Un haut débit de luciferase pour évaluer la protéolyse de la PCSK9 protéase de simple-chiffre d’affaires

Résumé

Ce protocole présente une méthode pour évaluer l’activité protéolytique d’une protéase intrinsèquement peu fréquentés, seul chiffre d’affaires dans un contexte cellulaire. Plus précisément, cette méthode est appliquée pour évaluer l’activité protéolytique de PCSK9, un facteur clé du métabolisme lipidique, dont l’activité protéolytique est requise pour sa fonction ultime hypercholestérolémique.

Résumé

Proprotéine convertase subtilisine/kexin type 9 (PCSK9) est une protéase de simple-chiffre d’affaires qui régule le taux de lipoprotéines de basse densité (LDL) de sérum et, par conséquent, les maladies cardiovasculaires. Bien que PCSK9 protéolyse est nécessaire pour son effet hypercholestérolémique complet, l’évaluation de sa fonction protéolytique est difficile : PCSK9 est connue uniquement en conjonction avec elle-même, subit une seul un chiffre d’affaires unique et après protéolyse, conserve son substrat dans son site actif comme auto-inhibiteur. Les méthodes présentées ici décrivent un test qui permet de surmonter ces défis. Le test se concentre sur la protéolyse intermoléculaire dans un contexte de base de cellules et clivage réussie de liens à l’activité de la luciférase sécrétées, qui peut être lues facilement dans le milieu conditionné. Via les étapes séquentielles de la mutagenèse, transfection transitoire et une lecture de la luciférase, le dosage peut sonder PCSK9 protéolyse dans des conditions d’une perturbation soit génétique ou moléculaire de manière haut débit. Ce système est bien adapté pour les deux l’évaluation biochimique des faux-sens cliniquement découverte single-nucléotides simples (SNP), ainsi que pour le dépistage des inhibiteurs de petites molécules de PCSK9 protéolyse.

Introduction

PCSK9 cible le récepteur des LDL (LDL-R) pour la dégradation, élever le taux de cholestérol LDL (LDL-C) et la conduite de maladie cardiaque athéroscléreuse^1,2. PCSK9 ciblage thérapeutique solidement abaisser le LDL-C et améliorer les effets cardiovasculaires des patients, même quand on ajoute un traitement hypolipidémiant agressif avec statines^3,4. Cependant, thérapies actuellement approuvées se limitent aux approches axées sur les anticorps et souffrent d’un manque de rentabilité de^5,6. Pour résoudre ce problème, les alternatives thérapeutiques moins coûteux, un moyen d’identifier les patients susceptibles de gagner le plus d’avantages, ou les deux, sont nécessaires.

Approches de petit-molécule pourraient cibler PCSK9 intracellulaire, fournir une meilleure voie d’administration et réduire les coûts, rendant le « Saint Graal » dans cette zone⁷. Cependant, PCSK9 s’avère difficile à drogue de petites molécules. Comme une protéase, ciblant la fonction protéolytique de PCSK9 est une stratégie séduisante, comme self-protéolyse est l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation⁸ et est requise pour son effet maximal sur le LDL-R⁹. A ce jour, cependant, cette stratégie n’a pas été couronnée de succès, probablement en raison de la biochimie unique de PCSK9 : PCSK9 seulement se fend¹⁰, effectuant une réaction de simple-chiffre d’affaires, et après soi-clivage, la PCSK9 prodomain demeure lié au site actif comme une auto-inhibiteur¹¹, empêchant l’affichage de toute autre activité de la protéase.

Cet article présente une méthode pour évaluer la fonction protéolytique PCSK9 en mode haut débit⁸. Par le biais de mutagenèse dirigée, enquêteurs peuvent utiliser ce test pour sonder les effets du codage SNP dans la clinique afin d’évaluer les effets sur la protéolyse, l’étape cinétiquement limitante de PCSK9 maturation. En outre, cette méthode sera utile dans la conception d’écrans de haut débit afin d’identifier des modulateurs de la protéolyse de PCSK9, qui devraient finalement perturbent la présentation de PCSK9 du LDL-r (et moduler l’effet hypercholestérolémiant de PCSK9) . Enfin, ce protocole peut être adapté aux autres protéases avec intrinsèquement faible activité, pourvu que i) une paire de substrat-protéase spécifique se retrouve, et ii) un point d’ancrage intracellulaire approprié peut être établi pour le substrat.

Protocole

1. mutagenèse du vecteur de la protéase

1. Conception et commande personnalisée-synthétisés oligonucléotides d’installer une mutation d’intérêt à l’aide d’une modification des protocoles de mutagenèse standard¹². Des amorces de morue dessalées standards (sans purification supplémentaire) sont parfaitement acceptables.
   Remarque : Une approche générale aux conceptions de l’apprêt consiste à créer des amorces partiellement superposés comme indiqué au tableau 1, à l’aide d’une calculatrice de température (T_m) fusion spécifique à la polymérase d’intérêt.
2. Mettre en place des réactions en chaîne par polymérase (PCR) pour la mutagénèse dirigée sur la glace, comme il est indiqué dans le tableau 2.
3. Comme il est indiqué dans le tableau 3du cycle des RFT.
4. Exécuter 2 à 5 µL de chaque PCR sur un gel d’agarose à 1 % et de visualiser les produits pour confirmer une amplification réussie.
   Remarque : Un ACP réussi indique une bande d’ADN unique, éminente dans le marqueur de taille approximative du gabarit (~7.8 Ko).
5. Ajouter 0,5 µL (par réaction de 25 µL) du DpnI et incuber les échantillons à 37 ° C pendant 1 h.
6. Transformer 2 µL de la réaction en chimiquement compétent Escherichia coli.
   Remarque : Une souche d’e. coli en pleine croissance réduira les temps d’incubation, mais toute souche clonage sera acceptable.
7. Plaque des transformations sur une gélose Luria-Bertani (LB) contenant la carbénicilline de 50 à 100 µg/mL. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C.
8. Sélectionnez 2-4 colonies à grandir dans une culture à petite échelle (2 à 5 mL de milieu LB avec carbénicilline de 50 à 100 µg/mL). Incuber la culture à 37 ° C à 220 tr/mn jusqu'à ce qu’il est trouble.
9. Isoler l’ADN des cellules à l’aide d’un kit de purification (c.-à-d., « miniprep ») ADN de plasmide selon les instructions du fabricant de plasmide. Quantifier la concentration d’ADN éluée à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume.
10. Séquencer l’ADN intensivement à l’aide d’un service de séquençage Sanger (par exemple un core ou l’installation commerciale) de plasmide. Préparer les échantillons d’ADN selon les spécifications du service. Amorces utilisées avec succès dans les réactions de séquençage préalable sont indiqués dans le tableau 4.
    Remarque : En raison de l’amplification par PCR du plasmide entier, le séquençage de toute la région codante de PCSK9 est recommandé pour chaque mutant.

2. high-throughput axée sur la luciférase protéolyse Assay

1. Placage de cellules (jour 0)
   1. Utiliser des cellules HEK293T basse-passage pour des expériences et une culture de Dulbecco modifiés milieu Eagle (DMEM) avec 10 % sérum fœtal (SVF). Effectuer tous travail dans des conditions stériles sous une hotte de vitroplants de cellules jusqu’au moment d’analyser l’activité de la luciférase. Estimer le nombre de puits et de plaques nécessaires pour l’expérience, anticipant que transfections seront dérouleront en trois exemplaires pour chaque condition testée.
   2. Dissocier les cellules HEK293T d’une fiole de parent en les traitant avec un volume minimal de 0,05 % acide de trypsine-tétraacétique (EDTA) pour couvrir les cellules. Inactiver la trypsine-EDTA et 2 volumes de DMEM additionné de 10 % FBS et transfert les cellules dans un tube stérile. Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (et coloration au trypan blue). Centrifuger le tube à 500 g pendant 5 min récupérer des cellules.
   3. Aspirer le milieu contenant la trypsine et reconstituer les cellules dans le milieu de culture à une concentration de 2 x 10⁵ cellules/mL. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 100 µL de cellules dans chaque puits d’une plaque de 96 puits blanc (opaque bas), qui donne une concentration finale de semis de 2 x 10⁴ cellules/puits.
      Remarque : Pour les premières expériences, il peut être utile amorcer en outre une soeur, clear-plaque 96 puits, afin de surveiller la croissance des cellules et l’adhérence au cours du protocole et le guide des pannes futures.
   4. Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO₂ pendant 24 h.
   5. Préparer un plat principal des plasmides dans un format de 96 puits. Diluer chaque plasmide dans la mémoire tampon d’élution (Tris-HCl, pH 8,5) à 50 ng/µL dans un puits individuel d’une plaque de 96 puits.
      1. Préparer 4 puits de chaque pour le contrôle positif (WT) plasmide⁸, contrôle négatif (S386A) plasmide⁸et tampon sans plasmide (pour transfections simulées). Si les médicaments ou autres traitements cellulaires sont prévus, puis préparent le plat principal avec le plasmide contrôle positif (WT) dans chaque puits, ainsi que de 4 puits chacune le plasmide contrôle négatif (S386A) et le tampon sans plasmide.
2. Transfection (jour 1)
   1. Préparer le mélange de transfection dans un format de plaque 96 puits à l’aide de plaques de 96 puits profonds puits. Effectuer les transfections en triple exemplaire, en veillant à préparer suffisamment réactifs pour tenir compte des pertes de pipetage et de transfert.
      Remarque : Les calculs suivants préparent suffisamment réactif pour exécuter une plaque à 96 puits en triple exemplaire (estimé prudemment pour 420 puits).
      1. Faire un mélange maître d’un réactif de transfection de lipides dilué, ajoutant 50,4 µL de réactif à 2050 µL de sérum réduit moyen. Faire un mélange maître d’un réactif de precomplexation d’ADN, ajoutant 33,6 µL de réactif en 1730 µL de sérum réduit moyen.
      2. À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote 16,8 µL du mélange réactif de precomplexation d’ADN dilué dans chaque puits de la plaque de fond de puits.
      3. À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote µL de 3,2 (160 ng) de chaque plasmide de la plaque maître dans chaque puits de la plaque de fond de puits.
      4. À l’aide d’une pipette multicanaux, aliquote 20 µL du mélange réactif dilué lipides transfection à chaque puits de la plaque et mélanger le contenu de chaque bien à l’aide de la pipette multicanaux. Recouvrir les plaques et les laisser reposer à température ambiante (RT) pendant 10-15 min pour former des complexes lipides : ADN.
         Remarque : Après la transfection, les derniers éléments / puits auront lieu comme suit : 40 ng d’ADN, 0,12 µL de réactif de transfection et 0,08 µL de réactif de pre-complexation de l’ADN et le contenu de chaque bien sera 10 µL volume total (moyenne réduite et le sérum).
   2. L’échange doucement le support sur les cellules 293 t dans les plaques de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux, prenant soin de ne pas pour perturber les cellules. Remplacer le milieu atmosphérique avec 95 µL de DMEM supplémenté de 10 % FBS.
      Remarque : Ce serait une date appropriée pour traiter les cellules avec n’importe quel médicament d’intérêt.
   3. Ajouter 10 µL du mélange transfection dans chaque cas bien via une pipette multicanaux. Agiter doucement de la plaque pour mélanger le contenu dans les puits. Incuber les plaques à 37 ° C, avec 5 % de CO₂ pendant 24 h.
      Remarque : Le volume final des puits vient à µL 105, pour tenir compte de l’évaporation sur 24 heures.
3. Dosage (jour 2)
   1. Préparer une solution de coelenterazine réactifs : ascorbate de sodium 3M [dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), préparée frais] 5 M NaCl, 10 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA, dissous en PBS, préparés frais) et 2 mM coelenterazine (dissous dans méthanol acidifié contenant 200 µL de 3 HCl N / 10 mL).
      Remarque : La coelenterazine 2 mM peut être stocké pendant 2 semaines quand il est conservé à-80 ° C et en l’absence de lumière.
   2. Préparer 2 x coelenterazine réactifs pour la lecture de la luciférase, avec un réactif séparé chacun pour les cellules et le milieu, conformément au tableau 5. Mélanger tous les réactifs enregistrer la coelenterazine tout d’abord, filtrer le mélange à travers un filtre de seringue de 0,22 µm et puis ajoutez la coelenterazine. Protéger les réactifs de la lumière, jusqu'à ce qu’ils sont prêts à être ajoutés aux plaques.
      Remarque : En raison de la perte de la solution de filtration, faire assez réactif pour tenir compte de la perte de deux de filtration, ainsi que de transferts. Le tableau 5 montre la concentration finale de réactifs 2 x (ainsi que la quantité de solution mère à ajouter pour lire sur une plaque à 96 puits avec un réactif).
   3. Éliminer les cellules de l’incubateur 24h après la transfection. À l’aide d’une pipette multicanaux, transférer 50 µL de milieu conditionné de chaque puits d’une plaque à 96 puits (opaque) fraîche, à fond blanc.
      1. Étiqueter les plaques que s’ils contiennent des moyennes ou des cellules. Si plus d’une plaque à 96 puits a été transfectée, étiqueter les plaques afin de garantir que chaque plaque contenant du milieu est jumelée avec sa plaque de parent de cellules.
   4. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 µL de 2 x non-lytique coelenterazine réactif dans la plaque contenant uniquement le milieu conditionné. Doucement, rock ou secouer la plaque en l’absence de la lumière pendant 5-10 min à température ambiante.
   5. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajouter 50 µL de réactif de coelenterazine lytique 2 x la plaque contenant les cellules. Doucement, rock ou secouer la plaque en l’absence de la lumière pendant 5-10 min à température ambiante.
   6. Après l’incubation, lecture de la luminescence de la plaque support uniquement à l’aide d’un lecteur. Ensuite, lecture de la luminescence de la plaque contenant des cellules dans le même lecteur.
   7. Jeter les plaques et enregistrez les fichiers d’analyse des données.

3. analyse des données

1. Effectuer une analyse de données initiale à l’aide du tableur. Créer une feuille de calcul contenant les résultats de la cellule et les plaques moyennes.
2. Inspecter manuellement les données sur les plaques de la cellule pour identifier des puits mal transfectées. Puits qui montrent < 5 % - 10 % de la lecture du plasmide contrôle négatif (S386A) devrait être considérés comme aussi mal transfectées, rendant l’interprétation de ces données suspect.
3. Calculer la luminescence de fond moyenne de chaque plaque provenant des puits transfectées mock. Soustraire le fond de chaque plaque à partir des valeurs de cette plaque.
   Remarque : Cette valeur peut être négligeable selon le lecteur utilisé.
4. Traiter les données en calculant la proportion de l’activité de la luciférase dans le milieu par rapport à l’activité de la luciférase globale pour chaque puits. Parce que la plaque cellulaire contient les deux milieu conditionné en plus de cellules, et la plaque de support seule contienne la même quantité de milieu conditionné comme la plaque cellulaire, il convient d’utiliser l’équation suivante :
   
   Ici, RLU = unités de luminescence relative, l’affichage de la soustrait au fond du lecteur de plaque.
5. Calculer la moyenne luciférase sécrété du contrôle positif (WT) et les puits de contrôle négatif (S386A).
6. Évaluer la qualité globale de l’expérience en calculant un facteur Z¹³:
   
   Remarque : Les valeurs actives proviennent du contrôle positif (WT) et les valeurs inactives proviennent des puits témoin négatif (S386A). Valeurs plus proches à 1 indiquent une qualité supérieure expérimentale. Envisager la répétition de l’expérience ou en optimisant le flux de travail si la valeur est inférieure à 0.
7. Transférer les données du programme de feuille de calcul dans le logiciel d’analyse de données scientifiques.
8. Normaliser l’activité de la luciférase sécrétée pour les valeurs moyennes du contrôle positif (WT) et le contrôle négatif (S386A), définissant le contrôle positif comme le 1 et le contrôle négatif comme 0.
9. Nettoyer les données pour les valeurs aberrantes en utilisant la méthode de régression et aberrantes enlèvement (déroute), fixant le taux de découverte de faux maximum à 1 %.
10. Évaluer les différences statistiquement significatives en comparant les données pour chaque condition de mutant (ou mutant) à la moyenne de l’activité WT (normalisée à une valeur de 1). Effectuer plusieurs non-appariés t-tests, correction des comparaisons multiples à l’aide de la méthode Holm-Sidak et α = 0,05.

Résultats

Le dosage de la protéolyse du haut débit dépend de surmonter trois défis majeurs. Tout d’abord, pour pallier la sortie intrinsèquement faible d’une protéase de PCSK9 single-chiffre d’affaires, une protéase de PCSK9 manque l’inhibiteur prodomain sert, avec la séquence de clivage à la queue de le prodomain liée à une luciférase qui peut être sécrétées¹⁴. Deuxièmement, pour répondre au besoin de la protéase à plier complexe avec ses inhibit...

Discussion

Les procédures expérimentales décrites ci-dessus présentent une méthode pour surmonter l’intrinsèquement faible activité de la protéase de simple-chiffre d’affaires PCSK9 et évaluer sa fonction protéolytique de manière robuste. Le concept clé de l’analyse repose sur la conversion d’un événement unique-chiffre d’affaires en un affichage amplifié enzymatiquement. Les points forts de l’analyse sont relativement court délai et facilité d’utilisation de la luciférase journaliste, ainsi que son ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Tubes	USA Scientific	1402-2900	For PCR
Q5 Hot Start	New England Biolabs	M0493L	High-fidelity DNA Polymerase
Deoxynucleotide Solution Mix	New England Biolabs	N0447L	dNTPs (for PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT	Authors	n/a	Available from authors
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A	Authors	n/a	Available from authors
Agarose LE	Gold Biotechnology	A-201-100	For DNA gels
E-Gel Imager System with Blue Light Base	ThermoFisher Scientific	4466612	For imaging DNA gels
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102	For DNA gels
Tris Base	ThermoFisher Scientific	BP152-1	For DNA gel running buffer
Glacial acetic acid	ThermoFisher Scientific	A38-500	For DNA gel running buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	Millipore Sigma	3690	EDTA, for DNA gel running buffer
1 kb DNA ladder	Gold Biotechnology	D010	DNA ladder
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Restriction enzyme
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin	Teknova	L1010	LB-Carb plates
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C862003	Chemically competent cells
LB Broth, Miller	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	LB
Carbenicillin	Gold Biotechnology	C-103-5	Selective antibiotic
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I	Omega BioTek	D6942-02	DNA Purification Miniprep kit
NanoDrop 2000 Spectrophotomer	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	Spectrophotometer
293T Cells	American Tissue Culture Collection (ATCC)	CRL-3216	HEK 293T cells
DMEM, high glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11995065	DMEM, mammalian cell media
Fetal Bovine Sera	Axenia Biologix	F001	FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300062	Trypsin, for cell dissociation
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	PBS
Countess automated cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227	Automated cell counting
Countess cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10228	Slides for cell counting
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid	Grenier Bio-One	655083	White, white-bottom 96 well plate
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural	USA Scientific	1402-9596	96 well plate for master plasmid plate
Nunc 2.0mL DeepWell Plates	ThermoFisher Scientific	278743	96 well deep well plate
Lipofectamine 3000	ThermoFisher Scientific	L3000008	Lipid transfection reagent, Lf3K
P3000 Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000008	DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K
OptiMEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062	Reduced serum medium for transfection
(+)-Sodium L-ascorbate	Millipore Sigma	A4034	Sodium ascorbate
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	NaCl
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals	Millipore Sigma	12659	BSA
Methanol (HPLC)	ThermoFisher Scientific	A4524	MeOH
Hydrochloric acid	VWR	JT9535-2	Concentrated HCl
Coelenterazine	Gold Biotechnology	CZ2.5	Luciferase substrate
Syringe Filter, Sterile	ThermoFisher Scientific	09-720-3	Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+	Rainin	17013810	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	Rainin	17013808	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+	Rainin	17013807	Multichannel pipette
Reagent reservoir	Corning	4870	Trough for reagents
Centrifuge tubes, 15 mL	ThermoFisher Scientific	05-539-12	15 mL tubes
Centrifuge tubes, 50 mL	Corning	430829	50 mL tubes
Spark Microplate Reader	Tecan	N/a	Plate Reader
Excel	Microsoft	2016 for Mac	Spreadsheet software
Prism	GraphPad Software	v7	Scientific data analysis software