글리신/D-떠들고와 조미료에 감도와 NMDA 수용 체를 공부 하는 높은 처리량 칼슘-플럭스 분석 결과

요약

이 프로토콜의 목표는 더 큰 규모에 NMDA 수용 체 (NMDAR)의 연구를 촉진 하기 위하여 작은 분자의 modulatory 효력의 검사 및 치료 응용 프로그램입니다.

초록

N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체 (NMDAR) ionotropic 글루타민 산 염 수용 체로 분류 됩니다 있고 학습과 기억에 중요 한 역할. NMDAR 오작동, 표현으로 어느 이상-또는 아래-activity 돌연변이, 변경된 식, 인신 매매, 또는 지역화로 인 한 수많은 질병, 특히 중앙 신경 조직에에서 기여할 수 있다. 따라서, 화합물 및 작은 분자의 발견을 촉진 뿐만 아니라 이해 하는 수용 체의 생물학 신경 질환에 대처 하기 위해 지속적인 노력에서 결정적 이다. 수용 체를 공부 하 고 현재 접근 제한이 낮은 처리량, 높은 비용과 excitotoxicity NMDAR 중재를 방지 하기 위해 채널 차단제의 필요한 존재로 인해 그것의 기능적인 능력을 공부 하는 무 능력을 포함 하 여. 또한, 기존의 분석 결과 시스템만 조미료에 의해 자극에 민감한 고 글리신은 NMDAR의 다른 공동 ligand에 의해 자극 감도 부족. 여기, 선물이 공동 ligands, 조미료와 D-떠들고/글리신에 감도 NMDA 수용 체를 높은 처리량 힘을 가진 첫 번째 접시 기반 분석 결과. 이 이렇게 다른 NMDAR 소 단위 구성의 연구를 허용 하 고 글리신-또는 조미료에 민감한 모드에서 수용 체의 기능 연구를 허용. 또한, 방법 측정 동안 억제제의 존재를 필요 하지 않습니다. 이 분석 결과 함께 긍정적이 고 부정적인 allosteric 변조기의 효과 검출 될 수 있다 고 NMDAR의 알려진된 약리학 우리의 시스템에 복제 되었습니다. 이 기술은 기존 방법의 한계를 극복 하 고 비용 효율적입니다. 우리는이 새로운 기술은 NMDAR 중재 병 리에 대 한 치료의 발견을 가속화 될 것을 믿습니다.

서문

현재 의학의 발전, 수명 크게; 증가 했다 그러나, 그래서 나이 관련 된 질병의 유행이 하고있다. 질병 중앙 신경 조직 (CNS) 정신 분열 증, 루 경화 증 (ALS), 알 츠 하이 머 병, 파 킨 슨 병, 다른 사람, 사이 등의 예외가 있으며 향후 10 년간^1, 증가 예상 ^{2 , 3}. N-메 틸-D-aspartate 수용 체 (NMDAR)로 알려진 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 고장 Alzheimer의 질병, 정신 분열 증, 외상 성 뇌 손상, 뇌졸중, 당뇨병, 및 보증, 녹 내장에 연결 되어있다는 효과적인, 질병 수정 요법^4,5,,67의 개발에 대 한 그들의 생물학을 공부 해야 합니다.

NMDARs는 4 개의 단위체 또는 소 단위^4,,89의 구성 됩니다. NMDAR의 구조 구성 뇌^7,10발달 및 지역 다양성을 보여줍니다. NMDARs는 시 냅 스가 소성, 인식, 그리고 리듬의 세대에서 호흡, 운동^11,,1213에서 포함 된다. 주로 휴식 막 잠재력에 비 전도성은 전압-개폐 통로 (-70 mV) 마그네슘 이온의 투과 방지에 의해 차단 됩니다. 채널 두 ligands, 조미료 및 글리신/D-떠들고의 바인딩에 의해 활성화 되 고 시 냅 스 막에 동시 도발은 AMPA 수용 체, ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 다른 서브 클래스에 의해 중재. 도발은 양이온, 특히 칼슘^14,,1516의 유입 활성화 NMDAR의 마그네슘 막힘을 제거 합니다. NMDAR 활성화 세포 생존을 위해 필수적 이다, 비록 과도 한 활성화 세포 죽음^17,,1819 excitotoxicity 통해 발생할 수 있습니다. 수용 체의 복잡 한 자연 뿐만 아니라 게 연구를 수행 하기 위해 도전 효과적인 치료 개발에 필요한.

다른 메서드는 NMDAR 연구 개발 되었습니다. 그러나, 각자 주의 동반 했다. 예를 들어 하나의 널리 사용 기법 항생물질을 유도할 수 있는 발기인 (Tet에)²⁰의 통제 안정적인 셀 라인에서 세포내 칼슘에서 NMDAR 중재 변화를 측정 하는 형광 기반 분석 결과 이다. 그러나이 시스템에 필요한 ligands의 supramaximal 농도 NMDAR 억제제는 측정 중에 존재 하는 요구는 그것 경쟁 길 항 근의 활동을 검출 하기 거의 불가능. 다른 유사한 시스템에서 기능 수용 체의 식이 발생 독성, 셀 문화를 보존 하기 위해 마 취 제^21,22 같은 채널 차단제를 요구 합니다. 이러한 채널 차단제는 수용 체의 코어에 앉아서 그들은 수용 체의 기능 연구 방해 플레이트 기반 포맷에 (서) 특히, 밖으로 세척 하기 어려운. 마지막으로, 패치 죄 같은 electrophysiological 측정에서 제한 된 처리량, 그리고 대규모 연구는 매우 비싼²³. 도 불구 하 고, 위의 시스템은 민감한 글리신 자극; 따라서, 글리신 종속 활동은 NMDAR의 공부는 도전 된다.

여기, 우리가 NMDAR 논의 한계를 극복 하는 공부에 대 한 새로운 접근 방식을 설명 합니다. 우리의 기술은 작은 16 시간에는 소 단위의 최적의 비율로 기능 수준에서 수용 체를 표현 하는 잠재 식 시스템에 대문자로 바꿉니다. 또한, 잠재를 사용 하 여 고유 재조합 NMDAR의 광범위 한 특성을 제공 하는 간단 하 고 조합 접근 수 있습니다. 다른 분석 실험, 달리이 프로토콜은 약한 길 항 제를 사용 하는 채널 차단제를 필요 하지 않습니다. 방법의 가장 강한 장점은 약한 길 항 근의 그 후 유실, 수용 체는 글리신/D-떠들고와 조미료의 듀얼 변조 뿐만 아니라 개별 글리신 및 글루타민 산 염 바인딩 사이트의 ligand 바인딩 사이트입니다. 분석 결과 NMDAR 수용 체의 알려진된 약리학 및 그것의 알려진된 양수와 음수 변조기의 효과. 마지막으로,이 체 외에서 세포 분석 결과의 발생 과도 한 칼슘 유입으로 인 한 세포 독성을 극복 하 고 NMDAR 변조기의 발견을 가속 수 있습니다 높은 처리량 패션에 수용 체의 기능 연구에 대 한 허용 에 질병 상태.

프로토콜

1입니다. 셀의 준비

참고:이 프로토콜을 데이터 생성을 포함 하 여 잠재 인코딩 NR1 및 NR2A 세포로 불리고 HEK293 세포를 사용 합니다.

1. HEK293 세포의 적절 한 수 씨 하 고 적절 한 최종 농도 (1.00 µ L 각)에서 NR1 / NR2A 바이러스를 추가 합니다. 384-잘 접시를 사용 하 여 10, 000 셀/잘 30 µ L의 최종 볼륨.
2. 또는 적절 한 휴대폰 번호와 (384-잘 접시, 10, 000 사용 하 여 셀/잘 30 µ L의 최종 볼륨에서)에 대 한 볼륨 HEK293 NR1 NR2A 셀 씨. NR2A 식 유도 및 복합 보호 추가 2 µ g/mL의 농도에서 항생물질을 추가 (100 µ M MDL105, 519 또는 5 µ M CGP070667²⁴).
3. 참고: 인코딩 NR1, NR2 잠재 5 x 10⁹ -10 x 10⁹ 밀리²⁴당 감염 단위 사이 대략 titer가 있어야 합니다.

2입니다. NMDA 수용 체 활동의 측정

1. HEK293 세포 중 보호 화합물 존재 NR1/NR2 또는 HEK293 NR1 NR2A 세포 transduced 384-잘 접시를 준비 합니다. 사용 하 여 명확한 바닥, 블랙 프레임, 폴 리-D-리 코팅된 판.
   참고: 보호 100 µ M와 MDL105, 519 글리신, 5 µ M 동안에 감도 수 여 하는 CGP070667은 조미료에 감도 부여 하는 데 사용 됩니다.
2. 16 시간 (하룻밤) 37 ° C, 5% CO₂ 접시를 품 어.
3. 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 부드럽게 호환 유기화학 컨테이너 접시를 뒤집어 감속에 의해 셀 미디어를 삭제. 부드럽게 접시의 가장자리에서 미디어를 청소 하 고 나머지 미디어 배수를 종이 타월에 접시를 누릅니다.
4. 인큐베이션 버퍼 (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 1mm probenecid) 10 mL에 calcium6 염료 (1 접시 크기)의 한 유리병 solubilizing로 calcium6-염료를 준비 합니다. 37 ° C, 5% CO₂에서 2 시간 동안 접시를 품 어.
5. 인큐베이터에서 접시를 제거 하 고 10 분 동안 실내 온도에 조정 하는 셀을 하자.
6. 부드럽게 2.3 단계에서 설명한 대로 calcium6 염료를 쏟아 하 고 분석 결과 버퍼 (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1.8 m m CaCl₂, 1mm probenecid)의 30 µ L를 추가 합니다.
7. 3 세척의 2.6 두 번 총에 대 한 단계를 반복 합니다. 마지막 세척 후 분석 결과 버퍼의 30 µ L 셀에 둡니다.
8. 실 온에서 5 분간 휴식 하는 셀을 하자.
9. 400 µ M 글리신 및 400 µ M 조미료 (100 µ M의 최종 농도, 아래 설명 된 대로 결정 되는 ligands의 최적 농도) 4-fold 재고 하 여 리간드 접시를 준비 합니다. V-아래 384-잘 접시에 ligand 주식의 25 µ L의 최소 전송.
10. Ligand 접시와 셀 플레이트 FDSS (기능성 약물 검사 시스템)로 로드 합니다.
11. 30 초 동안 셀 플레이트의 기준선 형광 (F_o)를 측정 합니다. 5 분 동안 calcium6 염료 형광을 기록 하 여 FDSS 분배 기능과 측정 칼슘 플럭스를 사용 하 여 셀 접시에 ligand의 10 µ L를 전송 합니다.
12. 기준선 형광 (F_최대/F_o)에 의해 얻은 최대 형광을 나누어 최대한 형광 비율을 계산 합니다.

3입니다. NMDAR 식 레벨의 최적화

1. 사용 하 여 잠재의 최적 크기를 결정, NR1 및 NR2A 바이러스의 적정을 수행 합니다. HEK293 세포 (10, 000 셀/잘의 추천, 미디어의 30 µ L) 384-잘 접시를 준비 하 고 단계 2.1에에서 설명 된 대로 보호 화합물 포함.
2. 접시의 다른 행에 있는 NR1 바이러스의 다양 한 금액을 추가 (예: 행 A-E 0 µ L, 2 µ L, 1 µ L, 0.5 µ L, 0.25 µ L를 각각 추가). 데이터의 정확성에 대 한 중복을 추가 합니다.
3. 접시의 다른 열에 NR2A 바이러스의 다양 한 금액을 추가 (예: 행 A-E 0 µ L, 2 µ L, 1 µ L, 0.5 µ L, 0.25 µ L를 각각 추가). 데이터의 정확성에 대 한 중복을 추가 합니다.
4. 16 시간 (하룻밤) 37 ° C, 5% CO₂ 접시를 품 어.
5. FDSS (위 참조)에 칼슘 플럭스 측정을 수행 하 여 최적의 비율과 NR1 및 NR2A 바이러스의 금액을 결정 합니다.

4. 리간드 적정

1. 2.3 단계에서 설명한 대로 셀을 준비 합니다.
2. 4-fold 재고 솔루션으로 다른 ligand의 농도 (100 µ M)를 흠뻑 젖 게 하는 면 전에 서 각 ligand의 희석을 준비 합니다. 예: 글리신의 10 µ M 최종 테스트 농도, 글리신 400 µ M 조미료 등의 40 µ M 재고 솔루션을 준비.
3. FDSS 측정 단계 2.11에에서 설명 된 대로 진행 합니다.

5. 복합 테스트

1. 1 단계에서 설명한 대로 셀을 준비 합니다.
2. 분석 결과 버퍼에서 최종 ligand 농도의 5 재고 ligand 접시를 준비 합니다.
3. 4-fold 재고 분석 결과 버퍼에서 화합물의 원하는 최종 농도의 화합물 접시를 준비 합니다. 분석 결과 버퍼에 10 µ M의 최종 화합물 농도, 40 µ M 재고 솔루션을 준비 합니다.
   1. 계속 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 농도 상수 모든 샘플에서 분석 결과 버퍼에 더 희석 하기 전에 DMSO에 화합물의 사전 희석을 준비 하 여.
   2. 최종 분석 결과 3 그리고 30 µ M 사이에서 화합물의 복용량 응답, 1에서 10 m m까지 DMSO에 화합물의 사전 희석을 준비 합니다. 4-fold 재고 농도 분석 결과 버퍼에 희석. DMSO의 최종 농도 0.5%를 넘지 말아야 한다.
      참고: 그것은 triplicates에 각 샘플을 테스트 하 고 좋습니다.
4. FDSS에 ligand, 화합물, 및 셀 접시를 로드 합니다.
5. 30 초 동안 기준선 형광을 측정 합니다.
6. 복합 주식의 10 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 형광을 측정.
7. Ligand 주식의 10 µ L을 추가 하 고 5 분 동안 형광을 측정.
8. 측정의 마지막 5 분 동안 형광 비율의 곡선 아래의 영역을 계산 하 여 형광 비율의 전체를 확인 합니다.
   참고: 또는, ligand 추가 후 형광의 비율을 최대한 사용할 수 있습니다 분석을 위해.

결과

작은 분자의 효과 테스트 하기 전에 하나 NMDARs 최적의 ligand 농도의 최적의 식 수준을 결정 해야 합니다. 설명, HEK293 세포 384-잘 접시에 잘 당 10000 셀에서 시드 했다 5 µ M의 CGP060667, 다음 불리고 NR1 및 NR2A의 다양 한 양의 바이러스. 인큐베이션 하룻밤, ligand 유도 된 칼슘 후 유량 측정 되었다 (그림 1). 이러한 실험의 결과 공개 최고의 수량 및 각 소 단위...

토론

이 분석 결과의 성공 사용 HEK 세포의 건강에 따라 달라 집니다. 지 수 성장을 겪고 세포와 낮은 통로 번호와 함께 사용 해야 합니다. 이 분석 결과 많은 전송 고 추가 그렇게 주의 사용 하 여 솔루션의 결과에 더 높은 정확도 보장 합니다. 화합물 및 다른 모든 시 약의 농도 또한 오류를 최소화 하기 위해 크로스 체크 해야 합니다. 칼슘 유출 분석 결과 대 한 분석 결과 버퍼와 셀 미디어를 교체할 때 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK-293	ATCC	CRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line	ChanTest Corporation	CT6120
pFastBac Dual Expression Vector	ThermoFisher Scientific	10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning Life Sciences	3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit	Molecular Devices	R8192
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Glutamate	Sigma-Aldrich	49621
D-serine	Sigma-Aldrich	S4250
L701,324	Tocris	907
HEPES Buffer	Boston Bio Product	BB-103
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	63069
Calcium Chloride	VWR	E506
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025-092
Probenecid	ThermoFisher Scientific	P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX media	ThermoFisher Scientific	10565018
MDL105,519	NIBR	Synthesized in house
NVP-AAM077	NIBR	Synthesized in house
CGP070667	NIBR	Synthesized in house