Um ensaio de Luciferase de alto rendimento para avaliar a proteólise de PCSK9 a Protease Single-volume de negócios

Resumo

Este protocolo apresenta um método para avaliar a atividade proteolítica de uma protease de baixa atividade intrinsecamente, único volume de negócios em um contexto celular. Especificamente, esse método é aplicado para avaliar a atividade proteolítica de PCSK9, um motor essencial do metabolismo lipídico, cuja atividade proteolítica é necessária para sua função final hipercolesterolêmicos.

Resumo

Proprotein convertase subtilisina/kexin tipo 9 (PCSK9) é uma protease de single-volume de negócios que regula os níveis de lipoproteína de baixa densidade (LDL) de soro e, consequentemente, as doenças cardiovasculares. Embora PCSK9 proteólise é necessária para seu efeito completo hipercolesterolêmicos, a avaliação da sua função proteolítica é desafiador: PCSK9 só é conhecido para decompor-se, submete-se apenas um único volume de negócios e após proteólise, retém seu substrato em seu sítio ativo como um inibidor de auto. Os métodos apresentados aqui descrevem um ensaio que supera esses desafios. O ensaio centra-se na proteólise intermolecular em um contexto de baseada em célula e decote bem sucedida de ligações para a atividade de luciferase secretada, que pode ser facilmente lido para fora no meio de condicionado. Através de etapas sequenciais de mutagénese, transfecção transiente e uma leitura de luciferase, o ensaio pode sonda PCSK9 proteólise em condições de perturbação genética ou molecular de forma de alta produtividade. Este sistema é adequado para ambos avaliação bioquímica de missense clinicamente descobertos single-nucleotide polimorfismos (SNPs), bem como quanto a triagem de inibidores da pequeno-molécula de proteólise PCSK9.

Introdução

PCSK9 metas o receptor de LDL (LDL-R) para degradação, aumentando o LDL colesterol (LDL-C) e conduzir a doença aterosclerótica do coração^1,2. Terapêutica alvo PCSK9 robustamente abaixar o LDL-C e melhorar resultados cardiovasculares para pacientes, mesmo quando adicionado a uma terapia agressiva hipolipemiantes com estatinas^3,4. Terapias actualmente aprovadas limitam-se a abordagens baseadas em anticorpos, no entanto e sofrem com a falta de rentabilidade^5,6. Para resolver este problema, alternativas terapêuticas menos onerosos, um meio para identificar pacientes propensos a obter maiores benefícios, ou ambos, são necessários.

Abordagens da pequeno-molécula poderiam alvo PCSK9 intracelular, fornecer uma melhor via de administração e reduzir custos, tornando-o "Santo Graal" nesta zona⁷. No entanto, PCSK9 provou difícil de drogas por pequenas moléculas. Como uma protease, direcionamento função proteolítica do PCSK9 é uma estratégia atraente, como autoproteólise é a etapa limitante de PCSK9 maturação⁸ e é necessário para o seu máximo efeito no LDL-R⁹. Até à data, no entanto, esta estratégia não teve êxito, provavelmente devido a bioquímica exclusiva do PCSK9: PCSK9 apenas se fende¹⁰, realizando uma reação de single-volume de negócios, e depois autoclivagem, o PCSK9 prodomínio permanece ligado no sítio activo como um autoinibidor¹¹, impedindo a leitura de qualquer atividade de protease mais.

Este artigo apresenta um método para avaliar PCSK9 função proteolítica na moda do elevado-throughput⁸. Através do mutagenesis local-dirigido, investigadores podem usar este teste para investigar os efeitos da codificação SNPs encontrados na clínica para avaliar os efeitos na proteólise, a etapa limitante de maturação PCSK9. Além disso, este método será útil no design de telas de alta produtividade para identificar moduladores de PCSK9 proteólise, que são antecipadas para, finalmente, interromper a apresentação de PCSK9 ao LDL-r (e modulam hipercolesterolêmicos efeito do PCSK9) . Por último, este protocolo pode ser adaptado para outras proteases com intrinsecamente baixa atividade, desde que i) um par de substrato-protease específico pode ser encontrado, e ii) uma âncora intracelular adequada pode ser estabelecida para o substrato.

Protocolo

1. local-dirigido Mutagenesis de Protease Vector

1. Design e ordem personalizada-sintetizados oligonucleotides instalar uma mutação de interesse usando uma modificação do padrão mutagenesis local-dirigido protocolos¹². Norma primeiras demão demolhadas (sem purificação adicional) são perfeitamente aceitáveis.
   Nota: Uma abordagem geral para projetos cartilha envolve a criação de cartilhas parcialmente sobrepostas conforme indicado na tabela 1, usando uma calculadora de temperatura (T_m) derretimento específica para o polymerase de interesse.
2. Criar reacções em cadeia do polymerase (PCR) para o mutagenesis local-dirigido no gelo, como indicado na tabela 2.
3. Ciclo do PCRs conforme indicado na tabela 3.
4. Executar 2-5 µ l de cada PCR em um gel de agarose a 1% e visualizar os produtos para confirmar uma amplificação bem sucedida.
   Nota: Um sucesso PCR irá mostrar uma única, proeminente banda de DNA no marcador do tamanho aproximado do modelo (~7.8 kB).
5. Adicionar 0,5 µ l (por reação de 25 µ l) de DpnI e incubar as amostras a 37 ° C por 1h.
6. Transforme a 2 µ l da reação em quimicamente competentes de Escherichia coli.
   Nota: Uma cepa de Escherichia coli de rápido crescimento irá reduzir os tempos de incubação, mas toda a tensão clonagem será aceitável.
7. Placa das transformações em ágar Luria-Bertani (LB) contendo carbenicilina de 50-100 µ g/mL. Incubar as placas durante a noite a 37 ° C.
8. Selecione 2-4 colônias para crescer em uma cultura em pequena escala (2-5 mL de meio LB com carbenicilina de 50-100 µ g/mL). Incube a cultura a 37 ° C a 220 rpm até que é turvo.
9. Isole o plasmídeo de DNA das células usando um kit de purificação (ou seja, "miniprep") do DNA de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Quantificar a concentração de DNA eluted usando um spectrophotometer microvolume.
10. Sequenciar o plasmídeo extensivamente usando um serviço de sequenciamento Sanger (como um núcleo ou instalações comerciais). Prepare as amostras de DNA de acordo com as especificações do serviço. Primers utilizados com sucesso em reações de sequenciamento prévia são anotados na tabela 4.
    Nota: Devido a amplificação por PCR do plasmídeo inteiro, o sequenciamento de toda região codificante PCSK9 é recomendado para cada mutante.

2. alta produtividade baseada em Luciferase Proteolysis ensaio

1. Chapeamento de célula (dia 0)
   1. Usar células de HEK293T baixa-passagem para experiências e uma cultura em de Dulbecco modificado médio águia (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS). Executar tudo celular trabalho sob condições estéreis de um capuz de cultura de tecido até que esteja pronto a ensaiar a atividade de luciferase. Estime o número de poços e placas necessárias para o experimento, antecipando que transfections serão realizadas em triplicata para cada condição testada.
   2. Dissocia o HEK293T células de um frasco de pai, tratando-as com um volume mínimo de 0,05% ácido de tripsina-ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) para cobrir as células. Inativar o tripsina-EDTA com 2 volumes de DMEM suplementado com 10% FBS e transferência das células para um tubo estéril. Contar as células usando um contador de célula automatizada (e coloração com trypan azul). Centrifugar o tubo a 500 x g por 5 min recuperar as células.
   3. Aspire o meio contendo tripsina e reconstituir as células em meio de cultura para uma concentração de 2 x 10⁵ células/mL. Usando uma pipeta multicanal, transferi 100 µ l de células a cada poço de uma placa de 96 poços de branco (opaco baixo), que dá uma concentração final de semeadura de 2 x 10⁴ células/poço.
      Nota: Para as experiências iniciais, pode ser útil propagar adicionalmente uma irmã, placa de 96 poços de clear-inferior, a fim de monitorar o crescimento celular e aderência durante o protocolo e a guia futuro de solução de problemas.
   4. Incube as celulas em 37 ° C e 5% CO₂ por 24 h.
   5. Prepare um prato principal de plasmídeos em um formato de 96 poços. Dilua cada plasmídeo em tampão de eluição (Tris-HCl, pH 8,5) para 50 ng / µ l em um poço individual de uma placa de 96 poços.
      1. Prepare 4 poços cada para o controlo positivo (WT) plasmídeo⁸, plasmídeo de controlo negativo (S386A)⁸e buffer livre de plasmídeo (para transfections simulados). Se as drogas ou outros tratamentos à base de celular estão sendo planejados e, em seguida, preparem a placa mestra com o plasmídeo controlo positivo (WT) em cada poço, juntamente com 4 poços de cada o plasmídeo controlo negativo (S386A) e o buffer de plasmídeo-livre.
2. Transfecção (dia 1)
   1. Prepare a mistura de transfeccao em um formato de placa de 96 poços, usando placas de 96 poços profundos-bem. Execute os transfections em triplicado, certificando-se de preparar suficiente reagentes para contabilizar perdas de pipetagem e transferência.
      Nota: Os cálculos a seguintes preparem suficiente reagente para executar uma placa de 96 poços em triplicado (estimado conservadora para 420 poços).
      1. Faça uma mistura de mestre de um reagente de Transfeccao de lipídios diluídos, adicionando 50,4 µ l de reagente para 2050 µ l de soro reduzido médio. Faça uma mistura de mestre de um reagente de precomplexation do DNA, adicionando 33.6 µ l de reagente em 1730 µ l de soro reduzido médio.
      2. Usando uma pipeta multicanal, alíquota 16.8 μL de DNA precomplexation reagente mistura diluída em cada poço da placa de fundo-bem.
      3. Usando uma pipeta multicanal, alíquota µ l 3.2 (160 ng) de cada plasmídeo da placa de mestre para cada poço da placa de fundo-bem.
      4. Usando uma pipeta multicanal, alíquota 20 µ l da mistura de reagente de transfeccao lipídico diluídos a cada bem da placa e misturar o conteúdo de cada poço usando a pipeta multicanal. Cobrir as placas e deixá-los sentar-se à temperatura ambiente (RT) por 10-15 min para formar complexos de lipídios: DNA.
         Nota: Em cima do transfection, os componentes finais por bem será a seguinte: 40 ng de DNA e 0,12 µ l de reagente de transfeccao 0,08 µ l de reagente de pre-complexação de DNA e o conteúdo de cada bem será 10 µ l em volume total (médio reduzido-soro).
   2. Suavemente, troca o médio sobre as células 293T nas placas de 96 poços, com uma pipeta multicanal, tomando cuidado para não perturbar as células. Substituir o medium aspirado com 95 ml de DMEM suplementado com 10% FBS.
      Nota: Este seria um momento apropriado para tratar as células com qualquer droga de interesse.
   3. Adicione 10 µ l da mistura de Transfeccao para cada apropriado bem através de uma pipeta multicanal. Agite suavemente a placa para misturar o conteúdo dos poços. Incube a placa a 37 ° C com 5% de CO₂ por 24 h.
      Nota: O volume final dos poços vem a 105 µ l, para dar conta da evaporação mais 24 h.
3. Ensaio (dia 2)
   1. Prepare uma solução stock de reagentes coelenterazine: ascorbato de sódio 3 M [dissolvido em tampão fosfato salino (PBS), preparado fresco], 5m NaCl, 10 mg/mL albumina de soro bovino (BSA; dissolvido em PBS, preparado fresco) e coelenterazine de 2mm (dissolvido em metanol acidificado contendo 200 µ l de 3 N HCl / 10 mL).
      Nota: O coelenterazine de 2 mM pode ser armazenado por 2 semanas, quando é mantida a-80 ° C e na ausência de luz.
   2. Prepare 2 reagentes de x coelenterazine para a leitura de luciferase, com um reagente separado cada para as células e o meio, de acordo com a tabela 5. Misture todos os reagentes de salvar o coelenterazine primeiro, filtrar a mistura através de um filtro de seringa 0,22 µm e em seguida, adicione o coelenterazine. Protege os reagentes da luz até que estejam prontos para serem adicionados às placas.
      Nota: Devido à perda de solução de filtragem, fazer bastante reagente para dar conta tanto a perda de filtração, bem como de transferências. A tabela 5 mostra a concentração final dos reagentes de 2 x (bem como a quantidade de solução para adicionar para ler uma placa de 96 poços com um reagente).
   3. Remova as células a incubadora 24 h após o transfeccao. Usando uma pipeta multicanal, transferi 50 µ l de meio condicionado de cada poço a uma placa de 96 poços (opaca) fresca, com fundo branco.
      1. Rotule as placas sobre se eles contêm médio ou células. Se mais de uma placa de 96 poços foi transfectada, rotule as chapas a fim de assegurar que cada placa contendo meio é emparelhada com sua placa mãe de células.
   4. Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 µ l de reagente de coelenterazine não-lítica de 2x para a placa contendo apenas meio de condicionado. Delicadamente, rock ou agitar a placa na ausência de luz, por 5-10 min no RT
   5. Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 µ l de reagente de coelenterazine lítica x 2 para a placa que contém as células. Delicadamente, rock ou agitar a placa na ausência de luz, por 5-10 min no RT
   6. Após a incubação, leia a luminescência da placa somente médio em um leitor de placa. Em seguida, leia a luminescência da placa que contém a célula no leitor de placa mesmo.
   7. Descartar as placas e salvar os arquivos para análise de dados.

3. análise de dados

1. Realizar uma análise inicial de dados usando o software de planilha eletrônica. Crie uma planilha contendo os resultados de célula e as placas de médio.
2. Inspecione manualmente os dados as chapas de célula para identificar mal transfectados poços. Poços que mostram < 5% - 10% da leitura do plasmídeo controlo negativo (S386A) deve ser considerado como mal transfectadas, tornando a interpretação desses dados suspeito.
3. Calcule a luminescência do fundo de cada prato dos poços de simulação-transfectadas. Subtrai o fundo de cada prato dos valores de matrícula.
   Nota: Este valor pode ser insignificante dependendo do leitor de placa usado.
4. Processo os dados calculando a proporção de atividade do luciferase a médio em comparação com a actividade do luciferase global para cada poço. Porque a placa de células contém ambos condicionados médio além de células, e a placa somente médio contém a mesma quantidade de meio condicionado como a placa de células, é apropriado usar a seguinte equação:
   
   Aqui, RLU = unidades de luminescência relativa, a leitura de fundo-subtraído do leitor de placa.
5. Calcule o médio luciferase secretado do controle positivo (WT) e os poços de controlo negativo (S386A).
6. Avalie a qualidade geral do experimento calculando um Z-fator¹³:
   
   Nota: Os valores activos de controlo positivo (WT) e valores de inativos dos poços de controlo negativo (S386A). Valores mais próximos de 1 indicam uma maior qualidade experimental. Considere-se repetir o experimento ou otimizando o fluxo de trabalho, se o valor for inferior a 0.
7. Transferi os dados do programa de planilha para software de análise de dados científicos.
8. Normalize a atividade de luciferase secretada para os valores médios do controle positivo (WT) e o controlo negativo (S386A), definindo o controle positivo como 1 e o controlo negativo como 0.
9. Limpe os dados para outliers usando o método de remoção (GOLEADA), regressão e aberrante, definindo a taxa máxima descoberta falsa para 1%.
10. Avalie as diferenças estatisticamente significativas, comparando os dados para cada condição mutante (ou mutante) para a média da atividade WT (normalizada para um valor de 1). Executar múltiplas unpaired t-testes, corrigindo para comparações múltiplas, usando o método Holm-Sidak e o α = 0,05.

Resultados

O ensaio de proteólise de alto rendimento depende de superar três grandes desafios. Primeiro, para superar a saída intrinsecamente baixa de uma protease de PCSK9 single-volume de negócios, uma protease PCSK9 falta o inibitório prodomínio é usado, com a sequência de clivagem na cauda do prodomínio ligada a um luciferase que pode ser secretada¹⁴. Em segundo lugar, para satisfazer a necessidade da protease de dobrar em complexo com sua inibitório prodomínio...

Discussão

Os procedimentos experimentais descritos acima apresentam um método para superar a intrinsecamente baixa atividade de protease a single-volume de negócios PCSK9 e avaliar sua função proteolítica de forma robusta. O conceito-chave do ensaio depende de conversão de um evento único-volume de negócios em uma leitura enzimaticamente amplificada. Os pontos fortes do ensaio incluem o prazo relativamente curto e facilidade de uso do repórter do luciferase, bem como sua capacidade de expansão para abordagens de alto ren...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Tubes	USA Scientific	1402-2900	For PCR
Q5 Hot Start	New England Biolabs	M0493L	High-fidelity DNA Polymerase
Deoxynucleotide Solution Mix	New England Biolabs	N0447L	dNTPs (for PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT	Authors	n/a	Available from authors
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A	Authors	n/a	Available from authors
Agarose LE	Gold Biotechnology	A-201-100	For DNA gels
E-Gel Imager System with Blue Light Base	ThermoFisher Scientific	4466612	For imaging DNA gels
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102	For DNA gels
Tris Base	ThermoFisher Scientific	BP152-1	For DNA gel running buffer
Glacial acetic acid	ThermoFisher Scientific	A38-500	For DNA gel running buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	Millipore Sigma	3690	EDTA, for DNA gel running buffer
1 kb DNA ladder	Gold Biotechnology	D010	DNA ladder
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Restriction enzyme
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin	Teknova	L1010	LB-Carb plates
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C862003	Chemically competent cells
LB Broth, Miller	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	LB
Carbenicillin	Gold Biotechnology	C-103-5	Selective antibiotic
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I	Omega BioTek	D6942-02	DNA Purification Miniprep kit
NanoDrop 2000 Spectrophotomer	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	Spectrophotometer
293T Cells	American Tissue Culture Collection (ATCC)	CRL-3216	HEK 293T cells
DMEM, high glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11995065	DMEM, mammalian cell media
Fetal Bovine Sera	Axenia Biologix	F001	FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300062	Trypsin, for cell dissociation
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	PBS
Countess automated cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227	Automated cell counting
Countess cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10228	Slides for cell counting
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid	Grenier Bio-One	655083	White, white-bottom 96 well plate
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural	USA Scientific	1402-9596	96 well plate for master plasmid plate
Nunc 2.0mL DeepWell Plates	ThermoFisher Scientific	278743	96 well deep well plate
Lipofectamine 3000	ThermoFisher Scientific	L3000008	Lipid transfection reagent, Lf3K
P3000 Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000008	DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K
OptiMEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062	Reduced serum medium for transfection
(+)-Sodium L-ascorbate	Millipore Sigma	A4034	Sodium ascorbate
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	NaCl
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals	Millipore Sigma	12659	BSA
Methanol (HPLC)	ThermoFisher Scientific	A4524	MeOH
Hydrochloric acid	VWR	JT9535-2	Concentrated HCl
Coelenterazine	Gold Biotechnology	CZ2.5	Luciferase substrate
Syringe Filter, Sterile	ThermoFisher Scientific	09-720-3	Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+	Rainin	17013810	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	Rainin	17013808	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+	Rainin	17013807	Multichannel pipette
Reagent reservoir	Corning	4870	Trough for reagents
Centrifuge tubes, 15 mL	ThermoFisher Scientific	05-539-12	15 mL tubes
Centrifuge tubes, 50 mL	Corning	430829	50 mL tubes
Spark Microplate Reader	Tecan	N/a	Plate Reader
Excel	Microsoft	2016 for Mac	Spreadsheet software
Prism	GraphPad Software	v7	Scientific data analysis software