Isolement et Identification des cellules immunitaires extravasculaires du coeur

Résumé

Ce protocole présente une méthode simple et efficace pour isoler, identifier et quantifier les cellules immunitaires qui résident dans le myocarde de souris pendant l’état d’équilibre ou d’inflammation. Le protocole associe la digestion enzymatique et mécanique pour la génération d’une suspension de cellule unique qui peut être davantage analysée par cytométrie en flux.

Résumé

Le système immunitaire est une composante essentielle d’un cœur en bonne santé. Le myocarde est abrite une riche population de sous-ensembles de différentes cellules immunitaires avec compartimentation fonctionnelle durant l’état d’équilibre et différentes formes d’inflammation. Jusqu'à tout récemment, l’étude des cellules immunitaires au cœur exige l’utilisation de la microscopie ou protocoles de digestion peu développé, qui a fourni suffisamment de sensibilité lors d’une inflammation sévère mais n’ont pu en toute confiance identifient petit — mais clés — les populations de cellules pendant l’état d’équilibre. Ici, nous discutons une combinaison simple méthode enzymatique (collagénase, hyaluronidase et DNAse) et digestion mécanique des cœurs murine précédée d’administration intravasculaire d’anticorps fluorescent marqué pour différencier les petits mais inévitable contaminants cellulaires intravasculaire. Cette méthode génère une suspension de cellules viables isolées qui peuvent être analysés par cytométrie de flux pour l’identification et la quantification, phénotypage, ou purifié avec tri de fluorescence-lancée de cellules ou de séparation de billes magnétiques pour transcriptionnels études analyse ou in vitro . Nous incluons un exemple d’une cytométrie étape par étape pour différencier les macrophages clés et les populations de cellules dendritiques du cœur. Pour une expérience de taille moyenne (10 coeurs), l’achèvement de la procédure nécessite 2 à 3 h.

Introduction

Différentes formes de stress myocardique ou préjudice, y compris ischémique (ischémie reperfusion ou infarctus du myocarde) et non ischémique (hypertension ou myocardite), favoriser le recrutement des cellules inflammatoires réparatrice et protectrice, mais aussi Propriétés pathogènes. Dès 1891, Romberg décrit tout d’abord la présence d’infiltrats cellulaires dans le myocarde des patients infectés par le typhus et la scarlatine¹. Cependant, l’étude détaillée des cellules immunitaires cardiaques a nécessité le développement de l’immunophénotypage des techniques plus avancées. En conséquence, que récemment nous avons commencé à comprendre qu’une population diversifiée de cellules immunitaires avec des rôles de maintenance essentielle au cours de l’état d’équilibre réside dans le myocarde.

L’histologie a été et est encore, la méthode la plus courante pour caractériser les cellules immunitaires cardiaques lors d’une inflammation. Cependant, alors que l’histologie représente un précieux outil de diagnostic, son utilisation dans l’étude des cellules immunitaires cardiaques a limitations importantes. Les cellules immunitaires qui résident dans le myocarde représentent une très faible proportion des cellules totales et sont plus ou moins uniformément distribués dans un espace immense proportionnellement. De même, plusieurs formes d’inflammation cardiaque, myocardite virale, comme le montrent des phénomènes focales d’inflammation. Cela signifie qu’une analyse précise du système immunitaire du cœur exige souvent des degrés plus élevés de prélèvement histologique, une hausse des coûts pour réduire le biais. En outre, l’histologie fournit une quantité très limitée d’information utilisable dans l’identification des cellules (par exemple le nombre de paramètres). Avec un nombre toujours croissant de sous-ensembles de cellules qui nécessitent l’utilisation de marqueurs d’expression multiples (y compris les marqueurs de surface, des facteurs de transcription ou des molécules sécrétées), cytométrie de flux s’est imposé comme l’outil le plus puissant pour l’immunophénotypage, en raison de la faible coût et haut débit.

L’utilisation de techniques de l’immunophénotypage dépend étroitement de l’élaboration de protocoles de digestion efficace permettant une analyse simple des cellules d’un grand nombre de cellules. L’élaboration de protocoles exhaustifs d’extraction de cellule a ouvert une nouvelle fenêtre d’opportunités dans l’étude de l’immunologie cardiaque. Grâce à la combinaison de la digestion, cytométrie en flux et transcriptomique, les principales populations des macrophages et des cellules dendritiques qui résident au cœur ont été caractérisées^2,3. La population plus abondante de cellules immunitaires cardiaques pendant l’état d’équilibre sont CD64⁺⁺ de MerTK macrophages, qui peuvent être encore divisés basés sur leur expression de CCR2 ou CD11c². CCR2⁺ macrophages proviennent de la moelle osseuse adulte hématopoïèse, tandis que la majorité des CCR2^– macrophages, qui peuvent exprimer des niveaux élevés ou faibles de MHC-II, sont principalement d’origine prénatale. Macrophages des fonctions clés telles que la réparation⁴ et l’élimination des débris⁵ lors des blessures ou soutenir la connectivité électrique⁶ en état stationnaire. Au cours de différentes formes d’inflammation un afflux important de Ly6C^Salut MHC-II^lo CD64^int monocytes se produisent, qui plus tard se différencient en Ly6C^Salut CCR2⁺ macrophages^2,7 . Une population beaucoup plus petite, mais importante, de cellules résidant dans le myocarde des individus en bonne santé est composée de cellules dendritiques^8,9. Les deux grands sous-ensembles de MDD classiques cardiaque (CDC) ont été récemment caractérisées : cDC1 (CD103⁺ DCs) et cDC2 (CD11b⁺ DCs). Contrôleurs de domaine jouent un rôle important dans la défense contre l’infection⁸ mais peuvent aussi favoriser automutilation lors d’une inflammation, particulièrement au cours de l’infarctus du myocarde,⁹.

Nous décrivons ici une méthode simple pour l’isolement de cellules immunitaires cardiaques viables du myocarde de souris. La méthode combine la digestion enzymatique et mécanique avec une filtration de cellule-crépine afin d’obtenir une suspension de cellule unique qui peut être analysée, ou encore purifiée, par écoulement cytometry tri ou enrichissement des billes magnétiques. Des mesures précises de cellules myocardiques extravasculaires exigent la perfusion cardiaque afin d’éliminer les contaminants possibles de la circulation sanguine de la microcirculation cardiaque. En outre, nous présentons une étape facultative de l’étiquetage intravasculaire des cellules immunitaires qui peuvent être utilisés pour différencier plus loin cellules myocardiques de contaminants intravasculaires, basés sur la Galkina al protocole¹⁰. Enfin, nous présentons une analyse de cytométrie de flux de base pour identifier les sous-populations majeures de macrophage et cDC.

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Protocole

Déclaration d’éthique : ce protocole a été examiné et approuvé par le Comité de protection de l’Animal à l’University Health Network (Toronto, Canada) et est en conformité avec le Conseil canadien de protection des animaux.

1. préparation de la mémoire tampon

1. Préparer le tampon de l’HEXABROMOBIPHÉNYLE (de Hank Balanced Salt Solution (HBSS), sérum de chaleur 2 % inactivé, 0,2 % d’albumine sérique bovine). Ajouter 10 mL de chaleur inactivé sérum bovin et 1 g d’albumine de sérum bovin à 500 mL de HBSS. Filtre à stériliser à travers un 0,2 µm et conserver à 4 ° C.
2. Préparer le tampon de FACS (tampon Phosphate salin (PBS), 2 % chaleur inactivé de sérum bovin, 1 mM de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA, pH 8,0)). Ajouter 10 mL chaleur inactivé sérum bovin et 1 mL d’EDTA 0,5 M à 500 mL de PBS. Filtre à stériliser à travers un 0,2 µm et conserver à 4 ° C.
   Remarque : Les Solutions peuvent être stockées à 4 ° C pendant environ 1 mois.

2. étiquetage des leucocytes circulants

1. Aseptiquement préparer injection de CD45 anti-souris avec 1 µg d’anticorps dilué dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour un volume d’injection final de 200 µL/souris. Charger le volume dans une seringue à insuline 28,5 G et conserver à l’abri de la lumière.
   Remarque : Utilisez deux anticorps anti-CD45 différents marqués au fluorochrome afin de différencier les intravasculaire (colorées par l’administration i.v.) de la coloration intracardiaque (Taché après digestion ; Voir l’étape 4).
2. Réchauffez la souris (âgés de 8 à 12 semaines) en exposant la queue à une lampe rouge pendant 5 min.
   ATTENTION : Ne pas surchauffer l’animal. Garder la lampe à une distance suffisante (> 30 cm).
   1. Retenir l’animal en position sternale à l’aide d’un dispositif approprié. Exposer et à stabiliser la queue avec la main non dominante en immobiliser la base de la queue avec l’index et le majeur et le milieu-partie distale de la queue entre le pouce et l’annulaire.
      ATTENTION : N’appliquez pas trop de force à l’extrémité de la queue, car la peau peut être retirée. Introduire l’aiguille avec le biseau vers le haut dans la veine. Tenir l’aiguille parallèle à la veine en permanence, car elle est facile à ponctionner la veine.
      NOTE : Sang dans la seringue peut survenir et est le signe d’une bonne injection. Courbure de l’aiguille à un angle de 90° peut faciliter l’administration i.v.. Confirmez avec votre bureau de la sécurité comme flexion aiguilles peuvent représenter un danger.
   2. Injecter par voie intraveineuse des 200 µL dans la veine caudale. Le fluide doit circuler facilement et désactivez temporairement la veine.
      ATTENTION : Ne pas forcer le fluide en cas de résistance. C’est signe de mauvais placement de l’aiguille.
   3. Permettre aux anticorps de circuler pendant 5 min avant d’euthanasier humainement les souris.

3. coeur d’isolement et la Digestion

1. Euthanasier la souris à l’aide de CO₂ ou par toute autre procédure d’euthanasie acceptée sur le plan institutionnel.
   1. CO₂ euthanasie, placez votre souris dans la chambre de CO₂ et fixer le taux de remplissage à 20 % du volume chambre / minute (c'est-à-dire, si la chambre est de 10 L, verser à 2 L/min). Fonctionner pendant 2 min et moniteur de la souris jusqu'à ce que la respiration a cessé.
   2. Coupez le CO₂ et laisser la souris pendant une supplémentaire 1-2 min. Vérifiez la respiration a cessé avant d’ouvrir la chambre et une pincée d’orteil pour confirmer que la souris est morte avant de procéder au traitement de la souris.
2. Vaporiser la souris avec l’éthanol à 70 %. Soulever la peau et à l’abdomen et disséquer la souris en coupant le long le début de la ligne médiane ventrale au niveau des hanches jusqu’au sternum. Ouvrir l’abdomen et déplacer le foie pour exposer le diaphragme.
3. Couper le diaphragme, puis les côtes des deux côtés de la ligne médiane, en veillant à éviter de perforer les poumons et le cœur.
   1. Exposer au cœur de peeling en arrière les côtes, puis première coupe, l’oreillette gauche suivie de l’oreillette droite.
      ATTENTION : Soyez prudent lorsque vous coupez les oreillettes, assurant sans artères ou des veines sont blessés, comme cela peut diminuer l’efficacité du rinçage du sang contenu dans les organes.
   2. Perfuse le coeur avec 15 à 20 mL de PBS froid à l’aide d’une seringue de 60 mL, munie d’une aiguille de 21 G et PBS froid. Doucement, saisir la base du coeur avec une pince et insérer l’aiguille dans le ventricule gauche près de l’apex. Répéter la procédure dans le ventricule droit. Une bonne injection entraîne blancs poumons et foie pâle.
      Remarque : La Perfusion doit être effectuée dans les 5 minutes après l’euthanasie afin d’éviter la coagulation du sang, qui peut contaminer les organes d’intérêt avec des cellules circulantes.
4. Tenir la base du coeur avec une pince et tirez le cœur doucement, puis détachez le cœur en coupant les grandes artères pulmonaires et veines, aorte et le sac péricardique.
   1. Nettoyer le cœur en appuyant doucement le cœur entre le pouce et les doigts index dans une serviette en papier propre non pelucheux et retirer les oreillettes et les vestiges des grandes artères et les veines et tout autre contaminant avec une pince.
      Remarque : S’assurer que l’intégralité des oreillettes est retirée et aucune autres tissus, comme les poumons ou les vaisseaux sanguins, ne sont présents, car ces tissus ont leurs propres cellules immunitaires résidents. En particulier, le poumon a une population de grandes cellules immunitaires qui peut masquer les plus petites populations de ceux dans le myocarde.
5. Place le coeur dans un plat en plastique de 5 cm à 50 µL de PBS froid.
   1. Émincer le cœur à l’aide de ciseaux de dissection courbées jusqu'à ce qu’il n’y a aucune pièces visibles et il a une consistance lisse.
      NOTE : Essayer de garder le coeur dans une zone restreinte du plat pendant pour minimiser la perte de tissu à découper.
   2. Transfert thetrituratedheart le tissu avec une pincette courbée dans tube de microcentrifuge de 2 mL avec 800 µL froid de Dulbecco modifié Eagle (DMEM).
6. Ajouter 450 U/mL ofcollagenase, I, 60 U/mL de type I-S de l’hyaluronidase et 60 U/mL de DNase-j’ai à chaque échantillon.
   1. Incuber les échantillons à 37 ° C sur un agitateur basculant à 50 tr/min pendant 45 à 60 min.
7. Après digestion, brièvement les échantillons de vortex (20 s) et placer immédiatement sur la glace pour conserver les échantillons à 4 ° C.
   1. Aide d’une pipette de 1 mL, pipette échantillons de haut en bas jusqu'à ce que des échantillons de tissus sont homogènes et ne pas boucher l’embout de la pipette.
      Remarque : Définir un certain nombre de fois à la pipette peut augmenter de reproductibilité. Si les cœurs ne sont pas digérées de façon optimale, les morceaux du myocarde peuvent gêner la pipette. Meuler doucement l’embout de la pipette contre le tube de microcentrifuge aidera à homogénéiser les plus grands morceaux de tissu.
8. Pré humide une passoire de cellule 40 µm placé sur un tube conique de 50 mL avec 1 mL d’HEXABROMOBIPHÉNYLE froid.
   1. Ajouter l’échantillon homogénéisé au filtre et laver à travers en versant lentement 12 – 14 mL d’HEXABROMOBIPHÉNYLE froid.
   2. Transférer les échantillons filtrés dans un tube conique marqué 15 mL et conserver à 4 ° C.
9. Centrifuger les échantillons à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C. Aspirer au large de surnageant.
   1. Lyse des globules rouges en ajoutant 1 mL de tampon de lyse de chlorure d’Ammonium-Potassium (ACK) pour chaque échantillon. Remettre en suspension les échantillons au vortex et incuber à température ambiante pendant 5 min.
   2. Une fois terminée la lyse, ajouter 5 à 8 mL de Hank froid équilibré sel Solution (HBSS) pour arrêter l’hémolyse.
10. Centrifuger les échantillons à 400 x gfor 5 min à 4 ° C. Aspirer au large de surnageant.
11. Ajouter 1 mL de tampon de FACS pour chaque échantillon et le transférer dans un tube de microcentrifuge marqués de 1,5 mL.
    Remarque : Le protocole peut être suspendu ici pendant 2 h avec échantillons stockés à 4 ° C.

4. flow Cytometry coloration et analyse

1. Centrifuger les échantillons à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C.
   1. Afin de réduire la liaison des anticorps non-spécifiques, diluer au 1/100 anti-CD16/CD32 et bloqueur de Monocyte (01:20) comptabilité (voir Table des matières) pour 50 µL FACS par échantillon. Incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
   2. Préparer la comptabilité de dilution (1/250 pour chacun des anticorps) d’anticorps pour 50 µL de FACS par échantillon.
      Remarque : Un colorant de viabilité peut figurer dans l’anticorps cocktail afin d’exclure les cellules mortes. Exclusion de petite taille par analyse en flux peut également être utilisé (Figure 1C et D).
   3. Sans laver, ajouter 50 µL du mélange maître anticorps pour chaque échantillon et mélanger.
   4. Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 30 min à l’obscurité.
2. Ajouter 600 µL FACS dans chaque échantillon pour laver et centrifuger les échantillons à 400 x g pendant 5 min à 4 ° C.
3. Aspirer au large de surnageant et Resuspendre le culot dans 300 µL FACS. Conserver les échantillons à 4 ° C dans l’obscurité.
   Remarque : Certains colorants de viabilité, tels que DAPI, nécessitent coloration moins de 10 min avant l’exécution de cytométrie en flux.
4. Analyse par cytométrie de flux (voir Figures 1 et 2) au cours des 3 prochaines heures. Si un temps plus long est requis, à court terme fixation à l’aide d’un paraformaldéhyde à faible concentration (0,5 à 1 % dans du PBS) est recommandé pour préserver la coloration.
   Remarque : Il est fortement recommandé pour filtrer les échantillons à travers un tamis de cellule de 40 µm avant analyse en cytométrie en flux initier afin d’éviter l’obstruction de la fluidique du cytomètre en flux.

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Résultats

A ce jour, aucune bonne méthode n’a été conçu pour isoler les cellules immunitaires des autres composantes de la cellule cardiaque, tels que les cardiomyocytes. Donc, analyse de la suspension de la cellule cardiaque par cytométrie nécessite un pré déclenchement avec CD45 afin d’identifier les populations de cellules immunitaires, suivies de la cellule unique et depetite taille exclusion gating (Figure 1A). Par ailleurs, une colora...

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Discussion

Inflammation du myocarde, ou myocardite, est une caractéristique des maladies cardiovasculaires plus. Toutefois, le myocarde n’est pas dépourvue de ses propres composantes immunitaires dans les États non-maladie. Pendant l’état d’équilibre, beaucoup de cellules immunitaires se trouvent dans le myocarde et jouent le rôle essentiel de l’entretien et la protection. La caractérisation de ces diverses populations de cellules n'aurait pas été possible sans les méthodes telles que celle présentée dans le pr?...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755