절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

요약

이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

초록

면역 체계가 건강 한 심장의 필수적인 구성 요소입니다. 심근은 정상 상태와 다른 형태의 염증 동안 기능 구획과 다른 면역 세포 하위 집합의 풍부한 인구에 게 가정. 최근까지 연구에서에서 면역 세포의 현미경의 사용을 요구 하거나 심한 염증 동안 충분 한 감도 제공 하지만 하지 못했습니다 자신 있게 제대로 개발된 소화 프로토콜 식별 작은-하지만 키-인구 정상 상태 동안 셀입니다. 여기, 우리는 간단한 방법 결합 효소 (콜라, hyaluronidase DNAse)와 기계적 소화 murine 마음 앞에 작은 차별화에 놓여있는지 분류 항 체의 혈관 내 관리의 논의 하지만 피할 수 없는 혈관 내 세포 오염 물질입니다. 이 방법은 생성 식별 형질, 정량화, cytometry에 의해 분석 하거나 더 형광 활성화 된 세포 분류와 마그네틱 비드 분리 정화 수 있는 분리 가능한 세포의 현 탁 액 transcriptional 분석 또는 생체 외에서 연구. 우리는 주요 대 식 세포와 수지상 세포 인구 중심의 차별화 하는 단계별 흐름 cytometric 분석의 예를 포함 합니다. 중간 크기의 실험 (10 마음)에 대 한 절차의 완료는 2-3 h를 요구 한다.

서문

심근 긴장 또는 부상, 허 혈 성 등 (국 소 빈 혈 reperfusion 또는 심근 경색)의 다른 형태와 비-허 혈 성 고혈압 (심근 염), 아니라 회복 및 보호, 염증 세포의 모집 홍보 병원 성 속성입니다. 1891, 빠르면 Romberg 처음 발진 티 푸 스, 성 홍 열¹감염 환자의 심근에 세포 침투의 존재를 설명. 그러나, 심장 면역 세포의 상세한 연구 고급 immunophenotyping 기술 개발이 필요합니다. 그 결과, 최근에 우리가 안정 상태 동안 필수적인 유지 관리 역할을 가진 면역 세포의 다양 한 인구는 심근 내에 있는 이해 하기 시작 했습니다.

조직학, 되었으며 여전히 염증 동안 심장 면역 세포의 특성을 가장 일반적인 방법입니다. 그러나, 조직학 나타내는 유용한 진단 도구, 심장 면역 세포의 연구에 사용 중요 한 제한이 있다. 심근에 있는 면역 세포 총 세포의 아주 작은 비율을 대표 하 고 비례적으로 엄청난 공간에 더 많거나 적은 고르게 배포 됩니다. 마찬가지로, 여러 형태의 심장 염증, 바이러스 성 심근 염 등 염증의 초점 패턴을 표시합니다. 이 의미는 심장의 면역 시스템의 정확한 분석 종종 조직학 샘플링, 바이어스를 줄이기 위해 비용을 증가 시키기의 더 높은 학위를 필요로 합니다. 또한, 조직학 매우 제한 된 양의 셀 식별 (예: 매개 변수 개수)에 유용한 정보를 제공합니다. 여러 식 마커 (를 포함 하 여 표면 마커, 녹음 방송 요인 또는 분 비 분자)의 사용을 필요로 하는 셀의 하위 집합의 증가 수, cytometry immunophenotyping를 위한 가장 강력한 도구 자체를 설립 했다 저가 및 높은 처리량

Immunophenotyping 기술의 사용은 세포의 많은 수의 단일 세포 분석에 대 한 허용 하는 효율적인 소화 프로토콜의 개발에 밀접 하 게 의존. 세포 추출의 철저 한 프로토콜의 개발 심장 면역학의 연구 기회의 새로운 창을 열었습니다. 소화, cytometry 및 transcriptomics의 조합을 통해 대 식 세포와 수지상 세포에에서의 주요 인구 특징된^2,3되었습니다. 정상 상태 동안 심장 면역 세포의 가장 풍부한 인구는 CD64⁺MerTK⁺ 세포, 더 분할 될 수 있다는 CCR2 또는 CD11c²의 그들의 표정에 따라. CCR2⁺ 세포 성인 골 수 조에서 발생 한 반면 대부분 CCR2의 MHC-II에 대 한 높은 또는 낮은 수준의 표현할 수,^- 대 식 세포는 태아 근원의 주로 이다. 대 식 세포 수리⁴ 부상 또는 안정 상태에서 전기 연결⁶ 을 지 원하는 동안 파편⁵ 의 제거 등의 주요 기능을 수행 합니다. 다른 형태의 염증 동안 Ly6C^{안녕하세요} MHC-II^lo CD64^int monocytes의 중요 한 유입 발생는 나중에 Ly6C^{안녕하세요} CCR2 차별화⁺ 세포^2,7 . 현저 하 게 더 작고, 그러나 중요 한, 인구에서 건강 한 개인의 심근 세포의 수지상 세포^8,9로 구성 된다. 심장 기존의 DCs (cDCs)의 두 가지 주요 하위 집합을 최근 특징 되었습니다: cDC1 (CD103⁺ Dc)와 cDC2 (CD11b⁺ Dc). DCs 감염⁸ 에 대 한 방어에 중요 한 역할을 재생 하지만 또한 심근 경색⁹중 특히 염증, 동안 자기 부상을 홍보할 수 있습니다.

여기, 우리가 마우스 심근에서 가능한 심장 면역 세포의 분리에 대 한 간단한 방법을 설명합니다. 메서드를 사용 하면 단일 셀 서 스 분석, 또는 추가 정화, 교류 cytometry 정렬 또는 자석 구슬 농축 수를 얻기 위하여 셀 스 트레이너 여과와 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다. Extravascular 심근 세포의 정확한 측정 심장 microvasculature의 혈 류에서 가능한 오염 물질을 제거 하기 위해 심장 관류를 필요 합니다. 또한, 우리는 더 심근 세포 Galkina 외. 프로토콜¹⁰에 따라 혈관 내 오염 물질에서 차별화 하는 데 사용할 수 있는 면역 세포의 혈관 내 라벨의 단계는 선택 사항 제시. 마지막으로, 우리는 주요 대 식 세포 및 cDC 모집단을 식별 하는 기본적인 흐름 cytometry 분석을 제시.

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프로토콜

윤리 성명:이 프로토콜을 검토 하 고 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다)에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 동물 관리에 캐나다 위원회 준수 하 고.

1. 버퍼 준비

1. HBB 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS), 2% 열 비활성화 소 혈 청, 0.2% 소 혈 청 알 부 민)을 준비 합니다. 열 10 mL 비활성화 둔감 한 혈 청 및 HBSS의 500 ml 소 혈 청 알 부 민 1 g 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장
2. FACS 버퍼를 준비 (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 2% 열 소 혈 청, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA, pH 8.0) 비활성화). 10 mL 열 비활성화 둔감 한 혈 청 및 PBS의 500 mL에 0.5 M EDTA의 1 mL를 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터를 통해 소독 및 4 ° c.에 저장
   참고: 솔루션을 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 1 개월.

2. 순환 하는 백혈구의 라벨

1. Aseptically 200 µ L/마우스의 최종 주입 볼륨에 대 한 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS)에 희석 하는 항 체의 1 µ g와 반대로 마우스 CD45 주입을 준비 합니다. 28.5 G 인슐린 주사기에 볼륨을 로드 하 고 멀리 빛 유지.
   참고: 사용 하 여 두 개의 서로 다른 형광 색소 표시 안티 CD45 항 체 intracardiac 얼룩에서 혈관 내 (i.v. 관리 통해 스테인드) 차별화 (소화 후 스테인드, 4 단계 참조).
2. 전 5 분 동안 적 열 램프에 꼬리를 노출 하 여 쥐 (8-12 주 이전) 따뜻한.
   주의: 동물을 과열 하지 마십시오. 안전한 거리에서 램프를 유지 (> 30 cm).
   1. 적절 한 장치를 사용 하 여 sternal 위치에서 동물을 제 지. 색인과 중간 손가락으로 꼬리의 기지와 엄지 및 손가락으로 꼬리의 중반 원심 지역 immobilizing 함으로써 비 지배적인 손 가진 꼬리 안정 고.
      주의: 피부를 뽑아 수로 꼬리의 끝에 너무 많은 힘을 적용 되지 않습니다. 정 맥으로 향하도록 경사와 바늘을 삽입 합니다. 그것은 정 맥을 펑크 쉽게 병렬 항상 정 맥 바늘을 유지.
      참고: 피가 주사기를 입력 발생할 수 있습니다 및 좋은 주입의 표시 이다. 90도 각도로 바늘을 절곡 i.v. 관리 용이 하 게 수 있습니다. 안전 사무실 확인으로 벤딩 바늘 위험을 나타낼 수 있습니다.
   2. 200 µ L을 꼬리 정 맥에 정 맥 주사. 유체 흐름을 쉽게 하 고 일시적으로 혈관을 선택을 취소 해야 합니다.
      주의: 저항을 충족 하는 경우에 액체를 강요 하지 마십시오. 이 바늘의 방치의 표시 이다.
   3. 고통 없이 마우스 euthanizing 전에 5 분 동안 순환 항 체를 허용 합니다.

3. 심장 분리 및 소화

1. CO₂ 를 사용 하 여 마우스를 안락사 또는 다른 제도 허용된 안락사 절차.
   1. CO₂ 안락사에 대 한 CO₂ 챔버에 마우스 놓고 (즉, 챔버 10 L, 2 L/min에서 칠 경우) 분당 챔버 볼륨의 20%를 채우기 비율을 설정 합니다. 호흡이 정지 될 때까지 2 분 및 모니터 마우스에 대 한 실행 합니다.
   2. CO₂ 를 종료 하 고 추가 1-2 분 호흡 챔버를 열기 전에 정지 했습니다 확인에 대 한 마우스를 두고 고 마우스는 마우스 처리를 진행 하기 전에 죽은 것인지 발가락 핀치를 수행.
2. 70% 에탄올과 마우스 스프레이입니다. 복 부에 피부를 들어올리고 흉 골까지 엉덩이의 수준에서 시작 하 여 복 부 정중 선 따라 절단 하 여 마우스를 해 부 합니다. 복 부를 열고 노출 막 간 이동 합니다.
3. 폐와 심장 puncturing 되지 않도록 주의 하면서 중간의 양쪽에 횡 경 막, 다음 갈비뼈를 잘라.
   1. 노출 마음 필 링으로 다시 갈비뼈, 다음 컷된 먼저 왼쪽된 심 방 뒤 오른쪽 심 방.
      주의: 심 방,이 기관에 포함 된 혈액을 내 뿜 기의 효율성을 줄일 수로 동맥 또는 정 맥, 부상 보장을 자를 때 주의 사용 합니다.
   2. 21g 바늘으로 장착 되어 60 mL 주사기를 사용 하 여 차가운 PBS와 차가운 PBS의 15-20 mL와 하트 perfuse 부드럽게 집게와 심장의 기본을 파악 하 고 꼭대기 근처 좌 심 실에 바늘을 삽입. 우 심 실에서 절차를 반복 합니다. 적절 한 주입 흰색 폐 창백한 간 결과.
      참고: 관류 수행 되어야 한다 안락사 후 5 분 이내 순환 세포와 관심의 장기를 오염 시킬 수 있는 혈액 응고를 피하기 위하여.
4. 심장의 기지 겸 자 잡고 부드럽게 올려 심장 다음 pericardial 자루, 대동맥 및 혈관, 주요 폐 동맥을 절단 하 여 마음을 분리 합니다.
   1. 부드럽게 보풀 깨끗 한 종이 타월에 엄지와 집게 손가락 사이의 마음을 잡고 마음을 청소 하 고 겸 심 방 및 주요 동맥 및 정 맥 및 어떤 다른 오염 물질의 잔재 해 내.
      참고:는 심 방 전체를 제거 하 고 전혀 다른 조직, 혈관, 폐 등이 조직 그들의 자신의 거주 면역 세포를가지고 있는지 확인 합니다. 폐 특히 인구가 큰 면역 세포는 그 심근의 작은 인구를 마스크할 수 있습니다.
5. 차가운 PBS의 50 µ L 5 cm 플라스틱 접시에 마음을 놓습니다.
   1. 보이는 아무 조각이 있다 그리고 그것이 부드러운 일관성 때까지 곡선된 해가 위를 사용 하 여 마음을 말하다.
      참고: 조직 손실을 최소화 하기 위해 자르고 동안 접시의 포함 된 영역에서 마음을 유지 하려고 합니다.
   2. Thetrituratedheart 조직 2 mL microcentrifuge 튜브와 함께 800 µ L 찬 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM)으로 곡선된 집게를 사용 하 여 전송 합니다.
6. 나, 60 U/mL hyaluronidase 유형 I-S의, 그리고 DNase의 60 U/mL 450 U/mL ofcollagenase 추가-각 샘플을.
   1. 45-60 분 50 rpm에서 락 통에 37 ° C에서 샘플을 품 어.
7. 소화, 짧게 소용돌이 샘플 후 (20 s) 즉시 샘플 4 ° c.에 계속 하 얼음에 장소
   1. 1 mL pipettor를 사용 하 여 플라스틱 샘플 아래로 조직 샘플 균질 및 피 펫 팁을 방해할 하지 않습니다 때까지.
      참고: 플라스틱을 특정 한 횟수를 정의 재현성을 증가할 수 있습니다. 마음은 최적의 소화 되지, 심근의 조각 피펫으로 방해 수 있습니다. 부드럽게 microcentrifuge 튜브에 대 한 피 펫 팁을 연 삭 균질 직물의 더 큰 조각을 하는 데 도움이 됩니다.
8. 미리 젖은 차가운 HBB의 1 mL 50 mL 원뿔 튜브에 40 µ m 셀 스 트레이너.
   1. 무 균된 샘플 필터에 추가 하 고 차가운 HBB의 12-14 mL를 천천히 붓는 의해 통해 세척.
   2. 전송 필터링 이라는 15 mL 원뿔 튜브 샘플 및 4 ° c.에 계속
9. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 샘플 상쾌한에서 발음.
   1. 각 샘플에 염화 염화 칼륨 (ACK) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL을 추가 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse. Vortexing에 의해 샘플을 resuspend 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
   2. 세포의 용 해 완료 되 면 추가 5-8 mL의 차가운 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 혈을 중지 합니다.
10. 400 x gfor 4 ° c.에서 5 분에 샘플을 원심 상쾌한에서 발음.
11. 각 샘플을 microcentrifuge 이라는 1.5 mL 튜브에 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.
    참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기까지 2 h 4 ° c.에 저장 된 샘플

4. flow Cytometry 얼룩이 지 고 분석

1. 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기 샘플
   1. 일반적인 항 체 바인딩을 줄이기 위해 희석 1: 100 안티-CD16/CD32 및 Monocyte 차단 (1:20) 샘플 당 50 µ L FACS에 대 한 회계 ( 재료의 표참조). 15 분 동안 실 온에서 품 어.
   2. 샘플 당 FACS의 50 µ L에 대 한 항 체 희석 (각 항 체에 대 한 1: 250) 회계를 준비 합니다.
      참고: 생존 염료를 포함할 수 있습니다 항 체 칵테일에 죽은 세포를 제외 하기 위하여. 또는, 사용 (그림 1C 와 D) 흐름 분석에 의해 작은 크기 제외 될 수 있습니다.
   3. 세척, 없이 항 체 각각 샘플링 하 고 믹스 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다.
   4. 어둠 속에서 30 분 동안 4 ° C에서 샘플을 품 어.
2. 세척 하 고 샘플 4 ° c.에서 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 각 샘플에 600 µ L FACS를 추가
3. 상쾌한 오프 aspirate와 300 µ L FACS에 펠 릿을 resuspend. 어둠 속에서 4 ° C에서 샘플을 유지.
   참고: DAPI, 등 일부 생존 염료, cytometry를 실행 하기 전에 10 분 이내 얼룩이 필요 합니다.
4. Cytometry 분석 ( 그림 1 및 2참조) 다음 3 h 이내. 더 이상 시간이 필요, 단기 고정 낮은 농도 paraformaldehyde를 사용 하 여 경우 (0.5-1 %PBS) 얼룩을 보존 하는 것이 좋습니다.
   참고: 그것은 좋습니다 흐름 cytometer의 응용의 방해를 방지 하기 위해 시작 흐름 cytometry 분석 전에 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플을 필터링 할.

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결과

날짜 하려면, 좋은 방법 cardiomyocytes 같은 다른 심장 세포 구성 요소에서 면역 세포를 분리 설계 되었습니다. 따라서, cytometry에 의해 심장 단일 세포 현 탁 액의 분석 단일 세포 및 작은 크기 제외 제어그림 1(A) 면역 세포 인구를 식별 하는 CD45와 미리 게이팅 필요 합니다. 또는, 생존 얼룩이 죽은 세포를 제외 하려면 수행할 수 있습니다. 소?...

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토론

심근 염증, 또는 심근 염, 가장 심혈 관 질환의 기능입니다. 그러나, 심근 질병이 아닌 상태에서 자체 면역 구성 요소 없는 아니다. 정상 상태 동안 많은 면역 세포에는 심근 있으며 유지 보수 및 보호의 필수적인 역할. 셀의 이러한 다양 한 인구 특성 것 없었을이 프로토콜에서 제시 하는 것과 같은 방법 없이 불가능 하다.

심근의 기계 및 효소 소화의 조합 분석, 흐름 cytometry 또...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755