Isolamento e identificação de células do sistema imunológico Extravascular do coração

Resumo

Este protocolo apresenta um método simples e eficiente de isolar, identificar e quantificar as células imunes que residem no miocárdio de ratos durante o estado estacionário ou inflamação. O protocolo combina digestão enzimática e mecânica para a geração de uma suspensão de célula única que pode ser mais analisada por citometria de fluxo.

Resumo

O sistema imunológico é um componente essencial de um coração saudável. O miocárdio é lar de uma população rica de subconjuntos de células imunes diferentes com compartimentalização funcional tanto durante o estado estacionário e diferentes formas de inflamação. Até recentemente, o estudo de células do sistema imunológico no coração exigido o uso da microscopia ou protocolos de digestão mal desenvolvidos, que forneceu suficiente sensibilidade durante inflamação grave, mas com confiança não foram capazes de identificam pequenas — mas chave — populações de células durante o estado estacionário. Aqui, vamos discutir um método simples que combina enzimática (colagenase, hialuronidase e DNAse) e digestão mecânica de corações murino precedidas pela administração intravascular de fluorescente etiquetado anticorpos para diferenciar pequenas mas inevitável contaminantes de célula intravascular. Este método gera uma suspensão de células viáveis isoladas que podem ser analisados por citometria de fluxo para identificação, fenotipagem e quantificação, ou ainda mais purificado com fluorescência-ativado da pilha classificação ou separação magnética do grânulo para estudos de análise ou em vitro transcricionais. Nós incluímos um exemplo de uma análise de cytometric do fluxo passo a passo para diferenciar o macrófago chave e populações de células dendríticas do coração. Para uma experiência de tamanho média (10 corações) a conclusão do procedimento requer 2 a 3 h.

Introdução

Diferentes formas de stress do miocárdio ou acidentes, inclusive isquêmica (reperfusão de isquemia ou infarto do miocárdio) e não-isquêmica (hipertensão ou miocardite), promover o recrutamento de células inflamatórias com reparadora e protetora, mas também Propriedades de patogenicidade. Logo em 1891, Romberg descrita pela primeira vez a presença de celulares se infiltra no miocárdio de pacientes infectados com tifo e febre escarlatina¹. No entanto, o estudo detalhado de células do sistema imunológico cardíacas necessária ao desenvolvimento de técnicas mais avançadas de immunophenotyping. Como consequência, somente recentemente nós começaram a entender que uma população diversa de células do sistema imunológico com funções essenciais de manutenção durante o estado estacionário reside dentro do miocárdio.

Histologia tem sido e ainda é, o método mais comum para caracterizar pilhas imunes cardíacas durante a inflamação. No entanto, enquanto histologia representa uma valiosa ferramenta de diagnóstico, sua utilização no estudo de células do sistema imunológico cardíacas tem limitações importantes. As células imunitárias que residem no miocárdio representam uma proporção muito pequena das células totais e são mais ou menos uniformemente distribuídas em um espaço proporcionalmente imenso. Da mesma forma, várias formas de inflamação cardíaca, tais como miocardite viral, apresentam padrões focais de inflamação. Isto significa que uma análise precisa do sistema imunológico do coração muitas vezes exige graus mais elevados de amostragem histológica, aumentando o custo para reduzir o preconceito. Além disso, a histologia fornece uma quantidade muito limitada de informações utilizáveis na identificação de células (por exemplo, o número de parâmetros). Com um número sempre crescente de subconjuntos de célula que exigem o uso de vários marcadores de expressão (incluindo os marcadores de superfície, fatores de transcrição ou moléculas secretadas), citometria de fluxo estabeleceu-se como a ferramenta mais poderosa para immunophenotyping, devido ao baixo custo e alta produtividade.

O uso de técnicas de immunophenotyping é estreitamente dependente do desenvolvimento de protocolos de digestão eficiente que permitiu para análise de single-células de um grande número de células. O desenvolvimento de protocolos exaustivos de extração de célula aberta uma nova janela de oportunidades no estudo da imunologia cardíaca. Através da combinação de digestão, citometria de fluxo e transcriptomics, as grandes populações de macrófagos e células dendríticas, que reside no coração foram caracterizadas^2,3. A população mais abundante de células do sistema imunológico cardíacas durante estado estacionário são CD64⁺MerTK⁺ macrófagos, que podem ser divididos com base na sua expressão de CCR2 ou CD11c². CCR2⁺ macrófagos originam hematopoiese adulta da medula óssea, Considerando que a maioria dos CCR2^– macrófagos, que podem expressar os níveis de altos ou baixos de MHC-II, são principalmente de origem pré-natal. Os macrófagos funções chave como reparo⁴ e remoção de detritos⁵ durante lesão ou suportando conectividade elétrica⁶ em estado estacionário. Durante diferentes formas de inflamação ocorrer um afluxo importante de Ly6C^Oi MHC-II^Eis CD64^int monócitos, que mais tarde se diferenciar em Ly6C^Oi CCR2⁺ macrófagos^2,7 . Uma população significativamente menor, mas importante, de células que residem no miocárdio de indivíduos saudáveis é composta de células dendríticas^8,9. Recentemente foram caracterizados os dois subconjuntos principais de DCs convencionais cardíacas (conjuntos): cDC1 (CD103⁺ DCs) e cDC2 (CD11b⁺ DCs). DCs desempenham um papel importante na defesa contra infecção⁸ mas também podem promover a auto-lesão durante a inflamação, particularmente durante o infarto do miocárdio⁹.

Aqui, descrevemos um método simples para o isolamento das células imunes cardíacas viáveis de miocárdio de rato. O método combina digestão enzimática e mecânica com uma filtração de célula-filtro para obter uma suspensão de célula única que pode ser analisada, ou ainda mais purificada, pela classificação de citometria de fluxo ou enriquecimento magnética do grânulo. Medições precisas de células do miocárdio extravascular necessitam de perfusão cardíaca para remover possíveis contaminantes da corrente sanguínea da microvasculatura cardíaca. Além disso, apresentamos um passo opcional de rotulagem intravascular de células do sistema imunológico que podem ser usadas para diferenciar ainda mais as células do miocárdio de contaminantes intravasculares, com base no protocolo et al Galkina¹⁰. Finalmente, apresentamos uma análise de citometria de fluxo básico para identificar as principais subpopulações de macrófagos e cDC.

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Protocolo

Declaração de ética: Este protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê de cuidado Animal na rede de saúde da Universidade (Toronto, Canadá) e está em conformidade com o Conselho canadense no cuidado Animal.

1. preparação buffer

1. Prepare o tampão HBB (Hank está equilibrado sal solução (HBSS), soro bovino de calor 2% inactivada, 0,2% de albumina de soro bovino). Adicione 10 mL de calor inativada soro bovino e 1 g de albumina de soro bovino de 500 mL de HBSS. Filtro de esterilizar através de um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C.
2. Preparar o tampão de FACS (tampão fosfato salino (PBS), inactivados por calor de 2% de soro bovino, 1mm de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, pH 8.0)). Adicione inactivados por calor de 10ml de soro bovino e 1 mL de EDTA 0,5 M para 500 mL de PBS. Filtro de esterilizar através de um filtro de 0,2 µm e armazenar a 4 ° C.
   Nota: Soluções podem ser armazenadas a 4 ° C por até 1 mês.

2. rotulagem de leucócitos em circulação

1. Assepticamente prepare injeção de CD45 anti-rato com 1 µ g de anticorpo diluído em solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS) para um volume final de injeção de 200 µ l/mouse. Carregar o volume em uma seringa de insulina 28,5 G e manter-se longe da luz.
   Nota: Use dois anticorpos anti-CD45 marcado com fluorocromo diferente a fim de diferenciar o intravascular (manchado através da administração i.v.) a coloração intracardíaco (manchado após digestão; consulte a etapa 4).
2. Pré-aquecer ratos (8-12 semanas de idade), expondo a cauda de uma lâmpada de calor vermelho por 5 min.
   Cuidado: Não superaqueça o animal. Manter a lâmpada a uma distância segura (> 30 cm).
   1. Contenha o animal na posição esternal, utilizando um dispositivo apropriado. Expor e estabilizar o rabo com a mão não dominante por imobilizando a base da cauda com o índice e o dedo médio e região médio-distal da cauda com o polegar e o dedo anelar.
      Atenção: Não aplique demasiada força na ponta da cauda como a pele pode ser puxada para. Introduza a agulha com o bisel voltado para cima na veia. Manter a agulha paralelamente à veia em todos os momentos como é fácil para punção da veia.
      Nota: Introduzir a seringa de sangue pode ocorrer e é um sinal de uma boa injeção. Dobrar a agulha a um ângulo de 90° pode facilitar a administração intravenosa. Confirme com seu escritório de segurança como agulhas dobra podem representar um perigo.
   2. 200 µ l por via intravenosa Injecte na veia da cauda. O líquido deverá fluir facilmente e temporariamente a veia.
      Cuidado: Não force fluido em se encontrar resistência. Isso é sinal de má colocação da agulha.
   3. Permitir que o anticorpo a circular por 5 min antes humanamente eutanásia do mouse.

3. coração isolando e digestão

1. Eutanásia em ratos usando CO₂ ou por outro procedimento de eutanásia institucionalmente aceitos.
   1. Para eutanásia de CO₂ , posicione o mouse na câmara de CO₂ e definir a taxa de preenchimento de 20% do volume da câmara por minuto (ou seja, se a câmara estiver 10L, preenchimento a 2 L/min). Executado por 2 min e monitor do mouse até respiração cessou.
   2. Desligue o CO₂ e deixar o mouse de um adicional 1-2 min. Certifique-se de respiração cessou antes de abrir a câmara e executar uma pitada de dedo do pé para confirmar que o mouse está morto antes de prosseguir para processar o mouse.
2. Pulverize o mouse com etanol a 70%. Levante a pele do abdômen e dissecar o mouse por corte ao longo do início da linha média ventral a nível dos quadris até o esterno. Abrir o abdômen e mover o fígado para expor o diafragma.
3. Corte o diafragma e, em seguida, as costelas de ambos os lados da linha média, tendo o cuidado de evitar perfurar os pulmões e o coração.
   1. Expor o coração por peeling volta as costelas e, em seguida, corte primeiro os átrios esquerdos seguidos dos átrios direito.
      Cuidado: Tenha cuidado ao cortar os átrios, garantindo não artérias ou veias estão lesionadas, como isto pode diminuir a eficiência da lavagem do sangue contido nos órgãos.
   2. Perfundir o coração com 15-20 mL de PBS frio usando uma seringa de 60 mL equipada com uma agulha 21G e PBS frio. Delicadamente, segure a base do coração com fórceps e insira a agulha no ventrículo esquerdo perto do ápice. Repita o procedimento no ventrículo direito. Uma injeção adequada resulta em brancos pulmões e fígado pálido.
      Nota: A perfusão deve ser realizada dentro de 5 minutos após eutanásia para evitar a coagulação do sangue, que pode contaminar os órgãos de interesse com células de circulação.
4. Segurar a base do coração com fórceps e gentilmente puxe o coração, em seguida, desanexar o coração cortando as principais artérias pulmonares e veias, aorta e o saco pericárdico.
   1. Limpar o coração, delicadamente segurando o coração entre o polegar e o dedo indicador em uma toalha de papel limpa fiapos e puxar os átrios e os restos de artérias e veias e de outros contaminantes com fórceps.
      Nota: Certifique-se a totalidade dos átrios é removida e outros tecidos, tais como o pulmão ou dos vasos sanguíneos, estão presentes como estes tecidos têm suas próprias células imunes residentes. O pulmão, em particular, tem uma população de grandes células imunes que pode mascarar as populações menores daqueles dentro do miocárdio.
5. Coloque o coração em um prato de plástico de 5 cm com 50 µ l de PBS frio.
   1. Picar o coração usando tesouras de dissecação curvas até existem pedaços visíveis e tem uma consistência suave.
      Nota: Tente manter o coração em uma área isolada do prato durante a cortar para minimizar a perda de tecido.
   2. Tecido de thetrituratedheart de transferência usando pinça curva para tubo de microcentrifuga de 2 mL com a 800 µ l frio Dulbecco modificado águia médio (DMEM).
6. Adicionar 450 U/mL ofcollagenase I, 60 U/mL de hialuronidase tipo S e 60 U/mL de DNase-I para cada amostra.
   1. Incube as amostras a 37 ° C, num balanço agitador a 50 rpm para 45 – 60 min.
7. Depois da digestão, brevemente amostras de vórtice (20 s) e coloque imediatamente no gelo para manter as amostras em 4 ° C.
   1. Usando uma pipeta de 1 mL, pipete amostras acima e para baixo até que as amostras de tecido são homogêneas e não entupir a ponta da pipeta.
      Nota: A definição de um número específico de vezes para pipetar pode aumentar a reprodutibilidade. Se os corações não são otimamente digeridos, pedaços de miocárdio podem obstruir a pipeta. Moedura suavemente a ponta da pipeta contra o tubo microcentrifuga ajudará a homogeneizar os pedaços maiores de tecido.
8. Pre-molhado um coador de célula 40 µm colocado em um tubo cônico de 50 mL com 1 mL de frio HBB.
   1. Adicionar a amostra homogeneizada para o filtro e lave através de derramando lentamente 12 – 14 mL de frio HBB.
   2. Transferir amostras filtradas para um tubo cônico de 15ml rotulados e manter a 4 ° C.
9. Centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante.
   1. Lyse pilhas de sangue vermelhas, adicionando 1 mL de tampão de lise de amónio-cloreto de potássio (ACK) para cada amostra. Resuspenda as amostras vortexing e incubar a temperatura ambiente por 5 min.
   2. Uma vez que Lise foi concluído, adicione 5 – 8 mL de frio do Hank equilibrado sal solução (HBSS) para parar a hemólise.
10. Centrifugar as amostras na faz 400 x 5 min a 4 ° C. Aspire o sobrenadante.
11. Adicione 1 mL de tampão de FACS para cada amostra e transferir para um tubo de microcentrifugadora rotulados de 1,5 mL.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui para até 2 h com amostras armazenadas a 4 ° C.

4. fluxo Cytometry manchando e análise

1. Centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C.
   1. Para reduzir a ligação de anticorpos inespecíficos, diluir 1: 100 anti-CD16/CD32 e bloqueador de monócitos (01:20) (ver Tabela de materiais) contabilização de 50 µ l FACS, por exemplo. Incube a temperatura ambiente por 15 min.
   2. Prepare a contabilização de diluição (1: 250 para cada anticorpo) Anticorpo de 50 µ l de FACS por amostra.
      Nota: Uma tintura de viabilidade pode ser incluída no coquetel do anticorpo para eliminar as células mortas. Como alternativa, exclusão de tamanho pequeno por análise de fluxo pode ser usado (Figura 1C e D).
   3. Sem lavar, adicione 50 µ l de mistura de mestre de anticorpo para cada amostra e misture.
   4. Incube as amostras a 4 ° C por 30 min no escuro.
2. Adicione 600 FACS µ l de cada amostra para lavar e centrifugar as amostras a 400 x g por 5 min a 4 ° C.
3. Aspire o sobrenadante e ressuspender em 300 µ l FACS. Mantenha as amostras em 4 ° C, no escuro.
   Nota: Alguns corantes de viabilidade, como o DAPI, exigem a coloração dentro de 10 min antes da execução de citometria de fluxo.
4. Análise por citometria de fluxo (ver figuras 1 e 2) dentro da próxima 3h. Se um tempo maior é a fixação necessária, a curto prazo, usando um paraformaldeído de baixa concentração (0,5-1% em PBS) é recomendada para preservar a coloração.
   Nota: É altamente recomendável para filtrar amostras através de um filtro de célula de 40 µm antes da análise de citometria de fluxo iniciar para evitar obstrução do fluidics do citômetro de fluxo.

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Resultados

Até à data, nenhum bom método foi projetado para isolar as células imunes de outros componentes da célula cardíaca, tais como cardiomyocytes. Portanto, análise da suspensão por citometria de fluxo cardíaco única célula requer um pre-gating com CD45 para identificar as populações de células imunes, seguidas por uma única célula e tamanho pequeno exclusão associada (Figura 1A). Alternativamente, uma coloração de viabilidade p...

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Discussão

Inflamação do miocárdio ou miocardite, é uma característica das doenças cardiovasculares mais. No entanto, o miocárdio não é desprovida de seus próprios componentes imunes nos Estados de não-doença. Durante o estado estacionário, muitas células do sistema imunológico residem no miocárdio e desempenham o papel essencial de manutenção e proteção. A caracterização dessas diversas populações de células não teria sido possível sem métodos como o apresentado neste protocolo.

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline	Wisent	311-010-CL	1x PBS
21 G x 1 1/2 (0.8 mm x 40 mm) PrecisionGlide Needle	BD	305167
Hank’s Balanced Salt Solution	Wisent	311-511-CL	1x HBSS
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4503-50G
Bovine serum	Sigma	B9433
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid	BioShop	EDT111
Vacuum filter , 0.2 µm Filtropur V50	Sarstedt	83.1823.001
28 G 1/2 1 cc insulin syringe	BD	329424
60 mL syringe	BD	309653
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Wisent	319-005-CL	1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate
Collagenase I	Sigma	C0130	from Clostridium histolyticum
Hyaluronidase type I-S	Sigma	H3506
DNase-I	Sigma	D4513	from bovine pancreas
Cell strainer, 40 µm Nylon	Falcon	352340
Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer	Lonza	10-546E
Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b	Biolegend	101222	1:250 dilution
APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c	Biolegend	128025	1:250 dilution
APC anti-mouse CD103	Biolegend	121414	1:250 dilution
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c	Biolegend	117334	1:250 dilution
PE anti-mouse Ly-6G	Biolegend	127607	1:250 dilution
Pacific Blue anti-mouse I-Ab	Biolegend	116422	1:250 dilution
FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)	Biolegend	139315	1:250 dilution
PE/Cy7 anti-mouse CD45	Biolegend	103113	1:250 dilution
PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45	Biolegend	103132	1:40 dilution
TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)	Biolegend	101320	1:100 dilution
True-Stain Monocyte Blocker	Biolegend	426101	1:20 dilution
FlowJo V10	TreeStar Inc		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo
Mouse: Batf3-/-	The Jackson Laboratory	JAX: 013755