Isolierung und Identifizierung von Extravascular Immunzellen des Herzens

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Methode, um zu isolieren, Identifikation und Quantifizierung von Immunzellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von Mäusen im Steady-State oder Entzündungen. Das Protokoll kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung zur Erzeugung einer einzelnen Zelle Suspension, die weiter durch Durchflusszytometrie analysiert werden können.

Zusammenfassung

Das Immunsystem ist ein wesentlicher Bestandteil eines gesunden Herzens. Der Herzmuskel ist Heimat einer reichen Bevölkerung von verschiedenen Immunzellen Teilmengen mit funktionaler Aufteilung bei Steady-State und bei verschiedenen Formen von Entzündungen. Bis vor kurzem das Studium der Immunzellen im Herzen erforderte den Einsatz der Mikroskopie oder schlecht entwickelte Verdauung Protokolle, genügend Sensibilität während einer schweren Entzündung aber konnten nicht sicher identifizieren kleine-aber wichtige-Populationen von Zellen im Steady-State. Hier diskutieren wir eine einfache Methode kombinieren enzymatische (Kollagenase, Hyaluronidase und DNAse) und mechanische Verdauung der murinen Herzen vorangestellt intravaskulärer Verabreichung von eindringmittel radioaktiv markierten Antikörper gegen kleine unterscheiden aber unvermeidbar intravaskulären Zelle Verunreinigungen. Diese Methode erzeugt eine Aussetzung der isolierten lebensfähige Zellen, die durch Durchflusszytometrie zur Identifikation, Phänotypisierung und Quantifizierung analysiert oder weiter gereinigt mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung oder magnetischer Wulst Trennung für werden können transkriptionelle Analyse oder in-vitro- Studien. Wir sind ein Beispiel für eine schrittweise durchflusszytometrischen Analyse der wichtigsten Makrophagen und dendritischen Zellpopulationen des Herzens zu unterscheiden. Für eine mittlere Größe Experiment (10 Herzen) erfordert der Abschluss des Verfahrens 2 – 3 h.

Einleitung

Verschiedene Formen der myokardialen Stress oder Verletzungen, einschließlich ischämische (Ischämie Reperfusion oder Myokardinfarkt) und nicht-ischämische (Hypertonie oder Myokarditis), fördern die Einstellung von Entzündungszellen mit reparative und schützend, sondern auch pathogenen Eigenschaften. Bereits im Jahr 1891, beschrieben Romberg erstmals das Vorhandensein von zellulären Infiltrate im Herzmuskel von Patienten mit Typhus und Scharlach¹. Jedoch erforderlich der Detailstudie des kardialen Immunzellen die Entwicklung von fortgeschrittenen Immunphänotypisierung Techniken. Infolgedessen haben wir erst vor kurzem begonnen zu verstehen, dass eine vielfältige Bevölkerung von Immunzellen mit notwendigen Wartungs-Rollen während der Steady-State innerhalb der Herzmuskel befindet.

Histologie wurde und immer noch ist, die am häufigsten verwendete Methode, kardiale Immunzellen während einer Entzündung zu charakterisieren. Während Histologie ein wertvolles diagnostisches Instrument darstellt, hat seine Verwendung in der Studie von kardialen Immunzellen jedoch wichtige Einschränkungen. Die Immunzellen mit Wohnsitz im Myokard stellen einen sehr kleinen Teil der gesamten Zellen und sind mehr oder weniger gleichmäßig verteilt in einem verhältnismäßig großen Raum. Ähnlich, zeigen verschiedene Formen der kardialen Entzündung, wie virale Myokarditis, fokale Muster der Entzündung. Dies bedeutet, dass die genaue Analyse des Immunsystems des Herzens erfordern oft höhere Grade der histologischen Probenahme, Erhöhung der Kosten um Verzerrungen zu reduzieren. Darüber hinaus bietet die Histologie eine sehr begrenzte Menge von brauchbaren Informationen in Zelle Identifikation (z.B. Anzahl der Parameter). Mit einer ständig wachsenden Zahl der Zelle Teilmengen, die mehrere Ausdruck Marker (einschließlich oberflächenmarker, Transkriptionsfaktoren oder abgesondert Moleküle) erfordert, hat sich Durchflusszytometrie als das mächtigste Werkzeug für die Immunphänotypisierung etabliert, aufgrund der Low-Cost und hohem Durchsatz.

Die Immunphänotypisierung Techniken richtet sich eng an der Entwicklung von effizienten Verdauung-Protokolle, die für einzelne Zellen Analyse einer großen Anzahl von Zellen erlaubt. Die Entwicklung der ausführliche Protokolle der Zelle Extraktion eröffnet ein neues Fenster der Möglichkeiten in der Studie von kardialen Immunologie. Durch die Kombination von Verdauung, Durchflusszytometrie und Transkriptom wurden die großen Populationen von Makrophagen und dendritischen Zellen, die ihren Wohnsitz im Herzen zeichnet sich^2,3. Die am häufigsten vorkommende Bevölkerung von kardialen Immunzellen im Steady-State sind CD64⁺⁺ MerTK Makrophagen, die weiter unterteilt werden können, basierend auf ihren Ausdruck CCR2 oder CD11c². CCR2⁺ Makrophagen stammen aus Erwachsenen Knochenmark Hämatopoese, während die Mehrheit des CCR2^– Makrophagen, die hohe oder niedrige Niveaus des MHC-II zum Ausdruck bringen können, sind vor allem pränatalen Ursprungs. Makrophagen führen Sie wichtige Funktionen wie Reparatur⁴ und Entfernung von Schmutz⁵ bei Verletzungen oder elektrische Verbindungstechnik⁶ im Steady-State zu unterstützen. Während verschiedene Formen von Entzündungen ein wichtige Zustrom von Ly6C^Hallo MHC-II^lo CD64^Int Monozyten auftreten, zu unterscheiden, die später in Ly6C^Hallo CCR2⁺ Makrophagen^2,7 . Eine deutlich kleinere, aber wichtige Population von Zellen, die ihren Wohnsitz im Myokard von gesunden Personen besteht aus dendritischen Zellen^8,9. Die zwei großen Teilmengen von kardialen herkömmlichen DCs (cDCs) wurden vor kurzem charakterisiert: cDC1 (CD103⁺ DCs) und cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs eine wichtige Rolle in der Verteidigung gegen Infektion⁸ aber auch Selbstverletzung während einer Entzündung, besonders bei Myokardinfarkt⁹fördern können.

Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Isolierung von lebensfähigen kardiale Immunzellen aus Maus Myokard. Die Methode kombiniert mechanische und enzymatische Verdauung mit Zelle-Sieb Filtration um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten, die analysiert oder durch Flow Cytometry sortieren oder magnetischer Wulst Bereicherung weiter gereinigt werden können. Genaue Messungen der extravascular Herzmuskelzellen erfordern kardialen Durchblutung um mögliche Verunreinigungen aus dem Blutkreislauf der kardiologische Microvasculature zu entfernen. Darüber hinaus präsentieren wir Ihnen einen optionalen Schritt des intravaskulären Kennzeichnung von Immunzellen, die verwendet werden, um weitere Herzmuskelzellen intravaskulären Verunreinigungen, basierend auf der Galkina Et Al. Protokoll¹⁰unterscheiden. Schließlich präsentieren wir eine grundlegende Flow Cytometry Analyse Ermittlung die wichtigsten Subpopulationen von Makrophagen und cDC.

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Protokoll

Ethik-Anweisung: Dieses Protokoll wurde überprüft und genehmigt Animal Care auf vom Ausschuss des University Health Network (Toronto, Kanada) und ist in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care.

1. Puffer Vorbereitung

1. HBB Puffer (Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS), 2 % Hitze inaktiviert Rinderserum, 0,2 % Rinderserumalbumin) vorzubereiten. Fügen Sie 10 mL Hitze Rinderserum und 1 g Rinderserumalbumin, 500 mL HBSS inaktiviert. Filter durch einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
2. Bereiten Sie FACS-Puffer (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS), 2 % Hitze inaktiviert Rinderserum, 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA, pH 8,0)). Fügen Sie 10 mL Hitze Rinderserum und 1 mL 0,5 M EDTA bis 500 mL PBS inaktiviert. Filter durch einen 0,2 µm-Filter zu sterilisieren und Lagerung bei 4 ° C.
   Hinweis: Lösungen können bei 4 ° C bis zu 1 Monat aufbewahrt werden.

(2) Kennzeichnung des zirkulierenden Leukozyten

1. Aseptisch bereiten Sie Anti-Maus CD45 Injektion mit 1 µg des Antikörpers in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für eine endgültige Injektionsvolumen von 200 µL/Maus verdünnt. Ladevolumen in eine 28,5 G Insulin Spritze und Licht fernhalten.
   Hinweis: Verwenden Sie zwei verschiedene Fluorochrom-markierte Anti-CD45 Antikörper um den intravaskulären (gefärbt durch intravenöse Verabreichung) Die intrakardiale Färbung unterscheiden (gebeizt nach der Verdauung, siehe Schritt 4).
2. Wärmen Sie indem man die Rute zu einer roten Wärmelampe für 5 min es Mäuse (8 – 12 Wochen alt vor).
   Achtung: Überhitzen Sie das Tier nicht. Halten Sie die Lampe in einem sicheren Abstand (> 30 cm).
   1. Zurückhalten Sie das Tier in der sternalen Position mithilfe eines entsprechenden Geräts. Setzen Sie aus und stabilisieren Sie das Heck mit der nichtdominanten Hand durch Immobilisierung der Schwanzwurzel mit den Zeige- und Mittelfinger und der Mitte distalen Region der Schwanz mit Daumen und Ringfinger.
      Achtung: Beziehen Sie zuviel Kraft an der Spitze der Rute nicht, wie die Haut abgezogen werden kann. Stechen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in die Vene. Halten Sie die Nadel parallel zu der Vene zu allen Zeiten, da es leicht zu durchstechen die Vene.
      Hinweis: Blut in die Spritze gelangen können auftreten und ist ein Zeichen für eine gute Injektion. Biegen die Nadel in einem Winkel von 90° kann intravenös zu verabreichenden Verwaltung erleichtern. Bestätigen Sie mit Ihrer Sicherheit Büro wie Biege Nadeln eine Gefahr darstellen können.
   2. Injizieren Sie 200 µL intravenös in die Rute Vene. Die Flüssigkeit sollte leicht fließen und deaktivieren Sie vorübergehend die Vene.
      Achtung: Nicht mit Gewalt Flüssigkeit im Widerstand erfüllt ist. Dies ist Zeichen für Abhandenkommen der Nadel.
   3. Lassen Sie Antikörper für 5 min vor menschlich euthanizing Maus zirkulieren.

3. Herz zu isolieren und die Verdauung

1. Mäuse mit CO₂ einschläfern oder durch andere Verfahren institutionell anerkannte Euthanasie.
   1. Platzieren Sie für CO₂ Euthanasie den Mauszeiger in der CO₂ -Kammer und die Füllrate auf 20 % des kammervolumens pro Minute (d. h., wenn die Kammer 10 L, Füllung bei 2 L/min). Führen Sie für 2 min und Monitor Maus bis Atmung aufgehört hat.
   2. Schalten Sie die CO₂ und lassen Sie die Maus für eine zusätzliche 1-2 min. sicher atmen aufgehört hat, vor dem Öffnen der Kammers und führen ein Zeh Kneifen um zu bestätigen, dass die Maus tot bevor Sie mit die Maus zu verarbeiten ist.
2. Sprühen Sie die Maus mit 70 % Ethanol. Heben Sie die Haut am Bauch und sezieren Sie die Maus durch Schnitt entlang der ventralen Mittellinie Anfang auf der Ebene von der Hüfte bis zum Brustbein. Öffnen Sie den Bauch und bewegen Sie die Leber, das Zwerchfell verfügbar zu machen.
3. Schneiden Sie die Membran dann die Rippen auf beiden Seiten der Mittellinie, wobei Sie darauf achten, um zu vermeiden, Punktion, Lunge und Herz.
   1. Expose das Herz durch Peeling damals die Rippen, schneiden zuerst die linken Vorhöfen gefolgt von den rechten Herzvorhof.
      Achtung: Seien Sie vorsichtig beim Schneiden die Vorhöfe, sicherzustellen, dass keine Arterien oder Venen verletzt werden, da dies die Effizienz der Spülung des Blutes in die Organe enthalten verringern kann.
   2. Durchspülen Sie das Herz mit 15 – 20 mL kaltem PBS mit einer 60 mL-Spritze mit einer Nadel 21 G ausgestattet und kaltem PBS. Vorsichtig fassen Sie die Basis des Herzens mit der Zange und Stechen Sie die Nadel in die linke Herzkammer in der Nähe der Spitze. Wiederholen Sie den Vorgang in der rechten Herzkammer. Eine korrekte Injektion führt zu weißen Lunge und Leber blass.
      Hinweis: Perfusion sollte durchgeführt werden innerhalb von 5 Minuten nach Sterbehilfe zur Vermeidung Blutgerinnung, die die Organe des Interesses mit zirkulierenden Zellen verunreinigen können.
4. Halten Sie die Basis des Herzens mit der Pinzette und sanft hochziehen Sie das Herz, dann lösen Sie mitten durch Schneiden die großen Lungenarterien und Venen, Aorta und der Herzbeutel Plünderung zu.
   1. Das Herz sanft halten das Herz zwischen Daumen und Zeigefinger in einem sauberen fusselfreien Papiertuch zu reinigen und die Vorhöfe und die Reste der großen Arterien und Venen und andere Verunreinigungen mit einer Pinzette abziehen.
      Hinweis: Stellen Sie sicher die Gesamtheit der Vorhöfe wird entfernt und keine andere Gewebe wie die Lunge oder Blutgefäße, vorhanden sind, da diese Gewebe ihre eigenen Wohnsitz Immunzellen haben. Die Lunge hat insbesondere eine großen Immunzelle Bevölkerung, die die kleinere Populationen innerhalb der Herzmuskel überdecken kann.
5. Legen Sie das Herz in einer 5 cm Plastikschale mit 50 µL kaltem PBS.
   1. Hacken Sie die Herzen mit gebogenen sezierenden Schere bis gibt es keine sichtbaren Stücke und es eine weiche Konsistenz hat.
      Hinweis: Versuchen Sie, das Herz in einem geschlossenen Bereich der Schale zu halten, beim Häckseln um Gewebeverlust zu minimieren.
   2. Thetrituratedheart Gewebe mit gebogenen Pinzette in 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 800 µL kalter Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM) zu übertragen.
6. Hinzufügen von 450 U/mL Ofcollagenase I, 60 U/mL von Hyaluronidase Typ I-S und 60 U/mL der DNase-ich zu jeder Probe.
   1. Inkubieren Sie Proben bei 37 ° C auf einen rockigen Shaker bei 50 u/min für 45 – 60 min.
7. Nach der Verdauung, kurz Wirbel Proben (20 s) und sofort auf Eis, Proben bei 4 ° c zu halten
   1. Mit Hilfe einer 1 mL-Pipette, pipette Proben rauf und runter bis Gewebeproben homogen sind und die PIPETTENSPITZE nicht verstopfen.
      Hinweis: Definieren eine bestimmte Anzahl von Wiederholungen, pipette kann Reproduzierbarkeit erhöhen. Wenn das Herz nicht optimal verdaut werden, können Teile des Myokard die Pipette behindern. Die PIPETTENSPITZE gegen den Microcentrifuge Schlauch vorsichtig Schleifen hilft, größere Stücke des Gewebes zu homogenisieren.
8. Vornässen Sie 40 µm Zelle Sieb auf ein 50 mL konische Röhrchen mit 1 mL kalte HBB gelegt.
   1. Der Filter homogenisierten Probe hinzu und langsam gießen 12 – 14 mL kalte HBB durch Waschen.
   2. Gefilterten Proben auf einem gekennzeichneten 15 mL konische Rohr übertragen und bei 4 ° c halten
9. Zentrifuge Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie überstand.
   1. Lyse von Erythrozyten durch Zugabe von 1 mL der Ammonium-Chlorid-Kalium (ACK) Lysis Puffer für jede Probe. Aufschwemmen Sie Proben durch aufschütteln und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
   2. Wenn Lyse abgeschlossen ist, fügen Sie 5 – 8 mL des kalten Hank ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Hämolyse zu stoppen.
10. Zentrifugieren Sie Proben auf 400 X Gfor 5 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie überstand.
11. Fügen Sie 1 mL der FACS-Puffer zu jeder Probe und Transfer zu einem gekennzeichneten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    Hinweis: Das Protokoll kann hier bis zu 2 h mit Proben bei 4 ° c gelagert pausiert werden

(4) flow Cytometry Färbung und Analyse

1. Zentrifuge Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° C.
   1. Um unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren, zu verdünnen, 1: 100 Anti-CD16/CD32 und Monocyte-Blocker (01:20) (siehe Tabelle der Materialien) Bilanzierung von 50 µL FACS pro Probe. Bei Raumtemperatur für 15 min inkubieren.
   2. Bereiten Sie den Antikörper-Verdünnung (1: 250 für jeden Antikörper) entfielen 50 µL FACS pro Probe.
      Hinweis: Ein Lebensfähigkeit Farbstoff kann in der Antikörper cocktail aufgenommen werden, um abgestorbene Zellen auszuschließen. Alternativ kann die geringe Größe Ausschluss durch Flow-Analyse verwendet (Abbildung 1C und D).
   3. Ohne Waschen, fügen Sie 50 µL Antikörper-master-Mix zu jeder Probe und mischen.
   4. Inkubieren Sie Proben bei 4 ° C für 30 Minuten im Dunkeln.
2. Jede Probe zu waschen und Zentrifugieren Sie Proben bei 400 X g für 5 min bei 4 ° c fügen Sie 600 µL FACS hinzu
3. Aspirieren Sie überstand und aufzuwirbeln Sie Pellet in 300 µL FACS. Halten Sie Proben bei 4 ° C im Dunkeln.
   Hinweis: Einige Lebensfähigkeit Farbstoffe, wie z. B. DAPI, erfordern Färbung innerhalb von 10 min vor dem Ausführen der Durchflusszytometrie.
4. Analysieren von Durchflusszytometrie (siehe Abbildungen 1 und 2) innerhalb der nächsten 3 h. Wenn eine längere Zeit erforderlich, kurzfristigen Fixierung mit einer niedrigen Konzentration Paraformaldehyd ist (0,5 – 1 % mit PBS-Puffer) wird empfohlen, die Färbung zu erhalten.
   Hinweis: Es wird empfohlen, um Proben durch ein 40 µm Zelle Sieb vor initiieren Flow Cytometry Analyse zu filtern, zur Vermeidung von Verstopfung der Fluidik das Durchflusszytometer.

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Ergebnisse

Bislang wurde keine gute Methode entwickelt, um Immunzellen von anderen Herzmuskelzellen Bestandteilen, wie Kardiomyozyten zu isolieren. Daher erfordert eine Analyse der einzelnen Herzmuskelzellen Suspension durch Durchflusszytometrie Pre Anspritzung mit CD45, die immun Zellpopulationen, gefolgt von Einzelzellen und geringen Größe Ausgrenzung gating (Abb. 1A) zu identifizieren. Alternativ kann eine Lebensfähigkeit Färbung durchgeführt we...

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Diskussion

Myokardiale Entzündung oder Herzmuskelentzündung (Myokarditis), ist ein Merkmal der meisten Herz-Kreislauf-Krankheiten. Der Herzmuskel ist jedoch nicht frei von eigener immun Komponenten in Krankheitszuständen. Im Steady-State viele Immunzellen befinden sich im Myokard und spielen die wesentliche Rolle der Wartung und Schutz. Die Charakterisierung dieser vielfältigen Populationen von Zellen wäre nicht möglich ohne Methoden wie dem präsentiert in diesem Protokoll gewesen.

Eine Kombinatio...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755