Assay לוציפראז תפוקה גבוהה כדי להעריך את Proteolysis של PCSK9 יחיד-מחזור פרוטאז

Summary

פרוטוקול זה מציג שיטה להעריך את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז תחלופה נמוכה-פעילות מהותית, יחיד בהקשר הסלולר. באופן ספציפי, שיטה זו מוחלת כדי להעריך את הפעילות הפרוטאוליטי של PCSK9, נהג מפתח של מטבולי הפעילות הפרוטאוליטי נדרש עבור תפקידה hypercholesterolemic האולטימטיבי.

Abstract

סוג סבטיליזין/kexin proprotein convertase 9 (PCSK9) הוא פרוטאז יחיד-מחזור אשר מווסת את רמות ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) בסרום, וכתוצאה מכך מחלות לב וכלי דם. למרות PCSK9 proteolysis נדרשת עבור השפעתו hypercholesterolemic מלאה, הערכת פונקציית הפרוטאוליטי שלה הוא מאתגר: PCSK9 ידועה רק קליב עצמו עובר רק מחזור אחד, לאחר proteolysis, משמרת את המצע שלה ב אתר פעיל שלה כמו מעכב באופן אוטומטי. השיטות המובאות כאן לתאר וזמינותו אשר מתגבר על האתגרים הללו. הבדיקה מתמקדת proteolysis הבין-מולקולרי ההקשר מבוססת תא, המחשוף מוצלחות קישורים לפעילות לוציפראז המופרש, אשר ניתן בקלות לקרוא המדיום ממוזגים. דרך שלבים רציפים של מוטגנזה מכוונת, תרביות תאים ארעית של הבדיקה לוציפראז, וזמינותו יכול לחקור PCSK9 proteolysis בתנאים של ההפרעות גנטיות או מולקולרית באופן תפוקה גבוהה. מערכת זו היא מתאימה עבור הערכת בשני הביוכימי missense קלינית שהתגלו נוקלאוטיד יחיד פולימורפיזמים (SNPs), כמו גם באשר ההקרנה של מעכבי מולקולה קטנה של PCSK9 proteolysis.

Introduction

PCSK9 מטרות קולטן LDL (LDL-R) עבור השפלה, העלאת הכולסטרול LDL (LDL-C) ונהיגה טרשת עורקים מחלות לב^1,2. PCSK9 מיקוד הרפוי robustly להוריד את LDL-C, לשפר את התוצאות לב וכלי דם לחולים, אפילו בעת הוספת טיפול אגרסיבי להורדת שומנים בדם עם סטטינים^3,4. אולם, כיום שאושרו טיפולים מוגבלות לנוגדן מבוססי גישות, סובלים מחוסר משתלמת^5,6. כדי לפתור בעיה זו, פחות יקר חלופות טיפוליות, אמצעי לזיהוי חולים עשויה להרוויח יתרונות גדולים יותר, או שניהם, נדרשים.

גישות מולקולה קטנה יכולה מטרה תאיים PCSK9, מספקים נתיב משופרת של הממשל, לצמצם עלויות, שהופך אותם "הגביע הקדוש" זה באיזור⁷. עם זאת, PCSK9 הוכיח שקשה סמים על ידי מולקולות קטנות. כמו פרוטאז, מיקוד פונקציית הפרוטאוליטי של PCSK9 היא אסטרטגיית אטרקטיבי, כפי העצמי-proteolysis היא הצעד הגבלת קצב ההבשלה PCSK9⁸ והוא נדרש לקבלת אפקט מקסימלי שלה ב- LDL-R⁹. עד כה, עם זאת, אסטרטגיה זו לא היה מוצלח, ככל הנראה בגלל הביוכימיה הייחודית של PCSK9: PCSK9 cleaves רק עצמו¹⁰, ביצוע תגובה אחת-מחזור, לאחר העצמי-המחשוף, PCSK9 prodomain כבולים בתוך האתר הפעיל כמו auto-מעכב¹¹, מונע את המדידה של כל פעילות נוספת פרוטאז.

מאמר זה מציג שיטה להעריך פונקציית הפרוטאוליטי PCSK9 אופנה תפוקה גבוהה⁸. דרך מוטגנזה, חוקרים יכולים להשתמש assay הזה כדי לחקור את ההשפעות של קידוד SNPs נמצאו במרפאה כדי להעריך אותם על ההשפעות על proteolysis, השלב הגבלת קצב ההבשלה PCSK9. בנוסף, שיטה זו תהיה שימושית בעיצוב של מסכי תפוקה גבוהה לזיהוי מאפננים של PCSK9 proteolysis, אשר נמצאים צפוי בסופו של דבר לשבש את המצגת של PCSK9 ה-LDL-r (ו לווסת את אפקט hypercholesterolemic של PCSK9) . לבסוף, פרוטוקול זה ניתן להתאים אחרים פרוטאזות עם פעילות מהותית נמוך, ובלבד i) זוג סובסטרט מסוים-פרוטאז ניתן למצוא, ii) עוגן תאיים מתאים יכול להתבסס על המצע.

Protocol

1. מוטגנזה של וקטור פרוטאז

1. עיצוב וסדר מסונתז מותאמת אישית oligonucleotides להתקין מוטציה של הריבית באמצעות שינוי של פרוטוקולים סטנדרטיים מוטגנזה¹². תחל desalted רגיל (ללא טיהור נוסף) מקובלים לחלוטין.
   הערה: הגישה הכללית של פריימר עיצובים כרוך ביצירת תחל חופפים חלקית, כמצוין בטבלה 1, באמצעות מחשבון טמפרטורה (T_m) ההיתוך ספיציפית פולימראז עניין.
2. להגדיר תגובות שרשרת של פולימראז (מותני) מוטגנזה בקרח, כמצוין בטבלה מס ' 2.
3. מחזור את מותני כמצוין בטבלה3.
4. לרוץ 2-5 µL של כל ה-PCR על 1% agarose ג'ל והמחש את המוצרים כדי לאשר הגברה מוצלחת.
   הערה: PCR מוצלח יציגו להקה דנ א אחד, בולט ב דה מרקר בגודל המשוער של התבנית (~7.8 kB).
5. להוסיף 0.5 µL (לכל תגובה 25-µL) של DpnI, דגירה בדגימות ב 37 ° C עבור 1 h.
6. להפוך µL 2 התגובה לתוך כשיר מבחינה כימית Escherichia coli.
   הערה: זן e. coli בצמיחה מהירה תפחית הדגירה פעמים, אך כל זן שיבוט שיהיה מקובל.
7. צלחת העתקות על גבי אגר לוריא-Bertani (LB) המכיל 50-100 carbenicillin µg/mL. דגירה הלוחות בן לילה ב 37 º C.
8. בחר 2-4 מושבות לגדול בתרבות בקנה מידה קטן (2-5 מ ל LB בינוני עם 50-100 carbenicillin µg/mL). דגירה התרבות ב 37 ° C-220 סל"ד עד שזה עכורים.
9. לבודד את פלסמיד ה-DNA של התאים באמצעות ערכת טיהור (קרי, "miniprep") דנ א פלסמיד בהתאם להוראות היצרן. לכמת את ריכוז הדנ א eluted באמצעות ספקטרופוטומטרים microvolume.
10. רצף של פלסמיד DNA בהרחבה באמצעות שירות רצף סנגר (כגון ליבה או מתקן מסחרי). להכין דגימות ה-DNA בהתאם למפרטים של השירות. תחל בעבר בהצלחה בתגובות קודמות רצף מצוינים בטבלה4.
    הערה: עקב הגברה PCR של פלסמיד כולו, הרצף של האזור כולו של קידוד PCSK9 מומלצת עבור כל מוטציה.

2. תפוקה גבוהה מבוססי לוציפראז Proteolysis Assay

1. תא ציפוי (יום 0)
   1. להשתמש בתאים HEK293T נמוך-המעבר לניסויים ולשנות התרבות של Dulbecco איגל בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS). לבצע כל תא עבודה בתנאים סטריליים בשכונה תרביות רקמה עד מוכן assay הפעילות לוציפראז. להעריך את מספר בארות ו לוחות הדרושים עבור הניסוי, צופה כי transfections יבוצעו דולר עבור כל תנאי נבדק.
   2. מביצועם HEK293T תאים מבקבוק האב אם תתייחס אליהם עם נפח מינימלי של 0.05% טריפסין-ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) כדי לכסות את התאים. בטל את טריפסין-EDTA עם 2 כרכים של DMEM בתוספת 10% FBS והעברת התאים צינור סטרילי. לספור את התאים באמצעות מונה הניתן תא אוטומטיות (ולא מכתים עם trypan blue). Centrifuge את הצינור ב x 500 g עבור 5 דקות כדי לשחזר את התאים.
   3. האחות בינוני המכילים טריפסין, לשקם את התאים בטווח הבינוני תרבות כדי ריכוז של 2 x 10⁵ תאים למ"ל. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, העברת 100 µL של התאים כל טוב של צלחת 96-ובכן לבן (אטום-למטה), אשר נותן ריכוז זריעה הסופי של 2 x 10⁴ תאים/טוב.
      הערה: לניסויים הראשונית, זה עשוי להיות שימושי כדי בנוסף זרע של אחות, צלחת 96-ובכן ברור-התחתון, כדי לעקוב אחר גדילת התאים תוך היצמדות במהלך פרוטוקול ו מדריך פתרון עתידי.
   4. דגירה התאים-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ במשך 24 שעות ביממה.
   5. להכין צלחת הבסיס של פלסמידים בתבנית 96-ובכן. לדלל כל פלסמיד במאגר • תנאי (טריס-HCl, pH 8.5) כדי 50 ng/µL היטב בודדים של צלחת 96-ובכן.
      1. להכין 4 בארות פלסמיד בקרה חיובית (WT)⁸, שליטה שלילי (S386A) פלסמיד⁸ו נטול פלסמיד מאגר (עבור transfections מעושה). אם תרופות או טיפולים אחרים מבוססי סלולר להיות מתוכננים, אז להכין בסיס לצלחת עם פלסמיד בקרה חיובית (WT) כל היטב יחד עם 4 בארות כל אחד את פלסמיד שליטה שלילי (S386A), המאגר ללא פלסמיד.
2. תרביות תאים (יום 1)
   1. להכין לתערובת תרביות תאים בתבנית 96-ובכן צלחת באמצעות לוחות 96 עמוק-טוב-טוב. לבצע את transfections דולר, הקפד להכין מספיק ריאגנטים לקחת בחשבון הפסדים pipetting והעברה.
      הערה: החישובים הבאים להכין מספיק ריאגנט להפעלת לוח 96-ובכן אחד דולר (אומדן שמרני-וולס 420).
      1. להפוך את תערובת הבסיס של ריאגנט תרביות תאים השומנים מדולל, הוספת µL 50.4 של ריאגנט 2050 µL של מדיום מופחת-סרום. להפוך את תערובת הבסיס של ריאגנט precomplexation DNA, הוספת µL 33.6 של ריאגנט לתוך 1730 µL של מדיום מופחת-סרום.
      2. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot µL 16.8 של התערובת ריאגנט precomplexation DNA מדולל לבאר כל צלחת עמוקה-ובכן.
      3. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot 3.2 µL (160 ng) של כל פלסמיד מהצלחת הראשית לבאר כל צלחת עמוקה-. טוב.
      4. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, aliquot 20 µL תערובת ריאגנט תרביות תאים השומנים מדולל לכל אחד טוב של הצלחת ומערבבים את התוכן של כל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. לכסות את הלוחות ולתת להם לשבת בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10-15 דקות כדי מתחמי השומנים: DNA טופס.
         הערה: על תרביות תאים, הרכיבים הסופי לכל טוב יהיה כדלקמן: 40 ng של ה-DNA, 0.12 µL של תרביות תאים ריאגנט µL 0.08 של ריאגנט pre-complexation דנ א, ואת התוכן של כל אחד יהיה 10 µL סה כ נפח (מופחת-סרום בינוני).
   2. בעדינות חילופי המדיום על תאים 293T לוחית 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי, מקפיד לא לשבש את התאים. להחליף את המדיום aspirated 95 µL של DMEM בתוספת 10% FBS.
      הערה: זה יהיה זמן מתאים לטיפול תאי בתרופה בכל עניין.
   3. להוסיף 10 µL של תערובת תרביות תאים לכל המתאים היטב באמצעות פיפטה רב-ערוצי. מערבולת בעדינות את הצלחת לערבב את התוכן הנמצא הבארות. דגירה את הצלחת ב 37 ° C עם 5% CO₂ במשך 24 שעות ביממה.
      הערה: הנפח הסופי של הבארות מגיע 105 µL, להביא בחשבון התאדות מעל 24 שעות.
3. Assay (יום 2)
   1. להכין פתרון מניות ריאגנטים coelenterazine: 3 מ' סודיום אסקורבט [מומס באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), טרי] 5 מ' NaCl, 10 מ"ג/מ"ל שור אלבומין (BSA; מומס ב- PBS, טרי), coelenterazine 2 מ מ (מומס acidified מתנול המכיל 200 µL של HCl N 3 לכל 10 מ ל).
      הערה: ניתן לאחסן את coelenterazine 2 מ מ 2 שבועות כאשר נשמר ב-80 מעלות צלזיוס, בהיעדר אור.
   2. להכין 2 ריאגנטים x coelenterazine המדידה לוציפראז, עם נפרד ריאגנט כל התאים, בינוני, על פי טבלה 5. לערבב כל ריאגנטים להציל coelenterazine קודם, לסנן את התערובת דרך מסנן מזרק 0.22-מיקרומטר, ולאחר מכן להוסיף את coelenterazine. להגן על ריאגנטים אור עד שיהיו מוכנים להוסיף הצלחות.
      הערה: בשל האובדן של פתרון של סינון, לבצע מספיק ריאגנט לקחת בחשבון הן את ההפסד סינון, אך גם מן העברות. טבלה 5 מראה את הריכוז הסופי של ריאגנטים 2 x (כמו גם את כמות המניות פתרון כדי להוסיף לקרוא את לוח 96-ובכן אחד עם ריאגנט אחד).
   3. להסיר התאים החממה 24 שעות לאחר תרביות תאים. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להעביר µL 50 בינוני ממוזגים מכל קידוח טריים, עם תחתית לבן (אטום) 96-ובכן צלחת.
      1. תווית הלוחות לגבי אם הם מכילים בינוני או תאים. אם אחד או יותר צלחת 96-ובכן היה transfected, תווית את הצלחות על מנת להבטיח כי כל צלחת המכילות בינוני מזווג עם צלחת האב שלה של תאים.
   4. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של 2 x ריאגנט coelenterazine שאינם lytic לצלחת המכילה רק ממוזגים בינוני. בעדינות רוק או לנער את הצלחת בהיעדר אור למשך 5-10 דקות ב- RT.
   5. בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להוסיף 50 µL של ריאגנט lytic coelenterazine x 2 לצלחת המכילות את התאים. בעדינות רוק או לנער את הצלחת בהיעדר אור למשך 5-10 דקות ב- RT.
   6. לאחר הדגירה, הקריא את הארה של צלחת בינונית בלבד בקורא צלחת. . אז, לקרוא החוצה של הפריה חוץ גופית של צלחת המכילות תאים בקורא ה-צלחת אותו.
   7. למחוק את הצלחות ולשמור את הקבצים עבור ניתוח נתונים.

3. ניתוח נתונים

1. לבצע ניתוח נתונים ראשוניים באמצעות תוכנת הגיליון האלקטרוני. צור גיליון המכיל את התוצאות של התא עם הלוחיות בינוני.
2. באופן ידני לבדוק את הנתונים מכל הלוחות תא לזהות לקוי transfected בארות. וולס המציגים < 5% - 10% של המדידה של פלסמיד שליטה שלילי (S386A) צריכה להיחשב הכי גרוע transfected, שהופך את הפרשנות של החשוד נתונים אלה.
3. לחשב את לומינסנציה רקע הממוצע של כל צלחת מן הבארות transfected מעושה. להחסיר את הרקע של כל צלחת לפי הערכים של הלוחית הזאת.
   הערה: ערך זה עשוי להיות זניח בהתאם לקורא לצלחת משמש.
4. הנתונים על-ידי חישוב היחס של פעילות לוציפראז המדיום בהשוואה הפעילות לוציפראז הכללית במשך כל תהליך. כי הצלחת התא מכיל שני בינוני ממוזגים בנוסף תאים, לצלחת בינונית בלבד מכיל את אותה כמות של בינוני ממוזגים כמו הלוח התא, זה ראוי לעשות שימוש במשוואה הבאה:
   
   הנה, RLU = יחידות הפריה חוץ גופית יחסית, המדידה המופחת-רקע מהקורא את הצלחת.
5. לחשב את לוציפראז המופרש אכזרי של הפקד חיובי (WT) ואת הבארות שליטה שלילי (S386A).
6. להעריך את האיכות הכוללת של הניסוי על-ידי חישוב של Z-פקטור¹³:
   
   הערה: ערכי פעיל באות מהפקד חיובי (WT), הערכים שאינם פעילים מגיעים מן הבארות שליטה שלילי (S386A). ערכים קרוב יותר ל- 1 מצביעים על איכות ניסויית גבוהה יותר. לשקול לחזור על הניסוי או מיטוב זרימת העבודה אם הערך הוא מתחת ל-0.
7. להעביר את הנתונים מתוך התוכנית הגיליון האלקטרוני לתוך תוכנת ניתוח נתונים מדעיים.
8. לנרמל את הפעילות לוציפראז המופרש לערכים אכזרי של הפקד חיובי (WT) ואת הפקד שלילי (S386A), הגדרת הפקד חיוביים כמו 1 ופקד שלילי של-0.
9. נקה את הנתונים עבור ליניאריים באמצעות שיטת הסרה (האלכסון) ברגרסיה, חריג חשוד טעות, הגדרת הקצב המרבי גילוי שווא על 1%.
10. הערכת הבדלים משמעותיים סטטיסטית על-ידי השוואת הנתונים עבור כל המוטציות תנאי (או מוטציה) כדי הממוצע של הפעילות WT (מנורמל לערך של 1). לבצע אינטראקצית מרובים t-בדיקות, תיקון להשוואות מרובות באמצעות שיטת הולם-Sidak α = 0.05.

תוצאות

וזמינותו תפוקה גבוהה proteolysis נשענת על התגברות על שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, כדי להתגבר על הפלט נמוך מהותית של יחיד-מחזור PCSK9 פרוטאז, פרוטאז PCSK9 חסר מעכבות את prodomain משמשת, עם הרצף המחשוף בזנב prodomain קשורה לוציפראז יכולים להיות מופרשים¹⁴. שנית, כדי לספק את הצורך פר?...

Discussion

ניסיוני בהליכים המתוארים לעיל להציג שיטה להתגבר על הפעילות נמוך מהותית הפרוטאז יחיד-מחזור PCSK9 ולהעריך את פונקציית הפרוטאוליטי בצורה איתנה. המושג מפתח וזמינותו נשענת על המרת אירוע יחיד-מחזור readout enzymatically מוגבר. נקודות החוזק של וזמינותו כוללים את מסגרת זמן קצר יחסית קלות השימוש של הכתב לוצי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PCR Tubes	USA Scientific	1402-2900	For PCR
Q5 Hot Start	New England Biolabs	M0493L	High-fidelity DNA Polymerase
Deoxynucleotide Solution Mix	New England Biolabs	N0447L	dNTPs (for PCR)
pPCSK9-NLucProteaseAssay-WT	Authors	n/a	Available from authors
pPCSK9-NLucProteaseAssay-S386A	Authors	n/a	Available from authors
Agarose LE	Gold Biotechnology	A-201-100	For DNA gels
E-Gel Imager System with Blue Light Base	ThermoFisher Scientific	4466612	For imaging DNA gels
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher Scientific	S33102	For DNA gels
Tris Base	ThermoFisher Scientific	BP152-1	For DNA gel running buffer
Glacial acetic acid	ThermoFisher Scientific	A38-500	For DNA gel running buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid solution	Millipore Sigma	3690	EDTA, for DNA gel running buffer
1 kb DNA ladder	Gold Biotechnology	D010	DNA ladder
DpnI	New England Biolabs	R0176S	Restriction enzyme
LB Agar plates with 100 µg/mL carbenicillin	Teknova	L1010	LB-Carb plates
One Shot Mach1 T Phage-Resistent Chemically Competent E. coli	ThermoFisher Scientific	C862003	Chemically competent cells
LB Broth, Miller	ThermoFisher Scientific	BP1426-2	LB
Carbenicillin	Gold Biotechnology	C-103-5	Selective antibiotic
E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I	Omega BioTek	D6942-02	DNA Purification Miniprep kit
NanoDrop 2000 Spectrophotomer	ThermoFisher Scientific	ND-2000C	Spectrophotometer
293T Cells	American Tissue Culture Collection (ATCC)	CRL-3216	HEK 293T cells
DMEM, high glucose, pyruvate	ThermoFisher Scientific	11995065	DMEM, mammalian cell media
Fetal Bovine Sera	Axenia Biologix	F001	FBS
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300062	Trypsin, for cell dissociation
Phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher Scientific	10010023	PBS
Countess automated cell counter	ThermoFisher Scientific	C10227	Automated cell counting
Countess cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10228	Slides for cell counting
CELLSTAR Tissue Culture Plates, White, White-Bottom, with Lid	Grenier Bio-One	655083	White, white-bottom 96 well plate
TempPlate non-skirted 96-well PCR plate, natural	USA Scientific	1402-9596	96 well plate for master plasmid plate
Nunc 2.0mL DeepWell Plates	ThermoFisher Scientific	278743	96 well deep well plate
Lipofectamine 3000	ThermoFisher Scientific	L3000008	Lipid transfection reagent, Lf3K
P3000 Reagent	ThermoFisher Scientific	L3000008	DNA pre-complexation reagent, provided with Lf3K
OptiMEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	31985062	Reduced serum medium for transfection
(+)-Sodium L-ascorbate	Millipore Sigma	A4034	Sodium ascorbate
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	NaCl
Albumin, Bovine Serum, Fraction V, Low Heavy Metals	Millipore Sigma	12659	BSA
Methanol (HPLC)	ThermoFisher Scientific	A4524	MeOH
Hydrochloric acid	VWR	JT9535-2	Concentrated HCl
Coelenterazine	Gold Biotechnology	CZ2.5	Luciferase substrate
Syringe Filter, Sterile	ThermoFisher Scientific	09-720-3	Sterile filter, PVDF, 0.22 µm pore
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+	Rainin	17013810	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-20XLS+	Rainin	17013808	Multichannel pipette
Pipet-Lite Multi Pipette L12-10XLS+	Rainin	17013807	Multichannel pipette
Reagent reservoir	Corning	4870	Trough for reagents
Centrifuge tubes, 15 mL	ThermoFisher Scientific	05-539-12	15 mL tubes
Centrifuge tubes, 50 mL	Corning	430829	50 mL tubes
Spark Microplate Reader	Tecan	N/a	Plate Reader
Excel	Microsoft	2016 for Mac	Spreadsheet software
Prism	GraphPad Software	v7	Scientific data analysis software