Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

Resumo

O objetivo do presente protocolo é facilitar o estudo dos receptores de NMDA (NMDAR) em uma escala maior e permitir a análise dos efeitos moduladora de pequenas moléculas e suas aplicações terapêuticas.

Resumo

Receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) (NMDAR) são classificados como receptores de glutamato de geleificação e têm papel crítico na aprendizagem e memória. Mau funcionamento do NMDAR, expressado como qualquer over - ou under - activity causada por mutações, expressão alterada, tráfico ou localização, pode contribuir para inúmeras doenças, especialmente no sistema nervoso central. Portanto, compreender a biologia do receptor, bem como facilitar a descoberta de compostos e moléculas pequenas é crucial nos esforços em curso para combater doenças neurológicas. As abordagens atuais para estudar o receptor têm limitações, incluindo a incapacidade para estudar suas habilidades funcionais devido a necessária presença de bloqueadores de canais para evitar excitotoxicidade mediada por NMDAR, alto custo e baixa taxa de transferência. Além disso, os sistemas existentes de ensaio são sensíveis à estimulação por glutamato apenas e faltam de sensibilidade à estimulação por glicina, o outro ligante co do NMDAR. Aqui, apresentamos o primeiro ensaio baseado em placa de poder elevado-throughput para estudar um receptor NMDA com sensibilidade para ambos os ligantes co, glutamato e D-serina/glicina. Esta abordagem permite o estudo de diferentes composições de subunidade NMDAR e permite estudos funcionais do receptor em modos de glicina e / ou sensíveis ao glutamato. Além disso, o método não requer a presença de inibidores durante as medições. Os efeitos de moduladores alostéricos positivos e negativos podem ser detectados com este ensaio e a farmacologia conhecida de NMDAR foi replicada em nosso sistema. Esta técnica supera as limitações dos métodos existentes e é rentável. Acreditamos que esta nova técnica irá acelerar a descoberta de terapias para patologias NMDAR-mediada.

Introdução

Com os atuais avanços na medicina, a expectativa de vida aumentou significativamente; no entanto, então tem a prevalência de doenças relacionadas com a idade. Doenças do sistema nervoso central (CNS) tais como esquizofrenia, esclerose lateral amiotrófica (ela), doença de Alzheimer e doença de Parkinson, entre outros, não são excepção e tem sido projetadas para aumentar ao longo da próxima década^{1, 2 , 3}. o mau funcionamento dos receptores de glutamato de geleificação conhecido como receptores N-metil-D-aspartato (NMDAR) tem sido associado a doença de Alzheimer, esquizofrenia, traumatismo crânio-encefálico, acidente vascular cerebral, diabetes e glaucoma, entre outros, que garante a precisa estudar sua biologia para o desenvolvimento de terapias eficazes, doença-modificando^4,5,6,7.

Os NMDARs são compostos de quatro monômeros ou subunidades^4,8,9. A composição estrutural do NMDAR mostra variabilidade regional e de desenvolvimento dentro do cérebro^7,10. Os NMDARs estão envolvidos na plasticidade sináptica, cognição e a geração de ritmos para respiração e locomoção^11,12,13. Como um canal de voltagem-dependente, é em grande parte não-condutor no potencial de membrana de repouso (-70 mV) e é bloqueado por magnésio para prevenir mais permeação de íons. O canal é activado pela ligação de dois ligantes, glutamato e a glicina/D-serina, e uma despolarização simultânea na membrana sináptica mediada por receptores de GABA, outra subclasse de receptores de glutamato de geleificação. A despolarização remove o bloqueio de magnésio de NMDAR, permitindo o influxo de cátions, particularmente cálcio^14,15,16. Mesmo que a ativação do NMDAR é essencial para a sobrevivência da pilha, ativação excessiva pode levar à morte^17,18,19 através da excitotoxicidade da pilha. Isso, além da natureza complexa do receptor, torna desafiador para realizar estudos necessários para o desenvolvimento de terapias eficazes.

Diferentes métodos têm sido desenvolvidos para estudar o NMDAR. No entanto, cada um tem que acompanha ressalvas. Por exemplo, uma técnica amplamente utilizada é um ensaio baseado em fluorescência que mede mudanças NMDAR-mediada em cálcio intracelular em uma linha de celular estável sob o controle de um promotor inducible-tetraciclina (Tet-On)²⁰. No entanto, neste sistema, as concentrações de supramaximal de ligantes que são necessários e a exigência de que os inibidores NMDAR estão presentes durante a medição torna quase impossível de detectar atividade da antagonista competitivo. Em outros sistemas similares, a expressão do receptor funcional provoca toxicidade, exigir que os bloqueadores de canais como a cetamina^21,22 para preservar as culturas de células. Estes bloqueadores dos canais de sentar-se no núcleo do receptor e são difíceis de lavar, especialmente em um formato baseado em placa, para que eles interfiram com estudos funcionais do receptor. Finalmente, em medidas eletrofisiológicas tais como remendo aperto, há produção limitada, e estudos em grande escala são muito caro²³. Não obstante, os sistemas acima são insensíveis à estimulação de glicina; Portanto, estudando a atividade de glicina-dependente do NMDAR torna-se um desafio.

Aqui, descrevemos uma nova abordagem para o estudo NMDAR que supera as limitações discutidas. Nossa técnica capitaliza sobre o sistema de expressão de baculovirus para expressar o receptor em níveis funcionais, com uma óptima relação das subunidades em menos de 16 horas. Além disso, o uso de baculovirus permite uma abordagem simples e combinatória, que fornece uma ampla caracterização dos subtipos distintos de NMDAR recombinantes. Ao contrário de outros ensaios, este protocolo não requer bloqueadores de canal por causa do uso de antagonistas fracos. Mais forte vantagem do método é aquele fracassado depois do antagonista fraco, o receptor é sensível a modulação dos sites individual glicina e o glutamato vinculação - além de modulação dual de glicina/D-serina e glutamato ligand-ligação sites. O ensaio recapitula a farmacologia conhecida do receptor NMDAR e os efeitos de seus conhecidos moduladores positivos e negativos. Finalmente, a geração deste ensaio celular em vitro supera a toxicidade celular causada pelo influxo excessivo de cálcio e permite estudos funcionais do receptor em uma moda de alta produtividade, que pode acelerar as descobertas de moduladores NMDAR Estados de doença.

Protocolo

1. preparação das células

Nota: Este protocolo, incluindo a geração de dados, usa HEK293 células transfectadas com um baculovirus codificação NR1 e NR2A células.

1. O número adequado de células HEK293 de sementes e adicionar o vírus NR1 e/ou NR2A nas concentrações finais apropriadas (1,00 µ l cada). Para uma placa de 384, use 10.000 células/poço em um volume final de 30 µ l.
2. Alternativamente, as sementes células HEK293-NR1-NR2A o número de célula apropriada e volume (por um prato de 384-bem, uso 10.000 células/poço em um volume final de 30 µ l). Adicionar tetraciclina na concentração de 2 µ g/mL para induzir a expressão NR2A e adicionar a proteção composta (100 µM MDL105, 519 ou 5 µM CGP070667²⁴).
3. Nota: O baculovirus codificação NR1 e NR2 devem ter um título aproximado entre 5 x 10⁹ - 10 x 10⁹ unidade infecciosa por mililitro²⁴.

2. medida da atividade do receptor NMDA

1. Prepare uma placa de 384 com células HEK293 transfectadas com células NR1/NR2 ou HEK293-NR1-NR2A na presença de compostos de qualquer proteção. Use um fundo transparente, moldura preta, placa revestida de poli-D-lisina.
   Nota: Proteção com 100 µM MDL105, 519 é usado para conferir a sensibilidade a glicina, enquanto 5 µM CGP070667 é usado para conferir a sensibilidade ao glutamato.
2. Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO₂ por 16 horas (durante a noite).
3. Retirar a placa da incubadora e suavemente, descartar a mídia celular por abrandar capotar um recipiente de resíduos biológicos compatível com a placa. Bata levemente a placa sobre uma toalha de papel para limpar a mídia fora as bordas da placa e todos os restantes meios de drenagem.
4. Prepare o corante calcium6 por solubilizing, um frasco de tintura de calcium6 (1 tamanho da placa) em 10 mL de tampão de incubação (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, probenecida 1 mM). Incube a placa por 2 horas a 37 ° C e 5% de CO₂.
5. Retirar a placa da incubadora e deixar que as células ajustar a temperatura ambiente por 10 minutos.
6. Despeje delicadamente o corante calcium6, conforme descrito na etapa 2.3 e adicione 30 µ l de tampão do ensaio (HBSS pH 7,5, 20 mM HEPES, 1.8 mM CaCl₂, probenecida 1 mM).
7. Repita a etapa 2.6 duas vezes para um total de 3 lavagens. Deixe 30 µ l de buffer de ensaio sobre as células após a última lavagem.
8. Deixe que as células descansar por 5 minutos à temperatura ambiente.
9. Prepare a placa de ligante, fazendo um 4-fold estoque de 400 µM de glicina e o glutamato 400 µM (concentração final de 100 µM; concentração ideal de ligantes para ser determinada conforme descrito abaixo). Transferi um mínimo de 25 µ l de estoque de ligante para uma placa de 384 V-fundo.
10. Carrega o ligante e chapa de célula para o FDSS (sistema de rastreio de drogas funcional).
11. Medir a fluorescência de base (F_ó) da placa de celular por 30 segundos. Transferi 10 µ l do estoque de ligante para a placa de células usando a função aplicadora FDSS e medida do fluxo de cálcio por fluorescência calcium6-corante para 5 minutos de gravação.
12. Calcule a relação de fluorescência máxima dividindo a fluorescência máxima obtida por fluorescência de base (F/f de_máximoó).

3. otimização de níveis de expressão de NMDAR

1. Para determinar a quantidade ideal de baculovirus para utilizar, execute uma titulação do vírus tanto NR1 e NR2A. Preparar uma placa de 384 com células HEK293 (recomendação de 10.000 células/poço, 30 µ l de mídia) e incluem os compostos de proteção conforme descrito no passo 2.1.
2. Adicionar diferentes quantidades do vírus NR1 em linhas diferentes da placa (por exemplo: Adicionar µ l 0, 2 µ l, 1 µ l, 0,5 µ l, 0,25 µ l em linhas A-E, respectivamente). Adicione duplicatas para a precisão dos dados.
3. Adicionar diferentes quantidades do vírus NR2A em diferentes colunas da placa (por exemplo: Adicionar µ l 0, 2 µ l, 1 µ l, 0,5 µ l, 0,25 µ l em linhas A-E, respectivamente). Adicione duplicatas para a precisão dos dados.
4. Incube a placa a 37 ° C e 5% de CO₂ por 16 horas (durante a noite).
5. Determine a melhor relação qualidade e quantidade dos vírus NR1 e NR2A realizando uma medição de fluxo de cálcio sobre o FDSS (veja acima).

4. ligante titulação

1. Prepare as células conforme descrito na etapa 2.3.
2. Prepare diluições de cada ligante na presença de concentrações (100 µM) para impregnação do outro ligante como 4-fold solução estoque. Por exemplo: para uma concentração de 10 µM teste final de glicina, prepare uma solução stock de 40 µM de glicina, incluindo 400 µM glutamato.
3. Prosseguir com a medição de FDSS conforme descrito na etapa 2.11.

5. compostos de teste

1. Prepare as células conforme descrito na etapa 1.
2. Prepare a placa de ligante com um 5-fold estoque de concentração final de ligante no buffer de ensaio.
3. Prepare a placa de compostos com o 4-fold estoque de concentração final desejada de compostos no buffer de ensaio. Para uma concentração final de composto de 10 µM no buffer de ensaio, prepare uma solução stock de 40 µM.
   1. Manter a concentração do dimetilsulfóxido (DMSO) constante em todas as amostras através da elaboração de uma pré-diluição do composto em DMSO antes mais diluição para o buffer de ensaio.
   2. Para uma resposta de dose do composto no ensaio final variando entre 3 e 30 µM, prepare uma diluição prévia do composto em DMSO, variando de 1 a 10 mM. Dilua os no buffer de ensaio para a concentração das ações 4-fold. A concentração final do DMSO não deve exceder 0,5%.
      Nota: É recomendável testar cada amostra em triplica.
4. Carrega o ligante, composto e placa de células no FDSS.
5. Medir a fluorescência de base por 30 segundos.
6. Adicionar 10 µ l de estoque composto e medir a fluorescência por 5 minutos.
7. Adicionar 10 µ l de estoque de ligante e medir a fluorescência por 5 minutos.
8. Determine a integral da relação de fluorescência, calculando a área sob a curva dos rácios fluorescentes durante os últimos 5 minutos da medição.
   Nota: Como alternativa, a proporção máxima de fluorescência após adição de ligante pode ser usada para análise.

Resultados

Antes de testar os efeitos de pequenas moléculas, deve-se determinar os níveis de expressão ideal dos NMDARs, bem como as concentrações de ligante óptima. Conforme descrito, HEK293 células foram semeadas em 10.000 células por poço em uma placa de 384, na presença de 5 µM, CGP060667, então transfectadas com quantidades variadas de NR1 e NR2A vírus. Depois de cálcio durante a noite, induzida pelo ligante de incubação foi medido o fluxo (Figura 1...

Discussão

O sucesso deste teste depende em grande parte a saúde das células HEK usado. Células em fase de crescimento exponencial e com número baixo de passagem deve ser usado. Este ensaio envolve muitas transferências e adições de soluções, usando então cuidado irão garantir maior precisão em seus resultados. Concentrações de compostos e todos os outros reagentes devem ser também cruzados para minimizar erros. Quando substituir a mídia celular com o buffer de ensaio para o ensaio de fluxo de cálcio, a placa deve ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEK-293	ATCC	CRL-1573
Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line	ChanTest Corporation	CT6120
pFastBac Dual Expression Vector	ThermoFisher Scientific	10712-024
Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate	Corning Life Sciences	3844
FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit	Molecular Devices	R8192
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126
Glutamate	Sigma-Aldrich	49621
D-serine	Sigma-Aldrich	S4250
L701,324	Tocris	907
HEPES Buffer	Boston Bio Product	BB-103
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	63069
Calcium Chloride	VWR	E506
HBSS	ThermoFisher Scientific	14025-092
Probenecid	ThermoFisher Scientific	P36400
DMEM/F-12, GlutaMAX media	ThermoFisher Scientific	10565018
MDL105,519	NIBR	Synthesized in house
NVP-AAM077	NIBR	Synthesized in house
CGP070667	NIBR	Synthesized in house