高通量荧光素酶法评价单周转蛋白酶 PCSK9 的蛋白质水解

摘要

本协议提出了一种评估细胞内一种内在的低活性、单周转蛋白酶的蛋白水解活性的方法。具体来说, 该方法用于评价 PCSK9 的蛋白水解活性, 这是脂代谢的关键驱动力, 其蛋白水解活性是其最终胆固醇功能所必需的。

摘要

Proprotein convertase 枯草杆菌9型 (PCSK9) 是一种单周转蛋白酶, 它调节血清低密度脂蛋白 (LDL) 水平, 从而导致心血管疾病。尽管 PCSK9 蛋白水解是其完全胆固醇效果所必需的, 但对其蛋白水解功能的评价是有挑战性的: PCSK9 只知道它自己, 只经历一个单一的营业额, 并在蛋白质水解后, 保留其基底在其活性部位为自动抑制剂。这里提出的方法描述了一种克服这些挑战的试验。该方法的研究重点是细胞间蛋白水解, 并将成功的裂解与分泌的荧光素酶活性联系在一起, 可以很容易地在条件培养基中读出。通过突变、瞬变转染和荧光素酶读数的顺序步骤, 该方法可以在基因或分子摄动条件下, 在高通量的情况下 PCSK9 蛋白质水解。该系统非常适合于临床发现的无义单核苷酸多态性 (SNPs) 的生物化学评价, 以及筛选 PCSK9 蛋白水解物的小分子抑制剂。

引言

PCSK9 靶向 ldl 受体 (ldl R) 降解, 提高 ldl 胆固醇 (ldl C) 和驱动动脉粥样硬化性心脏病^1,2。治疗靶向 PCSK9 稳健低密度脂蛋白 C 和改善心血管结局的患者, 即使添加到积极的降脂治疗与他汀类药物^3,4。然而, 目前批准的疗法仅限于基于抗体的方法, 而且缺乏成本效益^5,6。为了解决这个问题, 不那么昂贵的治疗方案, 一种方法来识别患者可能获得更大的利益, 或两者, 是需要的。

小分子方法可以针对细胞内 PCSK9, 提供一个改进的管理路线, 并降低成本, 使它们成为这个领域的 "圣杯"⁷。然而, PCSK9 已经被小分子所证明是难以用药的。作为蛋白酶, 靶向 PCSK9's 蛋白水解功能是一个很有吸引力的策略, 因为自我分解是 PCSK9 成熟⁸的速率限制步骤, 它对 LDL-R⁹的最大影响是必需的。然而, 到目前为止, 这项战略还没有成功, 可能是由于 PCSK9's 独特的生物化学: PCSK9 仅¹⁰, 执行单翻转反应, 自解裂后, PCSK9 prodomain 仍然绑定在活动站点作为自动抑制剂¹¹, 防止任何进一步的蛋白酶活动的读数。

本文提出了一种评价高通量时尚⁸PCSK9 蛋白水解功能的方法。通过现场定向诱变, 研究者可以利用这一方法来探讨在临床中发现的编码 snp 的影响, 以评估它们对蛋白质水解的影响, PCSK9 成熟的速率限制步骤。此外, 这种方法将有助于设计高通量的屏幕, 以确定 PCSK9 蛋白降解的调制器, 这将最终扰乱 PCSK9 的表现为 LDL R (和调制 PCSK9's 胆固醇效应).最后, 该协议可以适应其他具有本质上低活性的蛋白酶, 只要 i) 一个特定的基质蛋白酶对可以找到, 和 ii) 一个合适的细胞内锚可以建立的基质。

研究方案

1. 蛋白酶载体的定点诱变

1. 设计和订购自定义合成的寡核苷酸, 通过修改标准站点定向突变协议来安装感兴趣的变异¹²。标准淡化底漆 (没有额外的净化) 是完全可以接受的。
   注: 对底漆设计的一般方法涉及创建部分重叠的底漆, 如表 1所示, 使用的熔融温度 (T_m) 计算器特定的聚合酶的兴趣。
2. 如表 2所示, 在冰上设置聚合酶链反应 (PCRs) 进行现场定向突变。
3. 按表 3所示循环 PCRs。
4. 运行 2-5 µL 的每一个 PCR 在1% 琼脂糖凝胶和可视化的产品, 以确认成功的放大。
   注意: 一个成功的 PCR 将显示一个单一的, 突出的 DNA 波段在大约大小标记的模板 (~ 7.8 kB)。
5. 添加0.5 µL (每 25-µL 反应) 的 DpnI 和孵化样品37°c 1 小时。
6. 将反应的2µL 转化为具有化学 能力的大肠杆菌。
   注: 快速生长的大肠杆菌菌株将减少潜伏期, 但任何克隆菌株都是可以接受的。
7. 将转换盘到含有 50-100 µg/毫升羧苄青霉素的 Luria-Bertani (磅) 琼脂上。在37摄氏度一夜之间孵化盘子。
8. 选择 2-4 个殖民地生长在一个小规模的文化 (2-5 毫升的 LB 培养基与 50-100 µg/毫升羧苄青霉素)。孵化的文化在37°c 在 220 rpm, 直到它是混浊的。
9. 根据制造商的指示, 用质粒 dna 纯化 (即"miniprep") 试剂盒将质粒 dna 从细胞中分离出来。用 microvolume 分光光度法定量测定洗脱 DNA 的浓度。
10. 用一个桑格测序服务 (如核心或商业设施) 广泛地序列质粒 DNA。根据服务规范准备 DNA 样品。在前测序反应中成功使用的底漆如表 4所述。
    注: 由于整个质粒的 PCR 扩增, 建议每个突变体对整个 PCSK9 编码区域进行排序。

2. 高通量荧光素酶的蛋白质水解测定方法

1. 细胞电镀 (0 天)
   1. 使用低通道 HEK293T 细胞进行实验, 并在 Dulbecco 修饰的鹰培养基 (DMEM) 中培养10% 胎牛血清 (血清)。在组织培养罩中进行无菌条件下的所有细胞工作, 直到准备好化验荧光素酶活性。估计试验所需的水井和板材的数量, 预计 transfections 将在每一个条件下进行三个测试。
   2. 将 HEK293T 细胞从母瓶中分离出来, 以最小体积的0.05% 胰蛋白酶-乙二胺-四乙酸 (EDTA) 来覆盖细胞。用2卷 DMEM 补充10% 的血清, 并将细胞转移到无菌管中, 使胰蛋白酶-EDTA 失效。使用自动单元格计数器计数单元格 (并用台盼蓝染色)。离心管在 500 x g 5 分钟恢复细胞。
   3. 吸入含有胰蛋白酶的培养基, 并将培养基中的细胞重组为 2 x 10⁵细胞/毫升的浓度。使用多通道吸管, 将100µL 的细胞转移到白色 (不透明的底部) 96 井板的每个井中, 从而使最终的播种浓度为 2 x 10⁴细胞/井。
      注: 对于最初的实验, 可能还会有帮助, 另外种子一个姐妹, 清底96井板, 以监测细胞生长和遵守在协议期间, 并指导未来的诊断。
   4. 孵育细胞在37°c 和 5% CO₂为 24 h。
   5. 用96井格式准备一盘质粒的主板。将洗脱缓冲液中的每种质粒 (三 HCl、pH 值 8.5) 稀释成96井板的单个井中的50µL。
      1. 为正控制质粒⁸、阴性对照 (S386A) 质粒⁸、无质粒缓冲 (模拟 transfections) 准备4口井。如果计划采用药物或其他细胞治疗方法, 则在每口井中用正控制质粒 (S386A) 和4口井分别制备主板, 每种均为阴性对照 () 质粒和无质粒缓冲液。
2. 转染 (1 天)
   1. 用深井96井板, 用96井板格式制备转染混合物。执行 transfections, 确保准备足够的试剂, 以解释吹打和转移损失。
      注: 以下计算准备足够的试剂来运行一个96井板 (420 井保守估计)。
      1. 将稀释后的脂质转染试剂混合, 将50.4 µL 试剂添加到2050µL 的降血清培养基中。制作一个 DNA precomplexation 试剂的总组合, 将33.6 µL 试剂添加到减少血清培养基的1730µL 中。
      2. 使用多通道吸管, 整除16.8 µL 稀释的 DNA precomplexation 试剂混合物进入深井板块的每一井。
      3. 使用多通道吸管, 整除3.2 µL (160 ng) 的每种质粒从主板进入深井板块的每一井。
      4. 使用多通道吸管, 整除20µL 稀释脂转染试剂混合物的每一个良好的板块, 并混合的内容, 每个井使用多通道吸管。盖上盘子, 让他们坐在室温下 (RT) 10-15 分钟形成脂质: DNA 复合物。
         注: 在转染后, 每井的最终成分将如下:40 的 dna, 0.12 µL 的转染试剂, 0.08 µL 的 dna 预络试剂, 每个井的含量将是10µL 在总容积 (减少血清培养基)。
   2. 用多通道吸管轻轻地在96井板上的293T 细胞上交换培养基, 注意不要扰乱细胞。更换吸气介质与95µL DMEM 补充10% 的血清。
      注意: 这将是一个适当的时间来治疗细胞与任何药物的利益。
   3. 通过多通道吸管将转染混合物的10µL 添加到每个适当的井中。轻轻地旋转盘子, 混合在井中的内容。孵育板材在37°c 与 5% CO₂为 24 h。
      注: 油井的最终容积为105µL, 占24小时的蒸发量。
3. 化验 (2 天)
   1. 准备腔肠素试剂的库存溶液: 3 M 抗坏血酸钠 [溶于磷酸盐缓冲盐水 (PBS), 制备新鲜], 5 米氯化钠, 10 毫克/毫升牛血清白蛋白 (BSA; 在 PBS 中溶解, 准备新鲜) 和2毫米腔肠素 (溶于酸化甲醇, 含200µL 3 氮盐酸每10毫升)。
      注: 2 毫米腔肠素可以储存2周, 当它保持在-80 摄氏度和没有光。
   2. 根据表 5, 为荧光素酶的读数准备2x 腔肠素试剂, 每个细胞和培养基都有一个单独的试剂。混合所有试剂保存腔肠素首先, 过滤混合物通过一个0.22 µm 注射器过滤器, 然后添加腔肠素。保护试剂不受光, 直到它们准备好添加到盘子里。
      注: 由于过滤器失去了溶液, 所以要做足够的试剂来说明过滤器的损耗以及转移的损失。表 5显示了2x 试剂的最终浓度 (以及添加到一个试剂的 96-井板中的库存溶液的数量)。
   3. 在转染后从孵化箱中取出细胞24小时。使用多通道吸管, 把50µL 的条件介质从每个井转移到一个新鲜的, 白色底 (不透明) 的96井板。
      1. 将车牌标记为它们是否包含介质或单元格。如果有超过一个96井板被转染, 标签的板块, 以确保每一个中载板与其母板的细胞。
   4. 使用多通道吸管, 添加50µL 2x 非裂解腔肠素试剂的板只含有条件的培养基。在 5-10 分钟的 RT 中, 轻轻摇动或摇动盘子。
   5. 使用多通道吸管, 添加50µL 的2x 裂解腔肠素试剂的板块包含细胞。在 5-10 分钟的 RT 中, 轻轻摇动或摇动盘子。
   6. 孵化后, 读出平板阅读器中只中板的发光。然后, 阅读同一版阅读器中的含细胞板的发光。
   7. 丢弃车牌并保存文件进行数据分析。

3. 数据分析

1. 使用电子表格软件执行初始数据分析。创建包含单元格和中板结果的电子表格。
2. 手动检查单元格中的数据以识别转染不良的油井。显示 < 5%-10% 的读数的负控制 (S386A) 质粒应该被认为是不良的转染, 使这些数据的解释可疑的水井。
3. 计算模拟转染井各板块的平均背景发光。从该板块的值中减去每个板块的背景。
   注意: 这个值可能是微不足道的, 这取决于使用的板阅读器。
4. 通过计算荧光素酶活性在培养基中的比例, 与各井的总荧光素酶活性相比, 对数据进行处理。由于单元格板包含除细胞外的条件介质, 而中只板含有与细胞板相同数量的条件介质, 因此使用以下方程式是适当的:
   
   在这里, RLU = 相对发光单位, 背景减去读数从板读取器。
5. 计算阳性对照 (S386A) 和负控 (i.) 井的平均分泌荧光素酶。
6. 通过计算 Z 因子¹³来评估实验的整体质量:
   
   注意: 活动值来自正控制 (小波), 非活动值来自负控制 (S386A) 井。接近1的值表明实验质量较高。如果值低于 0, 请考虑重复该实验或优化工作流。
7. 将数据从电子表格程序传输到科学数据分析软件中。
8. 将分泌的荧光素酶活性规范化为阳性对照值和阴性对照 (S386A), 将阳性对照设置为 1, 负控制为0。
9. 使用回归和离群删除 (溃败) 方法清除异常值的数据, 将最大错误发现率设置为1%。
10. 通过将每个突变条件 (或突变体) 的数据与 "重量" 活动的平均值进行比较 (规范化为 1) 来评估统计学意义上的差异。使用 Sidak 法和α = 0.05 进行多个配对t检验, 修正多种比较。

结果

高通量的蛋白质分解测定方法依赖于克服三大挑战。首先, 为了克服单周转 PCSK9 蛋白酶固有的低产量, PCSK9 蛋白酶缺乏抑制 prodomain, 与分裂序列的 prodomain 链接到一个荧光素酶, 可以分泌¹⁴。第二, 为了满足蛋白酶在复合体中的折叠与抑制 prodomain 的需要, 这两种多肽在细胞 coexpressed^15,16,通过一个 bicistronic ?...

讨论

上述实验程序提出了一种克服单周转蛋白酶 PCSK9 内在低活性的方法, 并以稳健的方式评价其蛋白水解功能。该检测的关键概念依赖于将单个周转事件转换为酶放大读数。该检测的优点包括相对较短的时间框架和易用性荧光素酶的记者, 以及它的可伸缩性高吞吐量的方法。此外, 该化验结果评估蛋白质水解在其本机, 细胞的上下文。此外, 通过这种检测, 临床鉴定的 snp 可以评估其对 PCSK9 蛋白水解的影...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Tubes	USA Scientific	1402-2900	For PCR
Q5 Hot Start	New England Biolabs	M0493L	High-fidelity DNA Polymerase
Deoxynucleotide Solution Mix	New England Biolabs	N0447L	dNTPs (for PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT	Authors	n/a	Available from authors
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A	Authors	n/a	Available from authors
Agarose LE	Gold Biotechnology	A-201-100	For DNA gels
E-Gel Imager System with Blue Light Base	ThermoFisher Scientific	4466612	For imaging DNA gels
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102	For DNA gels
Tris Base	ThermoFisher Scientific	BP152-1	For DNA gel running buffer
Glacial acetic acid	ThermoFisher Scientific	A38-500	For DNA gel running buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	Millipore Sigma	3690	EDTA, for DNA gel running buffer
1 kb DNA ladder	Gold Biotechnology	D010	DNA ladder
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Restriction enzyme
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin	Teknova	L1010	LB-Carb plates
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C862003	Chemically competent cells
LB Broth, Miller	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	LB
Carbenicillin	Gold Biotechnology	C-103-5	Selective antibiotic
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I	Omega BioTek	D6942-02	DNA Purification Miniprep kit
NanoDrop 2000 Spectrophotomer	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	Spectrophotometer
293T Cells	American Tissue Culture Collection (ATCC)	CRL-3216	HEK 293T cells
DMEM, high glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11995065	DMEM, mammalian cell media
Fetal Bovine Sera	Axenia Biologix	F001	FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300062	Trypsin, for cell dissociation
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	PBS
Countess automated cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227	Automated cell counting
Countess cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10228	Slides for cell counting
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid	Grenier Bio-One	655083	White, white-bottom 96 well plate
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural	USA Scientific	1402-9596	96 well plate for master plasmid plate
Nunc 2.0mL DeepWell Plates	ThermoFisher Scientific	278743	96 well deep well plate
Lipofectamine 3000	ThermoFisher Scientific	L3000008	Lipid transfection reagent, Lf3K
P3000 Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000008	DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K
OptiMEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062	Reduced serum medium for transfection
(+)-Sodium L-ascorbate	Millipore Sigma	A4034	Sodium ascorbate
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	NaCl
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals	Millipore Sigma	12659	BSA
Methanol (HPLC)	ThermoFisher Scientific	A4524	MeOH
Hydrochloric acid	VWR	JT9535-2	Concentrated HCl
Coelenterazine	Gold Biotechnology	CZ2.5	Luciferase substrate
Syringe Filter, Sterile	ThermoFisher Scientific	09-720-3	Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+	Rainin	17013810	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	Rainin	17013808	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+	Rainin	17013807	Multichannel pipette
Reagent reservoir	Corning	4870	Trough for reagents
Centrifuge tubes, 15 mL	ThermoFisher Scientific	05-539-12	15 mL tubes
Centrifuge tubes, 50 mL	Corning	430829	50 mL tubes
Spark Microplate Reader	Tecan	N/a	Plate Reader
Excel	Microsoft	2016 for Mac	Spreadsheet software
Prism	GraphPad Software	v7	Scientific data analysis software