JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ويقدم هذا البروتوكول وسيلة لتقييم نشاط proteolytic حوزتي دوران جوهريا منخفضة النشاط، وواحدة في سياق خلوية. على وجه التحديد، يتم تطبيق هذا الأسلوب لتقييم نشاط بروتيوليتيك PCSK9، محرك رئيسي استقلاب الدهن نشاطها proteolytic مطلوب لوظيفتها هايبرتشوليستيروليميك في نهاية المطاف.

Abstract

كونفيرتاسي بروبروتين سوبتيليسين/كيكسن نوع 9 (PCSK9) هو حوزتي واحدة--دوران الذي ينظم مستويات المصل low-density lipoprotein (LDL)، ومن ثم أمراض القلب والأوعية الدموية. على الرغم من أن بروتيوليسيس PCSK9 مطلوب لأثره الكامل hypercholesterolemic، تقييم وظيفتها proteolytic التحدي: PCSK9 المعروف فقط تهزم نفسها، ويخضع لدوران واحد فقط، وبعد بروتيوليسيس، يحتفظ به الركيزة في موقعها النشط كسيارات-المانع. تصف الأساليب المعروضة هنا تحليل الذي يتغلب على هذه التحديات. التحليل يركز على proteolysis الجزيئات في إطار يستند إلى الخلية والانقسام الروابط الناجحة للنشاط يفرز لوسيفراس، والتي يمكن قراءتها بسهولة على المديين المتوسط ومكيفة. عبر خطوات متسلسلة من الطفرات وتعداء عابرة، وقراءات لوسيفراس، يمكن التحقيق المقايسة بروتيوليسيس PCSK9 تحت ظروف من اضطراب أو الوراثية الجزيئية في طريقة الفائق. هذا النظام أيضا مناسبة لكل تقييم البيوكيميائية مغلطه سريرياً اكتشفت واحد-النوكليوتيدات مجمع الأشكال المتعددة (بطانات)، كذلك فيما يتعلق بفحص مثبطات جزيء صغير من بروتيوليسيس PCSK9.

Introduction

PCSK9 يستهدف مستقبلات LDL (LDL-R) لتدهور، ورفع مستوى الكولسترول الضار (LDL-C) والقيادة أمراض القلب تصلب الشرايين1،2. قوة PCSK9 علاجية تستهدف خفض LDL-C وتحسين نتائج القلب والأوعية الدموية للمرضى، حتى عند إضافة علاج خفض الدهن عدوانية مع statins3،4. بيد أن العلاجات المعتمدة حاليا تقتصر على النهج القائم على الأجسام المضادة، وتعاني من نقص في الفعالية من حيث التكلفة5،6. لحل هذه المشكلة، هناك حاجة إلى بدائل علاجية أقل تكلفة، ووسيلة لتحديد المرضى الذين يحتمل أن الحصول على قدر أكبر من الفوائد، أو كليهما،.

النهج جزيء صغير يمكن أن تستهدف PCSK9 داخل الخلايا وتقدم عن طريق تحسين الإدارة وتخفيض التكاليف، وجعلها "الكأس المقدسة" في هذا المجال7. ومع ذلك، أثبت PCSK9 صعبة للمخدرات بالجزيئات الصغيرة. كما حوزتي، استهداف الدالة بروتيوليتيك PCSK9 لاستراتيجية جذابة، كما proteolysis المتمتعة بالحكم الذاتي هي الخطوة الحد من معدل نضج PCSK98 ومطلوب لأثره القصوى على LDL-ص9. حتى الآن، إلا أن هذه الاستراتيجية لم تكن ناجحة، يرجح أن سبب الكيمياء الحيوية الفريدة في PCSK9: PCSK9 كليفس سوى نفسه10، القيام بفعل واحد--دوران، وبعد المتمتعة بالحكم الذاتي-الانقسام، PCSK9 برودومين تظل ملزمة في الموقع النشط مثبط للسيارات11، منع قراءات من أي نشاط آخر في حوزتي.

تقدم هذه المقالة طريقة لتقييم دالة PCSK9 proteolytic في أزياء الفائق8. من خلال موقع الموجه الطفرات، يمكن استخدام المحققين هذا الفحص للتحقيق في آثار الترميز بطانات وجدت في العيادة تقييم هذه الآثار في بروتيوليسيس، هذه الخطوة الحد من معدل نضج PCSK9. بالإضافة إلى ذلك، سوف تكون هذه الطريقة مفيدة في تصميم شاشات الفائق لتحديد المغيرون بروتيوليسيس PCSK9، التي يتوقع أن في نهاية المطاف تعطيل عرض PCSK9 إلى LDL-R (وتعدل تأثير hypercholesterolemic PCSK9 's) . وأخيراً، هذا البروتوكول يمكن تكييفه البروتياز الأخرى مع جوهرها قلة النشاط، شريطة أن ط) زوج حوزتي الركازة محددة ويمكن الاطلاع على، والثاني) رابط داخل الخلايا مناسبة يمكن أن تنشأ للركيزة.

Protocol

1-موقع الموجه الطفرات حوزتي المتجهات

  1. تصميم وترتيب النوكليوتيد تجميع مخصص لتثبيت طفرة الاهتمام باستخدام تعديل البروتوكولات القياسية الطفرات الموجهة الموقع12. كبسولة تفجير ديسالتيد القياسية (بدون تنقية إضافية) مقبولة تماما.
    ملاحظة: نهج عام للتصاميم التمهيدي يتضمن إنشاء الإشعال متداخلة جزئيا كما هو مبين في الجدول 1، باستخدام آلة حاسبة درجة حرارة (Tm) ذوبان محددة إلى بوليميريز للفائدة.
  2. إعداد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (تقارير إتمام المشروعات) للطفرات موقع الموجه على الجليد، كما هو مبين في الجدول 2.
  3. دورة تقارير إتمام المشروعات كما هو مبين في الجدول 3.
  4. تشغيل 2-5 ميليلتر من كل بكر على 1% [اغروس] هلام ووضع تصور للمنتجات لتأكيد تضخيم نجاح.
    ملاحظة: سوف تظهر PCR ناجح عصابة الحمض النووي واحد، بارزة في العلامة الحجم التقريبي للقالب (~7.8 كيلو بايت).
  5. إضافة 0.5 ميليلتر (لكل رد فعل 25-ميليلتر) من دبني واحتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية ح 1.
  6. تحويل 2 ميليلتر من رد الفعل إلى كيميائيا المختصة الإشريكيّة القولونية.
    ملاحظة: سلالة كولاي تنمو بسرعة سوف يقلل مرات الحضانة، ولكن أي سلالة الاستنساخ يكون مقبولاً.
  7. لوحة التحولات على أجار بيرتاني لوريا (رطل) الذي يحتوي على 50-100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  8. حدد المستعمرات 2-4 أن ينمو في ظل ثقافة صغيرة (2-5 مل متوسطة رطل مع 50-100 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين). احتضان ثقافة عند 37 درجة مئوية عند 220 دورة في الدقيقة حتى أنه عكر.
  9. عزل بلازميد الحمض النووي من الخلايا باستخدام مجموعة أدوات تنقية (أي، "مينيبريب") الحمض النووي بلازميد وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. قياس تركيز الحمض النووي الوتيد استخدام جهاز المطياف الضوئي ميكروفولومي.
  10. التسلسل بلازميد الحمض النووي على نطاق واسع باستخدام خدمة تسلسل سانجر (مثل الأساسية أو منشأة تجارية). إعداد عينات الحمض النووي طبقاً للمواصفات الخاصة بالخدمة. تتم الإشارة إلى الإشعال المستخدمة بنجاح في ردود الفعل السابقة التسلسل في الجدول 4.
    ملاحظة: بسبب التضخيم بكر من بلازميد كامل، ينصح تسلسل المنطقة بأكملها PCSK9 الترميز لكل متحولة.

2-الفائق على أساس لوسيفراس بروتيوليسيس الإنزيم

  1. خلية الطلاء (يوم 0)
    1. استخدام خلايا HEK293T مرور منخفضة لتجارب وثقافة في دولبيكو لتعديل النسر المتوسطة (دميم) مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS). أداء كل خلية العمل تحت ظروف معقمة في غطاء زراعة الأنسجة حتى جاهزة الاعتداء بنشاط لوسيفراس. ويقدر عدد الآبار والصفائح اللازمة للتجربة، توقع أن ترانسفيكشنز سوف تتم في ثلاث نسخ لكل حالة اختبار.
    2. ننأى بالخلايا HEK293T من قارورة أصل بمعاملتها مع كمية ضئيلة من 0.05% حمض التربسين-الإيثيلين (يدتا) لتغطية الخلايا. إلغاء تنشيط التربسين-يدتا مع وحدات التخزين 2 من دميم وتستكمل مع 10% FBS ونقل الخلايا إلى أنبوب عقيمة. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي خلية (وتلطيخ مع تريبان الأزرق). الطرد المركزي الأنبوب في 500 x ز لمدة 5 دقائق لاستعادة الخلايا.
    3. نضح المتوسطة المحتوية على التربسين وتشكيل الخلايا في المتوسط الثقافة إلى تركيز من 2 × 105 خلايا/مل. استخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 100 ميليلتر من الخلايا لكل بئر من لوحة 96-بئر الأبيض (كامد-أسفل)، الذي يعطي تركيز بذر نهائي من 2 × 104 خلايا/جيدا.
      ملاحظة: لإجراء تجارب أولية، قد يكون من المفيد أن البذور بالإضافة إلى ذلك الأخت، واضحة-أسفل لوحة 96، حسنا، بغية رصد نمو الخلايا وتمسك خلال المراسم ودليل المستقبل استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
    4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة.
    5. إعداد لوحة رئيسية من البلازميدات في شكل 96-جيدا. تمييع كل بلازميد في شطف المخزن المؤقت (تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.5) إلى 50 نانوغرام/ميليلتر في بئر فردية من صفيحة 96-جيدا.
      1. إعداد كل 4 آبار ل بلازميد السيطرة الإيجابية (WT)8، بلازميد مراقبة سلبية (S386A)8، وخالية من بلازميد المخزن المؤقت (بالنسبة ترانسفيكشنز وهمية). إذا كانت المخدرات أو غيرها من العلاجات المستندة إلى الخلوي ويجري التخطيط، ثم إعداد اللوحة الرئيسية مع بلازميد السيطرة الإيجابية (WT) في كل بئر، جنبا إلى جنب مع 4 آبار كل بلازميد مراقبة سلبية (S386A) وخالية من بلازميد المخزن المؤقت.
  2. تعداء (1 يوم)
    1. إعداد الخليط تعداء في شكل لوحة 96-جيدا باستخدام لوحات 96-بئر من الآبار العميقة. تؤدي ترانسفيكشنز في ثلاث نسخ، ويجري التأكد من إعداد الكواشف ما يكفي لحساب الخسائر بيبيتينج ونقل.
      ملاحظة: إعداد الحسابات التالية كاشف ما يكفي لتشغيل لوحة 96-بئر واحدة في ثلاث نسخ (تقدير متحفظ لآبار 420).
      1. جعل مزيج رئيسي من كاشف تعداء الدهون المخفف، إضافة 50.4 ميليلتر من الكاشف إلى 2050 ميليلتر من المصل خفض المتوسطة. جعل مزيج رئيسي من كاشف بريكومبليكسيشن الحمض النووي، مشيراً إلى 33.6 ميليلتر من الكاشف في 1730 ميليلتر من المصل خفض المتوسطة.
      2. استخدام ماصة متعددة القنوات، الكوة ميليلتر 16.8 من خليط كاشف بريكومبليكسيشن الحمض المخفف في كل بئر من الآبار العميقة لوحة.
      3. استخدام ماصة متعددة القنوات، اليكووت 3.2 ميليلتر (160 ng) لكل بلازميد من اللوحة الرئيسية إلى كل بئر من الآبار العميقة لوحة.
      4. استخدام ماصة متعددة القنوات، الكوة ميليلتر 20 من خليط كاشف تعداء الدهون المخفف لكل جيد من اللوحة وتخلط محتويات كل جيدا باستخدام ماصة متعددة القنوات. تغطي اللوحات، والسماح لهم بالجلوس في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10-15 دقيقة لنموذج المجمعات الدهن: الحمض النووي.
        ملاحظة: عند تعداء، المكونات النهائية الواحدة وكذلك ستكون على النحو التالي: 40 نانوغرام من الحمض النووي و 0.12 ميليلتر من تعداء كاشف 0.08 ميليلتر من كاشف كومبليكساتيون قبل الحمض النووي، ومحتوى كل منها سيكون جيدا 10 ميليلتر في الحجم الإجمالي (المصل خفض متوسط).
    2. تبادل بلطف المتوسطة على الخلايا 293T في لوحات 96-كذلك استخدام ماصة متعددة القنوات، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا. استبدال المتوسطة يستنشق مع 95 ميليلتر من دميم وتستكمل مع 10% FBS.
      ملاحظة: هذا سيكون وقتاً مناسباً لعلاج الخلايا مع أي مخدر للفائدة.
    3. إضافة 10 ميليلتر من خليط تعداء لكل مناسبة جيدا عن طريق ماصة متعددة القنوات. بلطف دوامة لوحة لخلط المحتويات في الآبار. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع 5% CO2 ل 24 ساعة.
      ملاحظة: وحدة التخزين النهائي من الآبار يأتي إلى 105 ميليلتر، لحساب التبخر أكثر من 24 ساعة.
  3. الفحص (اليوم 2)
    1. تعد حلاً أسهم الكاشفات كولينتيرازيني: اسكوربات الصوديوم م 3 [حله في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS)، أعدت طازجة] وكلوريد الصوديوم م 5، 10 ملغ/مل ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة؛ وتم حله في برنامج تلفزيوني، أعدت طازجة) وكولينتيرازيني 2 مم (حله في والميثانول المحمضة تحتوي على 200 ميليلتر من 3 N HCl كل مل 10).
      ملاحظة: يمكن تخزين كولينتيرازيني 2 مم لمدة أسبوعين عندما يتم الاحتفاظ في-80 درجة مئوية، وفي غياب الضوء.
    2. إعداد 2 x coelenterazine الكواشف لقراءات لوسيفراس، مع كاشف منفصلة كل الخلايا والمتوسطة، وفقا الجدول 5. تخلط جميع الكواشف احفظ كولينتيرازيني أولاً، تصفية الخليط من خلال عامل تصفية حقنه 0.22 ميكرومتر ثم قم بإضافة كولينتيرازيني. حماية الكواشف من الضوء حتى أنهم على استعداد لإضافة إلى اللوحات.
      ملاحظة: بسبب فقدان الحل من الترشيح، جعل كاشف ما يكفي لحساب الخسائر في كلا من الترشيح، وكذلك من عمليات النقل. ويبين الجدول 5 تركيز النهائي من الكواشف 2 x (فضلا عن مقدار حل الأسهم إضافة إلى تلا لوح واحد 96-جيدا مع كاشف واحد).
    3. إزالة الخلايا من الحاضنة 24 ساعة بعد تعداء. استخدام ماصة متعددة القنوات، نقل 50 ميليلتر من المتوسطة مكيفة من كل بئر لصفيحة 96-جيدا (معتم) الطازجة والقاع الأبيض.
      1. قم بتسمية لوحات فيما يتعلق بما إذا كانت تحتوي على المتوسط أو الخلايا. إذا كان ترانسفيكتيد أكثر من 96-جيدا لوحة، تسمية لوحات لضمان أن كل لوحة تحتوي على المتوسط هو يقترن به طبق الأصل من الخلايا.
    4. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميليلتر من 2 × كاشف كولينتيرازيني غير الحال إلى اللوحة التي تحتوي على فقط مكيفة المتوسطة. روك بلطف أو اهتزاز اللوحة في غياب الضوء لمدة 5-10 دقيقة في الرايت
    5. استخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 50 ميليلتر من كاشف كولينتيرازيني الحال x 2 إلى اللوحة التي تحتوي على الخلايا. روك بلطف أو اهتزاز اللوحة في غياب الضوء لمدة 5-10 دقيقة في الرايت
    6. بعد الحضانة، وقرأ التﻷلؤ لصفيحة متوسطة فقط في قارئ لوحة. بعد ذلك، تلا التﻷلؤ اللوحة التي تحتوي على خلايا في نفس القارئ لوحة.
    7. تجاهل اللوحات وحفظ الملفات لتحليل البيانات.

3-بيانات التحليل

  1. القيام بتحليل بيانات أولية استخدام برامج جداول البيانات. إنشاء جدول يحتوي على النتائج من الخلية ولوحات متوسطة الحجم.
  2. يدوياً فحص البيانات من لوحات الخلية لتحديد آبار transfected سيئة. الآبار التي تظهر < 5%-10% من قراءات بلازميد مراقبة سلبية (S386A) ينبغي النظر سيئة كما ترانسفيكتيد، مما يجعل تفسير تلك البيانات المشتبه فيه.
  3. حساب التﻷلؤ متوسط الخلفية لكل لوحة من آبار transfected وهمية. قم بطرح الخلفية لكل لوحة من قيم تلك اللوحة.
    ملاحظة: قد تكون هذه القيمة لا يعتد بها تبعاً للقارئ لوحة المستخدمة.
  4. عملية البيانات عن طريق حساب نسبة النشاط لوسيفراس في المتوسط مقارنة بالنشاط لوسيفراس الشاملة لكل بئر. لوحة الخلية يحتوي على كلا المتوسطة مكيفة بالإضافة إلى الخلايا، ولوحة المتوسطة فقط يحتوي على نفس الكمية من المتوسطة المكيفة كلوحة الخلية، فمن المناسب استخدام المعادلة التالية:
    figure-protocol-8996
    هنا، رلو = وحدات التﻷلؤ النسبي، وقراءات مطروحاً على خلفية من قارئ لوحة.
  5. حساب لوسيفراس يفرز يعني سيطرة إيجابية (وزن)، وآبار مراقبة سلبية (S386A).
  6. تقييم الجودة الشاملة للتجربة عن طريق حساب معامل Z13:
    figure-protocol-9310
    ملاحظة: القيم النشطة التي تأتي من عنصر التحكم الإيجابي (WT) والقيم غير النشطة التي تأتي من آبار المراقبة السلبية (S386A). تشير القيم أقرب إلى 1 إلى أعلى جودة تجريبية. النظر في تكرار التجربة أو تحسين سير العمل إذا كانت القيمة أقل من 0.
  7. نقل البيانات من برنامج جداول البيانات إلى برمجيات تحليل البيانات العلمية.
  8. تطبيع بالنشاط لوسيفراس يفرز القيم الوسطية في مراقبة إيجابية (WT) ومراقبة سلبية (S386A)، وضع عنصر التحكم الإيجابي 1 ومراقبة سلبية ك 0.
  9. تنظيف البيانات للقيم المتطرفة باستخدام الأسلوب إزالة (هزيمة) الانحدار والخارجة، تحديد معدل اكتشاف كاذبة كحد أقصى إلى 1%.
  10. تقييم لفروق معتد بها إحصائيا بمقارنة البيانات الخاصة بكل حالة المسخ (أو متحولة) يعني النشاط WT (تطبيع إلى قيمة 1). أداء متعددة مزاوج تي-الاختبارات، تصحيح لمقارنات متعددة باستخدام أسلوب هولم-سيداك و α = 0.05.

النتائج

والرزن proteolysis الفائق يعتمد على التغلب على التحديات الرئيسية الثلاثة. أولاً، للتغلب على إخراج متدنية ارتباطاً وثيقا حوزتي PCSK9 واحد--دوران، حوزتي PCSK9 تفتقر المثبطة برودوماين يستخدم، مع تسلسل الانقسام في ذيل برودوماين ترتبط لوسيفراس يمكن أن يفرز14. ثانيا، لتلبي...

Discussion

الإجراءات التجريبية المذكورة أعلاه يقدم طريقة للتغلب على نشاط متدنية ارتباطاً وثيقا حوزتي واحدة--دوران PCSK9 وتقييم وظيفتها بروتيوليتيك بطريقة قوية. والمفهوم الرئيسي للمقايسة يعتمد على تحويل حدث واحد--دوران قراءات تضخيم انزيماتيكالي. وتشمل مواطن القوة المقايسة زمني قصير نسبيا وسهولة الاس...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون دعم التمويل السخي من نهلبي/المعاهد الوطنية للصحة (K08 HL124068 و LRP HMOT1243)، والمعاهد الوطنية للصحة/نكاتس عن طريق UCSF السريرية ومتعدية معهد محفز برنامج العلوم (UL1 TR000004)، UCSF الأكاديمي، مؤسسة هيلمان، جائزة الباحث بحوث العلوم جلعاد وجائزة فايزر اسباير القلب والأوعية الدموية (كل إلى جون س. كوربا) ومعهد هاوارد هيوز الطبي (لادري م. غالبان وكيفان م. شوكت).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR TubesUSA Scientific1402-2900For PCR
Q5 Hot StartNew England BiolabsM0493LHigh-fidelity DNA Polymerase
Deoxynucleotide Solution MixNew England BiolabsN0447LdNTPs (for PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WTAuthorsn/aAvailable from authors
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386AAuthorsn/aAvailable from authors
Agarose LEGold BiotechnologyA-201-100For DNA gels
E-Gel Imager System with Blue Light BaseThermoFisher Scientific4466612For imaging DNA gels
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisher ScientificS33102For DNA gels
Tris BaseThermoFisher ScientificBP152-1For DNA gel running buffer
Glacial acetic acidThermoFisher ScientificA38-500For DNA gel running buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid solutionMillipore Sigma3690EDTA, for DNA gel running buffer
1 kb DNA ladderGold BiotechnologyD010DNA ladder
DpnINew England BiolabsR0176SRestriction enzyme
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillinTeknovaL1010LB-Carb plates
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coliThermoFisher ScientificC862003Chemically competent cells
LB Broth, MillerThermoFisher ScientificBP1426-2LB
CarbenicillinGold BiotechnologyC-103-5Selective antibiotic
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit IOmega BioTekD6942-02DNA Purification Miniprep kit
NanoDrop 2000 SpectrophotomerThermoFisher ScientificND-2000CSpectrophotometer
293T CellsAmerican Tissue Culture Collection (ATCC)CRL-3216HEK 293T cells
DMEM, high glucose, pyruvateThermoFisher Scientific11995065DMEM, mammalian cell media
Fetal Bovine SeraAxenia BiologixF001FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermoFisher Scientific25300062Trypsin, for cell dissociation
Phosphate buffered saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023PBS
Countess automated cell counterThermoFisher ScientificC10227Automated cell counting
Countess cell counting chamber slidesThermoFisher ScientificC10228Slides for cell counting
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with LidGrenier Bio-One655083White, white-bottom 96 well plate
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, naturalUSA Scientific1402-959696 well plate for master plasmid plate
Nunc 2.0mL DeepWell PlatesThermoFisher Scientific27874396 well deep well plate
Lipofectamine 3000ThermoFisher ScientificL3000008Lipid transfection reagent, Lf3K
P3000 ReagentThermoFisher ScientificL3000008DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K
OptiMEM I Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific31985062Reduced serum medium for transfection
(+)-Sodium L-ascorbateMillipore SigmaA4034Sodium ascorbate
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888NaCl
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy MetalsMillipore Sigma12659BSA
Methanol (HPLC)ThermoFisher ScientificA4524MeOH
Hydrochloric acidVWRJT9535-2Concentrated HCl
CoelenterazineGold BiotechnologyCZ2.5Luciferase substrate
Syringe Filter, SterileThermoFisher Scientific09-720-3Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+Rainin17013810Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+Rainin17013808Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+Rainin17013807Multichannel pipette
Reagent reservoirCorning4870Trough for reagents
Centrifuge tubes, 15 mLThermoFisher Scientific05-539-1215 mL tubes
Centrifuge tubes, 50 mLCorning43082950 mL tubes
Spark Microplate ReaderTecanN/aPlate Reader
ExcelMicrosoft2016 for MacSpreadsheet software
PrismGraphPad Softwarev7Scientific data analysis software

References

  1. Park, S. W., Moon, Y. A., Horton, J. D. Post-transcriptional regulation of low density lipoprotein receptor protein by proprotein convertase subtilisin/kexin type 9a in mouse liver. Journal of Biological Chemistry. 279 (48), 50630-50638 (2004).
  2. Cohen, J. C., Boerwinkle, E., Mosley, T. H., Hobbs, H. H. Sequence variations in PCSK9, low LDL, and protection against coronary heart disease. New England Journal of Medicine. 354 (12), 1264-1272 (2006).
  3. Ridker, P. M., et al. Cardiovascular Efficacy and Safety of Bococizumab in High-Risk Patients. New England Journal of Medicine. 376 (16), 1527-1539 (2017).
  4. Sabatine, M. S., et al. Evolocumab and Clinical Outcomes in Patients with Cardiovascular Disease. New England Journal of Medicine. 376 (18), 1713-1722 (2017).
  5. Kazi, D. S., et al. Cost-effectiveness of PCSK9 Inhibitor Therapy in Patients With Heterozygous Familial Hypercholesterolemia or Atherosclerotic Cardiovascular Disease. Journal of the American Medical Association. 316 (7), 743-753 (2016).
  6. Kazi, D. S., et al. Updated Cost-effectiveness Analysis of PCSK9 Inhibitors Based on the Results of the FOURIER Trial. Journal of the American Medical Association. 318 (8), (2017).
  7. Pettersen, D., Fjellström, O. Small molecule modulators of PCSK9 - A literature and patent overview. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 28 (7), 1155-1160 (2018).
  8. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Stepwise processing analyses of the single-turnover PCSK9 protease reveal its substrate sequence specificity and link clinical genotype to lipid phenotype. Journal of Biological Chemistry. 293 (6), 1875-1886 (2018).
  9. Maxwell, K. N., Breslow, J. L. Adenoviral-mediated expression of Pcsk9 in mice results in a low-density lipoprotein receptor knockout phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (18), 7100-7105 (2004).
  10. Benjannet, S., et al. NARC-1/PCSK9 and its natural mutants: zymogen cleavage and effects on the low density lipoprotein (LDL) receptor and LDL cholesterol. Journal of Biological Chemistry. 279 (47), 48865-48875 (2004).
  11. Cunningham, D., et al. Structural and biophysical studies of PCSK9 and its mutants linked to familial hypercholesterolemia. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (5), 413-419 (2007).
  12. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnology. 8, 91 (2008).
  13. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  14. Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS Chemical Biology. 7 (11), 1848-1857 (2012).
  15. McNutt, M. C., Lagace, T. A., Horton, J. D. Catalytic activity is not required for secreted PCSK9 to reduce low density lipoprotein receptors in HepG2 cells. Journal of Biological Chemistry. 282 (29), 20799-20803 (2007).
  16. Chorba, J. S., Shokat, K. M. The proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) active site and cleavage sequence differentially regulate protein secretion from proteolysis. Journal of Biological Chemistry. 289 (42), 29030-29043 (2014).
  17. Benjannet, S., Rhainds, D., Hamelin, J., Nassoury, N., Seidah, N. G. The proprotein convertase (PC) PCSK9 is inactivated by furin and/or PC5/6A: functional consequences of natural mutations and post-translational modifications. Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30561-30572 (2006).
  18. Zhao, Z., et al. Molecular characterization of loss-of-function mutations in PCSK9 and identification of a compound heterozygote. American Journal of Human Genetics. 79 (3), 514-523 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

138 9 low density lipoprotein low density lipoprotein

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved