Un ensayo de luciferasa de alto rendimiento para evaluar la proteólisis de la facturación única proteasa PCSK9

Resumen

Este protocolo presenta un método para evaluar la actividad proteolítica de una proteasa de rotación intrínseca baja actividad, solo en un contexto celular. Específicamente, este método se aplica para evaluar la actividad proteolítica de PCSK9, un factor clave del metabolismo de los lípidos cuya actividad proteolítica se requiere para su última función hipercolesterolémicos.

Resumen

Cualquiera convertasa subtilisin/kexin tipo 9 (PCSK9) es una proteasa de facturación solo que regula los niveles de lipoproteína de baja densidad (LDL) y, en consecuencia, las enfermedades cardiovasculares. Aunque PCSK9 proteólisis se requiere para su efecto completo hipercolesterolémicos, la evaluación de su función proteolítica es un reto: PCSK9 sólo es conocido por sí mismo allegarse se somete sólo un volumen único y después de la proteólisis, conserva su sustrato en su sitio activo como inhibidor de auto. Los métodos presentados aquí describen un ensayo que supera estos desafíos. El análisis se centra en la proteólisis intermolecular en un contexto basado en la célula y escote acertado enlaces a la actividad de luciferasa secretada, que puede ser fácilmente leída hacia fuera en el medio condicionado. Mediante pasos secuenciales de mutagénesis, transitorios de la transfección y una lectura de luciferasa, el ensayo puede probar PCSK9 proteólisis en condiciones de perturbación ya sea genética o molecular de un modo de alto rendimiento. Este sistema es idóneo para ambos la evaluación bioquímica de clínicamente descubierto sin sentido solo polimorfismos de nucleótido simple (SNPs), así en cuanto a la proyección de los inhibidores de molécula pequeña de proteólisis PCSK9.

Introducción

PCSK9 apunta el receptor de LDL (LDL-R) para la degradación, elevar el colesterol LDL (LDL-C) y conducir a enfermedad aterosclerótica del corazón^1,2. Terapéutica dirigida a PCSK9 robusta reducir C-LDL y mejorar los resultados cardiovasculares de los pacientes, incluso cuando se añade a una agresiva terapia hipolipemiante con estatinas^3,4. Sin embargo, las terapias actualmente aprobadas se limitan a enfoques basados en anticuerpos y sufren de falta de rentabilidad de^5,6. Para resolver este problema, se necesitan alternativas terapéuticas menos costosos, a fin de identificar a los pacientes capaces de obtener mayores beneficios, o ambos.

Enfoques de molécula pequeña podrían objetivo intracelular PCSK9, proporcionan una mejor vía de administración y reducir los costos, haciendo que el "Santo Grial" en esta zona⁷. Sin embargo, PCSK9 ha probado difícil de droga por pequeñas moléculas. Como una proteasa, dirigida a la función proteolítica de PCSK9 es una estrategia atractiva, como uno mismo-proteólisis es el paso tarifa-limitador de PCSK9 maduración⁸ y se requiere para su máximo efecto sobre el LDL-R⁹. Hasta la fecha, sin embargo, esta estrategia no ha tenido éxito, probablemente debido a la bioquímica única de PCSK9: PCSK9 solamente sí mismo segmenta¹⁰, realizando una reacción single-facturación y después uno mismo-escote, la PCSK9 prodomain sigue siendo límite en el sitio activo como una auto-inhibidor¹¹, impidiendo la lectura de cualquier otra actividad de proteasa.

Este artículo presenta un método para evaluar la función proteolítica PCSK9 en moda alto rendimiento⁸. Mediante mutagénesis sitio-dirigida, los investigadores pueden utilizar este análisis para los efectos de la codificación de SNPs encontradas la clínica para evaluar efectos sobre la proteólisis, el paso de limitación de velocidad de maduración PCSK9. Además, este método será útil en el diseño de pantallas de alto rendimiento para identificar moduladores de proteólisis PCSK9, que se prevén que, en definitiva, alterar la presentación de PCSK9 en el LDL-R (y modulan efectos hipercolesterolémicos de PCSK9) . Por último, este protocolo puede ser adaptado a otras proteasas con actividad intrínsecamente baja, siempre que i) un par de sustrato-proteasa específica puede encontrarse, y ii) un anclaje intracelular adecuado puede establecerse para el substrato.

Protocolo

1. dirigida mutagénesis del Vector de la proteasa

1. Diseño y orden de oligonucleótidos sintetizados de costumbre instalar una mutación de interés utilizando una modificación de protocolos de mutagénesis sitio-dirigida estándar¹². Cartillas desaladas estándar (sin purificación adicional) son perfectamente aceptables.
   Nota: Un enfoque general a los diseños del primer implica crear cartillas parcialmente superpuestos como se indica en la tabla 1, usando una calculadora de temperatura (T_m) fusión específica a la polimerasa de interés.
2. Establecer reacciones en cadena de polimerasa (PCR) para la mutagénesis sitio-dirigida en el hielo, como se indica en la tabla 2.
3. Ciclo de la PCR como se indica en la tabla 3.
4. 2-5 μl de cada PCR en un gel de agarosa al 1% y visualizar los productos para confirmar una amplificación exitosa.
   Nota: Una polimerización en cadena acertada mostrará una banda de DNA única y prominente en el marcador del tamaño aproximado de la plantilla (~7.8 kB).
5. Añadir 0,5 μl (por reacción de 25 μl) de DpnI e incubar las muestras a 37 ° C durante 1 h.
6. Transformar 2 μl de la reacción en químicamente competentes de Escherichia coli.
   Nota: Una cepa de e. coli rápido crecimiento reducirá tiempos de incubación, pero cualquier cepa clonación será aceptable.
7. Las transformaciones en agar Luria-Bertani (LB) con carbenicilina de 50-100 μg/mL de la placa. Incubar las placas durante la noche a 37 ° C.
8. Seleccione colonias de 2-4 para crecer en un cultivo en pequeña escala (2-5 mL de medio LB con carbenicilina de 50-100 μg/mL). Incubar el cultivo a 37 ° C a 220 rpm hasta que es turbia.
9. Aislar el plásmido de DNA de las células utilizando un kit de purificación (es decir, "miniprep") de DNA de plásmido según las instrucciones del fabricante. Cuantificar la concentración de ADN eluída usando un espectrofotómetro microvolume.
10. La secuencia del plásmido ADN utilizando extensivamente un servicio de secuenciación de Sanger (como un núcleo o centro comercial). Preparar las muestras de ADN según las especificaciones del servicio. Cebadores utilizados con éxito en reacciones de secuenciación previa se observan en la tabla 4.
    Nota: Debido a la amplificación por PCR del plásmido toda, la secuenciación de la región entera de la codificación PCSK9 se recomienda para cada mutante.

2. alto rendimiento base de Luciferase proteólisis ensayo

1. Galjanoplastia de la célula (día 0)
   1. Utilizar células HEK293T de paso bajo para experimentos y una cultura de Dulbecco modificado medio de Eagle (DMEM) con 10% suero bovino fetal (FBS). Realizar todo la célula de trabajo en condiciones estériles en una campana de cultivo de tejidos hasta el momento de analizar la actividad de luciferasa. Estimar el número de pozos y las placas necesarias para el experimento, anticipando que transfecciones se realizará por triplicado para cada condición de prueba.
   2. Disociar las células HEK293T un frasco de padres tratándolos con un volumen mínimo de 0.05% tripsina-dihidratada del ácido (EDTA) para cubrir las células. Inactivación del tripsina-EDTA con 2 volúmenes de DMEM suplementado con 10% FBS y la transferencia de las células a un tubo estéril. Contar las células usando un contador de células automatizado (y la coloración con trypan azul). Centrifugar el tubo a 500 x g durante 5 minutos recuperar las células.
   3. Aspire el medio que contiene tripsina y reconstituir las células del medio de cultivo a una concentración de 2 x 10⁵ células/mL. Usando una pipeta multicanal, transferir 100 μl de las células a cada pozo de una placa de 96 pocillos de blanco (opaco-abajo), que da una concentración final de siembra de 2 x 10⁴ células/pozo.
      Nota: Para los experimentos iniciales, puede ser útil además de semilla de una hermana, placa de 96 pocillos de fondo claro, con el fin de controlar el crecimiento celular y la adhesión durante el protocolo y la guía solución de problemas futuros.
   4. Incube las células a 37 ° C y 5% de CO₂ durante 24 h.
   5. Preparar un plato principal de plásmidos en un formato de 96 pozos. Diluir cada plásmido en tampón de elución (Tris-HCl, pH 8,5) a 50 ng/μL en un pozo individual de una placa de 96 pocillos.
      1. Preparar 4 pozos para el control positivo (WT) plásmido⁸de plásmido de control negativo (S386A)⁸y buffer libre de plásmido (para simulacros transfecciones). Si drogas u otros tratamientos a base de celular están siendo planeadas, preparan la placa principal con el plásmido de control positivo (WT) en cada pocillo, junto con 4 pozos de cada uno de los plásmidos de control negativo (S386A) y el tampón libre de plásmido.
2. Transfección (día 1)
   1. Preparar la mezcla de transfección en un formato de placa de 96 pozos utilizando placas de deep-well de 96 pocillos. Realizar las transfecciones en triplicado, asegurándose de preparar los suficientes reactivos para tener en cuenta pérdidas de pipeteo y transferencia.
      Nota: Los cálculos siguientes preparan suficiente reactivo para correr una placa de 96 pocillos en triplicado (Estimado conservador para 420 pozos).
      1. Hacer una mezcla maestra de un reactivo de transfección de lípidos diluido, agregar 50,4 μL del reactivo a 2050 μl de suero reducido medio. Hacer una mezcla maestra de un reactivo de precomplexation de ADN, añadiendo 33,6 μl del reactivo en 1730 μl de suero reducido medio.
      2. Utilizando una pipeta multicanal, alícuota 16,8 μl de la mezcla de reactivo de precomplexation de ADN diluida en cada pocillo de la placa de la pozo profundo.
      3. Utilizando una pipeta multicanal, alícuota 3,2 μl (160 ng) de cada plásmido de la placa principal en cada pocillo de la placa de la pozo profundo.
      4. Usando una pipeta multicanal, alícuotas de 20 μl de la mezcla de reactivo de transfección lípidos diluido a cada bien de la placa y mezclar el contenido de cada pocillo utilizando la pipeta multicanal. Cubrir las placas y los deje reposar a temperatura ambiente (RT) por 10-15 min a formar complejos de lípidos: ADN.
         Nota: En la transfección, los componentes finales por pocillo será como sigue: 40 ng de ADN, 0.12 μl de reactivo de transfección y 0.08 μl del ADN pre-complejación reactivo y el contenido de cada bien será 10 μl volumen total (suero reducido medio).
   2. Suavemente cambiar el medio en las células 293T en placas de 96 pozos utilizando una pipeta multicanal, teniendo cuidado de no para romper las células. Reemplazar el medio aspirado con 95 μl de DMEM suplementado con 10% FBS.
      Nota: Este sería un momento adecuado para tratar las células con cualquier fármaco de interés.
   3. Añadir 10 μl de la mezcla de transfección a cada correspondiente bien mediante una pipeta multicanal. Agitar suavemente la placa para mezclar el contenido en los pozos. Incubar la placa a 37 ° C con 5% CO₂ durante 24 h.
      Nota: El volumen final de los pozos llega a 105 μl, para tener en cuenta para la evaporación más de 24 h.
3. Ensayo (día 2)
   1. Preparar una solución stock de reactivos coelenterazine: ascorbato de sodio de 3 M [disuelto en tampón fosfato salino (PBS), preparado fresco] 5 M NaCl, 10 mg/mL de seroalbúmina bovina (BSA, disuelta en PBS, preparado fresco) y coelenterazine de 2 mM (disuelto en metanol acidificado con 200 μL de 3 HCl N / 10 mL).
      Nota: El coelenterazine de 2 mM se puede almacenar por 2 semanas cuando se guarda a-80 ° C y en ausencia de luz.
   2. Preparar los reactivos de x coelenterazine 2 para la lectura de la luciferasa, con un reactivo independiente de cada de las células y el medio, según la tabla 5. Primero se mezclan todos los reactivos excepto la coelenterazine, filtrar la mezcla a través de un filtro de jeringa 0,22 μm y agregue el coelenterazine. Proteger los reactivos de la luz hasta que están listos para añadirse a las placas.
      Nota: Debido a la pérdida de la solución de filtración, hacer suficiente reactivo para tener en cuenta tanto la pérdida de filtración, así como de las transferencias. Tabla 5 muestra la concentración final de los reactivos 2 x (así como la cantidad de solución madre a añadir para leer una placa de 96 pocillos con un reactivo).
   3. Eliminar las células de la incubadora 24 horas después de la transfección. Usando una pipeta multicanal, transfiera 50 μl de medio condicionado de cada pozo a una placa de 96 pocillos (opaca) fresca, con fondo blanco.
      1. Etiqueta de las placas en cuanto a si contienen células o medio. Si más de una placa de 96 pocillos se transfected, etiquete las placas para garantizar que cada placa de medio que contiene se empareja con su placa de la matriz de las células.
   4. Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl de 2 x coelenterazine no lítico reactivo a la placa que contiene sólo medio condicionado. Suavemente balancee o agitar la placa en la ausencia de luz durante 5-10 min a TA.
   5. Usando una pipeta multicanal, añada 50 μl del reactivo de coelenterazine lítica de 2 x a la placa que contiene las células. Suavemente balancee o agitar la placa en la ausencia de luz durante 5-10 min a TA.
   6. Después de la incubación, lectura a la luminiscencia de la placa sólo por medio de un lector de placas. Luego, lee la luminiscencia de la placa que contiene la celda en el mismo lector de placas.
   7. Deseche las placas y guardar los archivos de análisis de datos.

3. Análisis de los datos

1. Realizar un análisis de los datos iniciales utilizando el software de hoja de cálculo. Crear una hoja de cálculo que contiene los resultados de la célula y las placas de medio.
2. Inspeccione manualmente los datos de las placas de la célula para identificar pozos mal transfected. Pozos que muestran < 5% - 10% de la lectura del plásmido de control negativo (S386A) se debe considerar como mal transfected, haciendo la interpretación de los datos sospechosos.
3. Calcular la luminiscencia del fondo promedio de cada plato de los pozos transfected mock. Restar el fondo de cada plato de los valores de esa placa.
   Nota: Este valor puede ser despreciable dependiendo del lector de placa utilizado.
4. Proceso de los datos mediante el cálculo de la proporción de actividad de luciferasa en el medio en comparación con el conjunto de la actividad luciferasa para cada pozo. Porque la placa de la célula contiene ambos medio condicionado además de las células, y la placa sólo medio contiene la misma cantidad de medio condicionado como la placa de la célula, es conveniente utilizar la siguiente ecuación:
   
   Aquí, RLU = unidades de luminiscencia relativa, la lectura resta de fondo desde el lector de la placa.
5. Calcular la media luciferase secretado del control positivo (WT) y los pocillos de control negativo (S386A).
6. Evaluar la calidad general del experimento mediante el cálculo de un factor Z de¹³:
   
   Nota: Los valores activos provienen del control positivo (WT) y los valores inactivos vienen de los pozos de control negativo (S386A). Valores más cercanos a 1 indican una mayor calidad de experimental. Considere repetir el experimento u optimizar el flujo de trabajo si el valor es inferior a 0.
7. Transferir los datos desde el programa de hoja de cálculo en software de análisis de datos científicos.
8. Normalizar la actividad de luciferasa secretada a los valores promedio de control positivo (WT) y el control negativo (S386A), ajuste el control positivo como 1 y el control negativo como 0.
9. Limpiar los datos de outliers mediante el método de eliminación (derrota) de regresión y aislados, establecer la tasa máxima falso descubrimiento al 1%.
10. Evaluar las diferencias estadísticamente significativas comparando los datos para cada condición mutante (o mutante) a la media de la actividad de la WT (normalizada a un valor de 1). Realizar múltiples desapareado t-tests, corrección de comparaciones múltiples con el método de Holm-Sidak y α = 0.05.

Resultados

El ensayo de proteólisis de alto rendimiento se basa en superar tres grandes retos. En primer lugar, para superar la salida intrínsecamente baja de una proteasa PCSK9 de solo volumen, una proteasa PCSK9 carecer la inhibitoria prodomain se utiliza, con la secuencia de escote en la cola de la prodomain vinculada a una luciferasa que puede ser secretada¹⁴. En segundo lugar, para satisfacer la necesidad de que la proteasa doblar en complejo con su inhibitoria prodoma...

Discusión

Los procedimientos experimentales descritos presentan un método para superar la actividad intrínsecamente baja de la facturación única proteasa PCSK9 y evaluar su función proteolítica de forma robusta. El concepto clave del análisis se basa en convertir un evento de facturación solo en una lectura enzimático amplificado. Las fortalezas del análisis incluyen el relativamente poco tiempo y facilidad de uso del reportero de luciferasa, así como su escalabilidad a los enfoques de alto rendimiento. Además, el ensa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Tubes	USA Scientific	1402-2900	For PCR
Q5 Hot Start	New England Biolabs	M0493L	High-fidelity DNA Polymerase
Deoxynucleotide Solution Mix	New England Biolabs	N0447L	dNTPs (for PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT	Authors	n/a	Available from authors
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A	Authors	n/a	Available from authors
Agarose LE	Gold Biotechnology	A-201-100	For DNA gels
E-Gel Imager System with Blue Light Base	ThermoFisher Scientific	4466612	For imaging DNA gels
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102	For DNA gels
Tris Base	ThermoFisher Scientific	BP152-1	For DNA gel running buffer
Glacial acetic acid	ThermoFisher Scientific	A38-500	For DNA gel running buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	Millipore Sigma	3690	EDTA, for DNA gel running buffer
1 kb DNA ladder	Gold Biotechnology	D010	DNA ladder
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Restriction enzyme
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin	Teknova	L1010	LB-Carb plates
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C862003	Chemically competent cells
LB Broth, Miller	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	LB
Carbenicillin	Gold Biotechnology	C-103-5	Selective antibiotic
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I	Omega BioTek	D6942-02	DNA Purification Miniprep kit
NanoDrop 2000 Spectrophotomer	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	Spectrophotometer
293T Cells	American Tissue Culture Collection (ATCC)	CRL-3216	HEK 293T cells
DMEM, high glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11995065	DMEM, mammalian cell media
Fetal Bovine Sera	Axenia Biologix	F001	FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300062	Trypsin, for cell dissociation
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	PBS
Countess automated cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227	Automated cell counting
Countess cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10228	Slides for cell counting
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid	Grenier Bio-One	655083	White, white-bottom 96 well plate
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural	USA Scientific	1402-9596	96 well plate for master plasmid plate
Nunc 2.0mL DeepWell Plates	ThermoFisher Scientific	278743	96 well deep well plate
Lipofectamine 3000	ThermoFisher Scientific	L3000008	Lipid transfection reagent, Lf3K
P3000 Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000008	DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K
OptiMEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062	Reduced serum medium for transfection
(+)-Sodium L-ascorbate	Millipore Sigma	A4034	Sodium ascorbate
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	NaCl
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals	Millipore Sigma	12659	BSA
Methanol (HPLC)	ThermoFisher Scientific	A4524	MeOH
Hydrochloric acid	VWR	JT9535-2	Concentrated HCl
Coelenterazine	Gold Biotechnology	CZ2.5	Luciferase substrate
Syringe Filter, Sterile	ThermoFisher Scientific	09-720-3	Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+	Rainin	17013810	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	Rainin	17013808	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+	Rainin	17013807	Multichannel pipette
Reagent reservoir	Corning	4870	Trough for reagents
Centrifuge tubes, 15 mL	ThermoFisher Scientific	05-539-12	15 mL tubes
Centrifuge tubes, 50 mL	Corning	430829	50 mL tubes
Spark Microplate Reader	Tecan	N/a	Plate Reader
Excel	Microsoft	2016 for Mac	Spreadsheet software
Prism	GraphPad Software	v7	Scientific data analysis software