مقايسة الفائق كالسيوم-التمويه لدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية جليكاين/د-سيرين وغلوتامات

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو تسهيل دراسة نمدا-مستقبلات (نمدار) على نطاق أوسع، والسماح بدراسة آثار مودولاتوري من الجزيئات الصغيرة وتطبيقاتها العلاجية.

Abstract

ن-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (NMDA) (نمدار) تصنف مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك وأدوار حاسمة في التعلم والذاكرة. عطل نمدار، أعرب أما أكثر-أو وكيل-activity الناجم عن الطفرات، تغيير تعبير أو الاتجار أو التعريب، يمكن أن يسهم في العديد من الأمراض، وبخاصة في الجهاز العصبي المركزي. ولذلك، فهم البيولوجيا المستقبلات، فضلا عن تيسير اكتشاف المركبات والجزيئات الصغيرة حاسمة في الجهود المبذولة لمكافحة الأمراض العصبية. النهج الحالي لدراسة المستقبلات لها حدود بما في ذلك انخفاض الإنتاجية والتكلفة العالية وعدم القدرة على دراسة قدراته الفنية نظراً لوجود الضرورة محصرات قنوات للحيلولة دون وساطة نمدار اكسسيتوتوكسيسيتي. بالإضافة إلى ذلك، نظم التحليل القائمة حساسة للتحفيز قبل غلوتامات فقط وتفتقر إلى الحساسية للتحفيز التي جليكاين، يجند المشارك الأخرى نمدار. نقدم هنا، التحليل القائم على اللوحة الأولى مع السلطة الفائق للدراسة مستقبلات NMDA مع حساسية لكلا يغاندس المشارك وغلوتامات د-سيرين/جليكاين. هذا النهج يتيح دراسة التراكيب وحدة فرعية نمدار مختلفة ويسمح الدراسات الفنية للمستقبلات في أوضاع جليكاين-و/أو الحساسة غلوتامات. بالإضافة إلى ذلك، الطريقة لا تتطلب وجود مثبطات خلال القياسات. ويمكن الكشف عن آثار المغيرون allosteric الإيجابية والسلبية مع هذا التحليل والأدوية المعروفة من نمدار تكررت في نظامنا. هذا الأسلوب يتغلب على أوجه قصور الأساليب القائمة، وفعالة من حيث التكلفة. ونحن نعتقد أن هذه التقنية الجديدة سوف تعجل باكتشاف العلاجات للأمراض بوساطة نمدار.

Introduction

مع التقدم الحالي في الطب، ازداد متوسط العمر المتوقع إلى حد كبير؛ ومع ذلك، قد ذلك انتشار الأمراض المرتبطة بالسن. أمراض الجهاز العصبي المركزي (CNS) مثل الفصام والتصلب العضلي الجانبي (المرض)، ومرض الزهايمر ومرض باركنسون، بين أمور أخرى، ليست استثناء، وقد كان المتوقع أن تزيد على مدى العقد القادم^{1، 2 , 3}-خلل مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك المعروف باسم N-الميثيل-د-اسبارتاتي مستقبلات (نمدار) ارتبط بمرض الزهايمر والفصام وإصابات الدماغ الرضية، والسكتة الدماغية، والسكري والزرق بين أمور أخرى، مما يستلزم بحاجة إلى دراسة هذه الأحياء لتطوير علاجات فعالة، والمرض--تعديل^4،5،،من⁶⁷.

نمدارس تتألف من أربعة مونومرات أو الوحدات الفرعية^4،،من⁸⁹. ويبين تشكيل الهيكلية نمدار تقلب التنموية والإقليمية داخل المخ^7،10. وتشارك نمدارس في اللدونة متشابك، والإدراك، وتوليد إيقاعات للتنفس والحركة^11،،من¹²¹³. كقناة لبوابات الجهد، إلى حد كبير غير إجراء في استراحة غشاء المحتملة (-70 mV) وتم حظره بواسطة الماغنسيوم لمنع المزيد من تخلل للايونات. القناة يتم تفعيلها من خلال ربط يغاندس اثنين وغلوتامات جليكاين/د-سيرين، وتوسط depolarization متزامنة في الغشاء متشابك مستقبلات امبا، فئة فرعية أخرى من مستقبلات الغلوتامات إيونوتروبيك. ديبولاريزيشن يزيل انسداد المغنيسيوم نمدار، تمكين تدفق الاتصالات، لا سيما الكالسيوم^14،،من¹⁵¹⁶. على الرغم من أن تنشيط نمدار ضروري لبقاء الخلية، يمكن أن يؤدي التنشيط المفرط الخلية وفاة^17،،من¹⁸¹⁹ من خلال اكسسيتوتوكسيسيتي. هذا، بالإضافة إلى الطبيعة المعقدة للمستقبلات، يجعل من تحدي لإجراء الدراسات اللازمة لتطوير علاجات فعالة.

وقد وضعت أساليب مختلفة لدراسة نمدار. ومع ذلك، كل واحد لديه المصاحبة للمحاذير. على سبيل المثال، إحدى التقنيات المستخدمة على نطاق واسع هو تحليل القائم على الأسفار الذي يقيس التغيرات نمدار بوساطة في الكالسيوم داخل الخلايا في خط خلية مستقرة تحت سيطرة مروج التتراسيكلين إيندوسيبلي (تيت في)²⁰. ومع ذلك، في هذا النظام، سوبراماكسيمال وتركيزات يغاندس مطلوبة وشرط أن مثبطات نمدار موجودة أثناء أخذ القياس يجعل من المستحيل تقريبا للكشف عن النشاط لخصم تنافسية. وفي نظم أخرى مماثلة، يسبب التعبير عن مستقبلات الوظيفية السمية، التي تتطلب محصرات قنوات مثل الكيتامين^21،22 الحفاظ على الثقافات الخلية. الجلوس في صميم المستقبلات هذه محصرات قنوات ويصعب أن يغسل بها، لا سيما في شكل لوحة، حيث تتداخل مع الدراسات الفنية للمستقبلات. وأخيراً، في القياسات الكهربية مثل لقط التصحيح، هناك إنتاجية محدودة، ودراسات واسعة النطاق، هي مكلفة جداً²³. على الرغم من أنظمة المذكورة أعلاه حساسة لتحفيز جليكاين؛ ومن ثم دراسة جليكاين-تعتمد على نشاط نمدار يصبح تحديا.

وهنا يصف لنا نهجاً جديداً لدراسة نمدار أن يتغلب على القيود التي نوقشت. لدينا أسلوب يستغل نظام التعبير باكولوفيروس للتعبير عن مستقبلات على المستويات الوظيفية مع نسبة مثلى للوحدات الفرعية بأقل قدر من 16 ساعة. وعلاوة على ذلك، يتيح استخدام باكولوفيروس لنهج بسيط والتوافقي، الذي يوفر وصفاً واسعة من الأنواع الفرعية نمدار المؤتلف متميزة. وخلافا لفحوصات أخرى، لا يتطلب هذا البروتوكول محصرات قنوات بسبب استخدام الخصوم ضعيفة. ميزة أقوى للأسلوب تبييض بعد ذلك لخصم ضعيف، والمستقبلات حساسة لتحوير مواقع الربط جليكاين وغلوتامات الفردية بالإضافة إلى التعديل المزدوج جليكاين/د-سيرين وغلوتامات ملزم يجند المواقع. ويجمل المقايسة الأدوية المعروفة لمستقبلات نمدار وآثار به المغيرون إيجابية وسلبية معروفة. أخيرا، السمية الخلوية الناتجة عن تدفق الكالسيوم المفرط ويتغلب على توليد هذه في المختبر الخلوية المقايسة ويسمح للدراسات الفنية من المستقبلات في طريقة الفائق، التي يمكن أن تعجل باكتشافات المغيرون نمدار في الحالات المرضية.

Protocol

1-إعداد الخلايا

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول، بما في ذلك توليد البيانات، الخلايا HEK293 ترانسدوسيد مع باكولوفيروس ترميز الخلايا NR1 و NR2A.

1. البذور عدد مناسب من الخلايا HEK293 وإضافة NR1 و/أو NR2A الفيروس بتركيزات النهائية المناسبة (1.00 ميليلتر في كل). لوحة 384، حسنا، استخدم 10,000 الخلايا/البئر بحجم نهائي في 30 ميليلتر.
2. وبدلاً من ذلك، بذور الخلايا HEK293-NR1-NR2A في الخلية المناسبة عدد وحجم (للوحة 384، حسنا، استخدام 10,000 الخلايا/البئر بحجم نهائي في 30 ميليلتر). إضافة التتراسيكلين بتركيز 2 ميكروغرام/مل للحث على التعبير NR2A وإضافة حماية مجمع (100 ميكرومتر MDL105، 5 ميكرومتر CGP070667²⁴أو 519).
3. ملاحظة: يجب أن يكون باكولوفيروس ترميز NR1 و NR2 عيار تقريبي بين 5 × 10⁹ -10 × 10⁹ وحدة المعدية كل المليلتر²⁴.

2-قياس نشاط مستقبلات NMDA

1. إعداد لوحة 384-جيدا مع الخلايا HEK293 ترانسدوسيد مع خلايا NR1/NR2 أو HEK293-NR1-NR2A حضور أما الحماية المركبة. استخدام أسفل واضحة، والإطار الأسود، لوحة بولي-د-يسين المغلفة.
   ملاحظة: حماية مع 100 ميكرومتر ويستخدم MDL105، 519 يضفي حساسية جليكاين، بينما 5 ميكرومتر CGP070667 يستخدم لإضفاء التجاوب غلوتامات.
2. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة 16 ساعة (بين عشية وضحاها).
3. إزالة اللوحة من الحاضنة ولطف تجاهل وسائل الإعلام الخلية بإبطاء تنقلب اللوحة حاوية بيوواستي متوافقة. اضغط برفق لوحة على منشفة ورقية لتنظيف وسائل الإعلام خارج حواف اللوحة واستنزاف أي وسائط الإعلام المتبقية.
4. إعداد calcium6-الصبغة قبل سولوبيليزينج قنينة واحدة من صبغة calcium6 (حجم لوحة 1) في 10 مل من حضانة المخزن المؤقت (حبس pH 7.5، 20 مم حبيس، 1 مم مجكل₂، البروبينسيد 1 مم). احتضان اللوحة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% أول أكسيد الكربون₂.
5. إزالة اللوحة من الحاضنة والسماح للخلايا ضبط درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
6. صب بلطف calcium6 الصبغ كما هو موضح في الخطوة 2، 3 وإضافة 30 ميليلتر من المخزن المؤقت للفحص (حبس pH 7.5، 20 مم حبيس، 1.8 مم كاكل₂، البروبينسيد 1 مم).
7. كرر الخطوة 2.6 مرتين لمجموعة من يغسل 3. ترك 30 ميليلتر من المخزن المؤقت للفحص على الخلايا بعد الغسيل الأخير.
8. السماح للخلايا الراحة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
9. إعداد لوحة يجند بجعل مخزون النوبات من 400 ميكرون جليكاين و 400 ميكرون غلوتامات (التركيز النهائي من 100 ميكرومتر؛ تركيز الأمثل من يغاندس يحدد كما هو موضح أدناه). تحويل الحد أدنى من 25 ميليلتر من الأسهم يجند إلى الخامس-أسفل لوحة 384-جيدا.
10. تحميل لوحة يجند ولوحة الخلية في فدس (نظام فحص المخدرات الوظيفية).
11. قياس fluorescence خط الأساس (و_س) من لوحة الخلية لمدة 30 ثانية. نقل 10 ميليلتر من رصيد يجند في لوحة الخلية باستخدام الدالة الاستغناء عن فدس وقياس تدفق الكالسيوم عن طريق تسجيل الأسفار صبغ calcium6 لمدة 5 دقائق.
12. حساب نسبة الأسفار القصوى بتقسيم الأسفار القصوى التي حصل عليها الأسفار خط الأساس (و/F_ماكسس).

3-الاستفادة المثلى مستويات التعبير نمدار

1. لتحديد مقدار باكولوفيروس لاستخدام الأمثل، إجراء معايرة للفيروسات NR1 و NR2A على حد سواء. إعداد لوحة 384-جيدا مع خلايا HEK293 (التوصية 10,000 الخلايا/بئر، 30 ميليلتر لوسائط الإعلام) وتشمل مركبات الحماية كما هو موضح في الخطوة 2، 1.
2. إضافة كميات مختلفة من الفيروس NR1 في صفوف مختلفة من اللوحة (على سبيل المثال: إضافة 0 ميليلتر، ميليلتر 2، 1 ميليلتر، 0.5 ميليلتر، ميليلتر 0.25 في صفوف ألف إلى هاء على التوالي). إضافة تكرارات لدقة البيانات.
3. إضافة كميات مختلفة من الفيروس NR2A في أعمدة مختلفة من اللوحة (على سبيل المثال: إضافة 0 ميليلتر، ميليلتر 2، 1 ميليلتر، 0.5 ميليلتر، ميليلتر 0.25 في صفوف ألف إلى هاء على التوالي). إضافة تكرارات لدقة البيانات.
4. احتضان اللوحة في 37 درجة مئوية و 5% CO₂ لمدة 16 ساعة (بين عشية وضحاها).
5. تحديد نسبة مثلى وكمية من الفيروسات NR1، و NR2A عن طريق إجراء قياس تدفق كالسيوم في فدس (انظر أعلاه).

4-يجند المعايرة

1. إعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2، 3.
2. إعداد تخفيف ليجند كل حضور تشبع تركيزات (100 ميكرومتر) من يجند الأخرى كحل أسهم النوبات. فعلى سبيل المثال: لتركيز اختبار نهائي 10 ميكرون من جليكاين، إعداد حل جليكاين بما في ذلك 400 ميكرون غلوتامات أسهم 40 ميكرومتر.
3. المضي قدما بقياس فدس كما هو موضح في الخطوة 2.11.

5-مجمع اختبار

1. إعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.
2. إعداد لوحة يجند مع أسهم 5 إضعاف تركيز يجند النهائي في المخزن المؤقت للمقايسة.
3. إعداد لوحة المركبات مع الأسهم النوبات التركيز النهائي المطلوب للمركبات في المخزن المؤقت للمقايسة. لتركيز مركب نهائي من 10 ميكرون في المخزن المؤقت للمقايسة، تعد حلاً أسهم 40 ميكرومتر.
   1. يبقى تركيز ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) ثابت عبر كافة العينات بإعداد إضعاف ما قبل المجمع في [دمس] قبل المزيد من إضعاف في المخزن المؤقت للمقايسة.
   2. لاستجابة جرعة من المجمع في التحليل النهائي تتراوح ما بين 3 و 30 ميكرون، وإعداد إضعاف ما قبل المجمع في [دمس] تتراوح بين 1 إلى 10 مم. إضعاف تلك الموجودة في المخزن المؤقت المقايسة لتركيز المخزون النوبات. التركيز [دمس] النهائي ينبغي أن لا تتجاوز 0.5%.
      ملاحظة: من المستحسن اختبار كل عينة في تريبليكاتيس.
4. تحميل يجند ومجمع، ولوحة الخلية في فدس.
5. قياس fluorescence الأساس لمدة 30 ثانية.
6. إضافة 10 ميليلتر من الأسهم المركب وقياس الأسفار لمدة 5 دقائق.
7. إضافة 10 ميليلتر من الأسهم يجند وقياس الأسفار لمدة 5 دقائق.
8. تحديد متكاملة لنسبة الأسفار عن طريق حساب المنطقة تحت المنحنى نسب الفلورسنت خلال آخر 5 دقائق للقياس.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، نسبة الأسفار بعد إضافة يجند القصوى يمكن استخدامها لتحليل.

النتائج

قبل اختبار آثار الجزيئات الصغيرة، واحد يجب أن تحدد مستويات التعبير الأمثل نمدارس، فضلا عن تركيزات يجند الأمثل. كما هو موضح، HEK293 كانت تبذر الخلايا في الخلايا 10,000 كل بئر في صفيحة 384، حسنا، حضور 5 ميكرومتر CGP060667، ثم ترانسدوسيد بمقادير متفاوتة من NR1 و NR2A الفيروسات. تم قياس الجر...

Discussion

يعتمد نجاح هذا التحليل إلى حد كبير على صحة الخلايا HEK المستخدمة. الخلايا تشهد نمواً متسارعا وينبغي أن تستخدم بعدد مرور منخفضة. هذا التحليل ينطوي على العديد من عمليات النقل وإضافات حلول، وذلك باستخدام الحذر سوف ضمان دقة أعلى في نتائجه. ينبغي أن تكون تركيزات مركبات وجميع الكواشف الأخرى أيضا ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK-293	ATCC	CRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line	ChanTest Corporation	CT6120
pFastBac Dual Expression Vector	ThermoFisher Scientific	10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning Life Sciences	3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit	Molecular Devices	R8192
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Glutamate	Sigma-Aldrich	49621
D-serine	Sigma-Aldrich	S4250
L701,324	Tocris	907
HEPES Buffer	Boston Bio Product	BB-103
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	63069
Calcium Chloride	VWR	E506
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025-092
Probenecid	ThermoFisher Scientific	P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX media	ThermoFisher Scientific	10565018
MDL105,519	NIBR	Synthesized in house
NVP-AAM077	NIBR	Synthesized in house
CGP070667	NIBR	Synthesized in house