопуляций макрофагов и cDC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Этика заявление: этот протокол был рассмотрен и утвержден Комитетом по уход животных на университетской сети здравоохранения (Торонто, Канада) и в соответствии с канадского Совета по лечению животных.

1. буфер подготовка

1. Подготовьте ГБД буфера (Хэнка сбалансированный соли раствора (HBSS), 2% тепла инактивированная бычьим сывороточным, 0,2% альбумина bovine сыворотки). Добавьте 10 мл тепла инактивированная бычьим сывороточным и 1 g бычьим сывороточным альбумином в 500 мл HBSS. Фильтр стерилизовать через фильтр 0.2 мкм и хранить при 4 ° C.
2. Подготовка буфера СУИМ (фосфат буфер солевой раствор (PBS), 2% тепла инактивированная бычьим сывороточным, 1 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА, рН 8,0)). Добавьте 10 мл тепла инактивированная бычьим сывороточным и 1 мл раствора ЭДТА 0,5 М до 500 мл ФСБ. Фильтр стерилизовать через фильтр 0.2 мкм и хранить при 4 ° C.
   Примечание: Решения могут храниться при температуре 4 ° C до 1 месяца.

2. Маркировка циркулирующих лейкоцитов

1. Асептически Подготовьте анти мыши CD45 введения с 1 мкг антител, разбавленных в стерильных фосфатный буфер (PBS) для окончательного инъекции объем 200 мкл/мыши. Эквивалентный объем в шприц инсулина 28,5 G и хранить вдали от света.
   Примечание: Используйте два разных флюрохром, меченного анти CD45 антитела для того чтобы продифференцировать внутрисосудистый (витражи через и.в. администрации) от внутрисердечной окрашивания (витражи после переваривания; см. шаг 4).
2. Предварительно теплой мышей (8-12 недель), подвергая хвост, чтобы лампа Красная жара за 5 мин.
   Предупреждение: Не перегревать животного. Держите лампу на безопасном расстоянии (> 30 см).
   1. Удержать животное в грудины позицию с помощью соответствующего устройства. Разоблачить и стабилизировать хвост с рукой недоминирующих, иммобилизирующие основание хвоста с индекс и средним пальцем и середине дистальной части региона хвост с большой палец и палец кольцо.
      Предупреждение: Не применять слишком много сил на кончике хвоста как кожа может быть вытащил Выкл. Вставьте иглу с наклонной вверх в Вену. Держите иглы параллельно вен во все времена, как это легко для прокола Вены.
      Примечание: Кровь, набора в шприц может произойти и является признаком хорошего инъекции. Изгиб иглу под углом в 90° может облегчить и.в. администрации. Подтвердите ваш офис безопасности как изгиб иглы могут представлять опасность.
   2. Inject 200 мкл внутривенно в Вену хвост. Жидкость должна течь легко и временно снимите Вену.
      Предупреждение: Не заставляйте жидкости в если сопротивление. Это признак неправильного иглы.
   3. Разрешить антитела распространить за 5 мин до гуманно euthanizing мыши.

3. сердце изоляции и пищеварение

1. Усыпить мышей с использованием CO₂ или другие процедуры институционально признанных эвтаназии.
   1. Для CO₂ эвтаназии поместите указатель мыши в камере CO₂ и установите скорость заполнения до 20% объема камеры в минуту (т.е., если палата-10 Л, заполните 2 Л/мин). Запуск монитора и 2 мин мыши пока перестала дышать.
   2. Выключить CO₂ и оставьте мышь для дополнительных 1-2 мин обеспечить дыхание прекратила перед открытием камеры и выполняют мыс Пинч, чтобы подтвердить, что мышь мертв прежде для обработки мыши.
2. Спрей мыши с 70% этиловом спирте. Снять кожу на животе и вскрыть мыши путем разрезания вдоль вентральной срединной начала на уровне бедер до грудины. Откройте живота и переместить печени подвергать диафрагмы.
3. Вырежьте диафрагмы, то ребра по обе стороны от средней линии, стараясь избежать проколов в легких и сердце.
   1. Разоблачение сердца, пилинг назад ребра, а затем вырезать первой левого предсердия следуют правый предсердий.
      ВНИМАНИЕ: Соблюдайте осторожность при резки предсердия, обеспечивая не артерий или вен получают травмы, как это может снизить эффективность промывки крови, содержащиеся в органах.
   2. Perfuse сердце с 15 – 20 мл холодного PBS с помощью 60 мл шприца с иглой 21 G и холодной PBS. Аккуратно понять основание сердца с щипцами и вставить иглу в левый желудочек вблизи верхушки. Повторите эту процедуру в правый желудочек. Надлежащего инъекции приводит к белым легких и бледно печени.
      Примечание: Перфузии должны выполняться в течение 5 минут после эвтаназии избежание свертывающей системы крови, которые могут загрязнять органов интерес с циркулирующих клеток.
4. Удерживайте основание сердца с щипцами и осторожно потяните сердце, а затем отсоединить сердце путем разрезания основных легочных артерий и вен, аорта и перикарда мешок.
   1. Очистите сердце нежно держит сердце между большим и указательным пальцами в чистой безворсовой салфеткой и стащить предсердия и остатки крупных артерий и вен и любых других загрязнений с щипцами.
      Примечание: Убедитесь, удаляется полностью предсердия и другие ткани, например легких или кровеносных сосудов, присутствуют как эти ткани имеют свои собственные резидентов иммунных клеток. Легких в частности имеет большой иммунных клеток населения, что может маскировать небольших популяций в миокарде.
5. Место сердце в 5 см пластиковые блюдо с 50 мкл холодной PBS.
   1. Фарш сердца, с использованием рассечения изогнутые ножницы до тех пор, пока есть без видимых частей и имеет гладкой консистенции.
      Примечание: Попробуйте держать сердце в автономной области блюдо во время измельчения для сведения к минимуму потерь ткани.
   2. Передачи thetrituratedheart ткани с помощью Изогнутый пинцет в 2-мл пробирку microcentrifuge с 800 мкл холодной Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM).
6. Добавить 450 ед/мл ofcollagenase I, 60 ед/мл гиалуронидазы типа I-s и 60 ед/мл DNase-I к каждому образцу.
   1. Проинкубируйте образцы при 37 ° C на качалки шейкер на 50 об/мин за 45-60 мин.
7. После переваривания, кратко вихревой образцов (20 s) и сразу же место на льду хранить пробы при 4 ° C.
   1. С помощью 1 мл дозаторов, Пипетка образцы вверх и вниз до тех пор, пока образцы тканей являются однородными и не засорять наконечник пипетки.
      Примечание: Определение определенное количество раз для Пипетка может увеличить воспроизводимость. Если сердца не перевариваются оптимально, куски миокарда может препятствовать пипеткой. Аккуратно шлифовальный наконечник пипетки против пробки microcentrifuge поможет гомогенизировать большие куски ткани.
8. Предварительно Намочите стрейнер клеток 40 мкм, размещены на 50 мл Конические трубки с 1 мл холодного ГБД.
   1. Добавление фильтра гомогенизированных образцов и мыть через, медленно поливая 12 – 14 мл холодного ГБД.
   2. Передача образцов отфильтрованного помечены 15 мл конические и хранить при 4 ° C.
9. Центрифуга образцы на 400 x g 5 мин при 4 ° C. Аспирационная покинуть супернатант.
   1. Лизируйте красных кровяных клеток, добавив 1 мл буфера lysis аммония хлорид калия (ACK) для каждого образца. Ресуспензируйте образцов, vortexing и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
   2. После завершения лизиса, добавьте 5-8 мл из холодной Хэнк сбалансированный соли раствора (HBSS) остановить гемолиза.
10. Центрифугуйте образцы на 400 x gfor 5 мин при 4 ° C. Аспирационная покинуть супернатант.
11. Добавьте 1 mL СУИМ буфера для каждого образца и передачи пробки microcentrifuge маркировкой 1,5 мл.
    Примечание: Протокол может быть приостановлен здесь до 2 ч с образцами хранить при 4 ° C.

4. поток цитометрии окрашивание и анализ

1. Центрифуга образцы на 400 x g 5 мин при 4 ° C.
   1. Чтобы уменьшить неспецифической антитела связывая, развести 1: 100 анти CD16/CD32 и Моноцит блокатор (1:20) бухгалтерского учета (см. Таблицу материалов) для 50 мкл СУИМ на сэмпл. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
   2. Подготовка антител разрежения (1: 250 для каждого антитела) приходится 50 мкл на сэмпл СУИМ.
      Примечание: Краска жизнеспособности могут быть включены в коктейль антитела для того чтобы исключить мертвые клетки. Кроме того небольшой размер исключение анализа потока может быть (рис. 1C и D).
   3. Без стирки, добавьте 50 мкл антител мастер смеси для каждой выборки и перемешать.
   4. Проинкубируйте образцы на 4 ° C на 30 мин в темноте.
2. Добавить 600 мкл СУИМ для каждого образца, чтобы умыться и Центрифугуйте образцы на 400 x g 5 мин при 4 ° C.
3. Аспирационная покинуть супернатант и Ресуспензируйте Пелле в 300 мкл СУИМ. Храните пробы на 4 ° C в темноте.
   Примечание: Некоторые жизнеспособности красителей, например DAPI, требуют окраски в течение 10 минут перед запуском проточной цитометрии.
4. Анализировать подачей cytometry (см. рисунки 1 и 2) в течение следующих 3 ч. Если больше времени требуется, короткий срок фиксации с помощью параформальдегида низкой концентрации (0.5-1% в PBS) рекомендуется сохранить пятнать.
   Примечание: Настоятельно рекомендуется для фильтрации проб через стрейнер клеток 40 мкм до запуска потока cytometry анализ во избежание препятствий fluidics проточный цитометр.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

На сегодняшний день, не хороший метод был разработан для изолировать иммунных клеток от других компонентов сердечной клетки, например кардиомиоцитов. Следовательно анализ сердца одноклеточного подвеска подачей cytometry требует предварительно стробирования с CD45 для ид?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Воспаление миокарда или миокардит, функция наиболее сердечно-сосудистых заболеваний. Однако миокард не лишена своих собственных иммунной компонентов в государствах, не болезнь. При устойчивом состоянии многие иммунные клетки находятся в миокарде и играть существенно важную роль под?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755