JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) هو سرطان الدم الأكثر شيوعاً في العالم الغربي. هي عوامل النسخ نفات المنظمين هامة للتنمية والتنشيط في العديد من أنواع الخلايا. نقدم هنا، بروتوكول لاستخدام لونين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) في الخلايا البشرية CLL لتحديد الجينات المستهدفة رواية من NFAT2.

Abstract

سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) تتسم بالتوسع في استنساخ الخبيثة بالخليه، ويمثل سرطان الدم الأكثر شيوعاً في البلدان الغربية. وتظهر غالبية المرضى CLL مساراً كسول للمرض وكذلك النمط الظاهري أنيرجيك على خلايا سرطان الدم، مشيراً إلى مستقبلات خلية بلا تستجيب للمؤثر الخارجي. وقد أظهرنا مؤخرا أن عامل النسخ NFAT2 منظم حاسمة من استعطال في CLL. تحديا كبيرا في تحليل دور عامل النسخ في أمراض مختلفة هي تحديد الجينات المستهدفة المحددة لها. وهذا له أهمية كبيرة لتوضيح آليات pathogenetic والتدخلات العلاجية المحتملة. إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) هو أسلوب كلاسيكي لإظهار تفاعلات البروتين-الحمض النووي ويمكن، لذلك، تحديد الجينات هدفا مباشرا لعوامل النسخ في خلايا الثدييات. هنا، استخدمت شريحة لتحديد لك كجينات مستهدفة مباشرة من NFAT2 في الخلايا CLL البشرية. الحمض النووي والبروتينات المرتبطة كروسلينكيد استخدام فورمالدهايد والمنفصمة فيما بعد من سونيكيشن إلى شظايا من الحمض النووي من حوالي 200-500 قاعدة أزواج (bp). Cross-linked شظايا من الحمض النووي المرتبطة NFAT2، ثم بشكل انتقائي إيمونوبريسيبيتاتيد من الحطام الخلية باستخدام جسم مضاد αNFAT2. بعد تنقية، يتم الكشف عن شظايا من الحمض النووي المرتبطة بها عن طريق PCR الكمي في الوقت الحقيقي (قرة-PCR). تسلسل الحمض النووي بتخصيب واضحا تمثل مناطق الجينوم التي تستهدفها NFAT2 في فيفو. القص المناسب للحمض النووي، واختيار جسم المطلوبة أهمية حاسمة لنجاح تطبيق هذا الأسلوب. هذا البروتوكول مثالي لمظاهرة التفاعلات المباشرة من NFAT2 مع الجينات المستهدفة. قصره الرئيسي هو صعوبة توظيف الرقائق في فحوصات واسعة النطاق تحليل الجينات المستهدفة لعدة عوامل النسخ في الكائنات الحية سليمة.

Introduction

سرطان الدم الليمفاوي المزمن (CLL) يمثل سرطان الدم الأكثر شيوعاً في البالغين في البلدان الغربية، نستعرض تراكم متميزة CD19 و CD23 CD5 معربا عن ب نضجاً الخلايا1. معظم المرضى يحمل بالطبع مرض كسول، الذي ليس بالضرورة معاملة محددة لسنوات عديدة. وفي المقابل، تظهر بعض المرضى التقدم السريع التي تتطلب التدخلات العلاجية الفورية مع العلاج الكيميائي المناعي أو غيرها العلاجات المستهدفة2،3. العامل النووي لتنشيط خلايا تي (نفات) عائلة من عوامل النسخ التحكم المختلفة الإنمائية وعمليات التنشيط في الخلية العديد أنواع4،،من56. مؤخرا أثبتنا overexpression وتفعيل NFAT2 في خلايا CLL الدستورية من المرضى الذين يعانون من المرض كسول7. هنا، وهو ينظم إقامة دولة لا تستجيب لتحفيز مستقبلات الخلية بتسمي استعطال7. لإثبات أن NFAT2 بربط البروتين الخاصة بالخلايا اللمفاوية تيروزين كيناز (لك) المروج وينظم لك التعبير في CLL الخلايا البشرية، الإنزيم إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين محددة (شريحة) والعاملين.

رقاقة واحد من عدة تقنيات للتحقيق في دور عوامل النسخ في التعبير الجيني8. أحكام مدبرة التعبير الجيني بطريقة معقدة جداً من المنظمين عدة مع عوامل النسخ أخذ جزءا لا يمكن الاستغناء عنه في هذه العملية9،10،،من1112. وتم تحديد عوامل النسخ تنظيم التعبير الجيني في إطار المكانية والزمانية في عديدة الأنواع (مثل التنمية والتمايز)13،،من1415، 17،،من 1618. الأخطاء في آليات التحكم المعقدة التي تنطوي على عوامل النسخ يمكن أن يؤدي إلى مجموعة متنوعة من العمليات باثولوجي بما في ذلك السرطان19،20. ومن ثم، تحديد عوامل النسخ وأهدافها الخاصة بكل منها قد توفر السبل العلاجية رواية21،22. تتوفر طرق عدة للتحقيق في هذا المجال مثيرة للاهتمام مثل رقاقة والتنقل الغرواني الكهربي التحول المقايسة (أمسا) ومختلف فحوصات الحمض النووي المنسدلة وفحوصات مراسل8،،من1112، 23 , 24.

لإثبات أن عامل نسخ يتفاعل مع مناطق محددة من الجينوم هو المجراة، رقاقة أسلوب مثالي25. لهذا الغرض، تصميمهما الحمض النووي والبروتينات المرتبطة بها في الخلايا الحية هي استخدام الإشعاعات فوق البنفسجية أو فورمالدهايد (رقاقة cross-linked، شكيب). تم حذف هذه الخطوة للحصول على أفضل الحمض النووي والبروتين الانتعاش في رقاقة (نكيب) أصلي ما يسمى26. هي المنفصمة مجمعات البروتين الحمض النووي في وقت لاحق من سونيكيشن إلى شظايا من حوالي 200-500 زوج قاعدي (bp) وإيمونوبريسيبيتاتيد من بين الأنقاض الخلية استخدام جسم معين ضد عامل النسخ للفائدة. أجزاء الحمض النووي المرتبطة بها ثم تنقيته وتتميز ببكر والاستنساخ الجزيئي وتسلسلها. استخدام تقنيات بديلة [ميكروارس] (رقاقة على رقاقة) أو تسلسل الجيل القادم (الرقائق-Seq) لتحليل إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي.

رقاقة قدم لأول مرة قبل جيلمور و Lis عام 1984 عندما كانت تستخدم الأشعة فوق البنفسجية ضوء تساهمي قياس الحمض النووي والالتزام البروتينات في المعيشة البكتيريا27. تحلل الخلايا وإيمونوبريسيبيتيشن من البكتيريا الحمض النووي الريبي بوليميراز، استخدمت تحقيقات محددة من الجينات المعروفة لخريطة توزيع في فيفو وكثافة من الحمض النووي الريبي بوليميراز. بعد ذلك استخدمت الأسلوب المحققون نفس لتحليل توزيع التوكسينات رنا بوليميراز الثاني على جينات بروتين الصدمة الحرارة في المورفولوجية28. وقد صقل المقايسة شكيب فارشافسكي وزملاء العمل الذين أول من استخدم فورمالدهايد العابرة للربط إلى دراسة رابطة هيستون H4 مع الحرارة صدمة البروتين الجينات29،30. النهج نكيب، الذي يحمل في الاستفادة من انتعاش الحمض النووي والبروتين أفضل نتيجة سليمة وبطبيعة الحال [ابيتوبس]، وذلك، أولاً وصف أكبر جسم خصوصية، حبيس والزملاء في عام 198831.

ميزة رقاقة بالمقارنة مع التقنيات الأخرى لتحليل التفاعلات البروتين الحمض النووي هو في الواقع، أن التفاعل الفعلي لعامل النسخ يمكن التحقيق في فيفو وعدم إجراء تحقيقات أو ظروف صناعية تم إنشاؤها بواسطة المخازن المؤقتة أو المواد الهلامية ويعمل11،،من812. عن طريق الجمع بين شرائح مع تسلسل الجيل القادم، يمكن تحديد أهداف متعددة في وقت واحد.

القيود الرئيسية لهذا الأسلوب يتم تطبيقه محدودا لفحوصات على نطاق واسع في الكائنات الحية سليمة25. كما يمكن تحليل أنماط التعبير الجيني التفاضلي الصعبة باستخدام تقنيات الرقائق إذا كان يعبر عن البروتينات منها فقط عند مستويات منخفضة أو خلال الإطارات الزمنية الضيقة. عامل يحتمل أن تحد آخر هو توافر جسم مناسبة ملائمة لرقاقة11.

البروتوكول رقاقة المعروضة هنا يمكن أن تستخدمها لتحديد الجينات المستهدفة عامل النسخ في فيفو الكمي PCR الوقت الحقيقي (قرة-PCR). على وجه التحديد، كان الهدف لتحديد الجينات المستهدفة رواية من NFAT2 في CLL. رقاقة اختير بسبب قدرتها على إظهار ربط NFAT2 إلى مناطق المروج الجينات المستهدفة المختلفة تحت الظروف الطبيعية في خلايا المريض CLL الإنسان مباشرة.

Protocol

جميع التجارب التي أجريت مع المواد البشرية أقرتها "لجنة الأخلاقيات" التابعة لجامعة توبنغن، وتم الحصول على الموافقة الخطية من جميع المرضى الذين ساهموا بعينات لهذه الدراسة.

1-العزلة والتحفيز جوركات الخلايا

ملاحظة: لتحسين البروتوكول، استخدام خط الخلية جوركات المعروف بالتعبير عن مستويات عالية من NFAT2. يتم تنفيذ كافة الخطوات تحت غطاء الاندفاق الصفحي.

  1. إعداد 50 مل من 1640 RPMI تستكمل مع 10 ٪ السفح و 1% البنسلين/ستربتوميسين الاحترار إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي.
  2. الثقافة الخلايا جوركات لمد 1-2 في قارورة ثقافة الخليوي في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في 20 مل من RPMI 1640 تستكمل مع 10 ٪ السفح و 1% البنسلين/ستربتوميسين بكثافة حوالي 2 × 106 خلايا/مل (يتم عد الخلايا مع تريبان تلطيخ الأزرق نويباور الدائرة تحت المجهر) وحصادها من سينتريفوجينج لمدة 5 دقائق في 200 x ز.
  3. إزالة المادة طافية مع ماصة وريسوسبيند الخلايا في 10 مل من 1640 RPMI تستكمل مع السفح 10% و 1% البنسلين/ستربتوميسين. وفي وقت لاحق، عد الخلايا تلطيخ التقليدية تريبان الأزرق ودائرة نويباور تحت المجهر.
  4. الطرد المركزي في الخلايا من الخطوة 1، 3 لمدة 5 دقائق في 200 x ز وإزالة المادة طافية بالطموح. ثم، ريسوسبيند الخلايا في كثافة 2 × 107 خلايا/مل في 1640 RPMI تستكمل مع FCS 10% و 1% البنسلين/ستربتوميسين ونقل 1 مل في أنبوب تقليدية 5 مل جديدة بيبيتينج.
  5. تنشيط الخلايا عن طريق إضافة 32.4 نانومتر phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) وإيونوميسين 1 ميكرومتر. ثم احتضان الخلايا ح 16 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 مع غطاء أنبوب فتح (لتفادي التلوث، فيلم ختم نفاذية الهواء يمكن استخدامها).

2-العزلة وتحفيز الخلايا الأولية CLL من البشر المرضى

ملاحظة: اكتسبت عينات المرضى وحفز كما هو موضح سابقا7. يتم تنفيذ كافة الخطوات تحت غطاء الاندفاق الصفحي.

  1. إعداد المعدات اللازمة سحب الدم من المرضى، والقيام بفصل تدرج كثافة: الإبر 21-ز، عاصبة، NH4-الهيبارين-الدم جمع المحاقن (مثلاً S-مونوفيتيس)، 1 x برنامج تلفزيوني، وكثافة متوسطة الانحدار (الكثافة 1.077 g/mL) .
  2. عند فينيبونكتوري، رسم الدم من المرضى CLL (ca. 40 مل الدم للمريض الواحد) إلى الحقن. ثم نقل الدم في أنابيب مخروطية 50 مل. أغسل المحاقن مع 10 مل برنامج تلفزيوني وتجمع الدم-برنامج تلفزيوني-التعليق في الأنابيب 50 مل (ضبط عدد الأنابيب إلى حجم الدم).
  3. إعداد 15 مل المتوسطة الكثافة المتدرجة في أنبوب مخروطي طازجة 50 مل. وفي وقت لاحق، طبقة 35 مل من الدم-برنامج تلفزيوني-تعليق بعناية في المتوسط الكثافة المتدرجة. ولهذا الغرض، عقد الأنبوبة بزاوية مسطحة ببطء "الماصة؛" الدم-برنامج تلفزيوني-التعليق ضد الجدار أسفل الأنبوبة المخروطية 50 مل. كما أن المزيد من الدم-برنامج تلفزيوني-التعليق تتراكم في أنبوب 50 مل المخروطية، زيادة زاوية الأنبوب حتى زاوية الحق. كرر هذه الخطوة وفقا لحجم الدم-برنامج تلفزيوني-التعليق.
  4. تنفيذ الطرد المركزي في 560 x ز لمدة 20 دقيقة (بدون الفرامل)، ثم استخراج المرحلة خلية وحيدات النوى التي تحتوي على خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس). للقيام بذلك، جمع الطور البيني البيضاء كثافة الفصل التدرج مع 5 مل ماصة مصلية وتحويلها إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
  5. تعبئة الخلية-التعليق على 50 مل ببرنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 360 x ز. إزالة المادة طافية بالطموح. كرر هذه الخطوة مع الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 275 س ز. ثم تجمع خلايا مريض واحد في 5-10 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل.
  6. عد الخلايا كما هو موضح في 1-3.
    ملاحظة: فإنه يعتمد على نسبة الخلايا CLL في ببمكس معزولة، إذا كانت الخلايا يمكن استخدامها مباشرة لهذا الإجراء أو عزل خلية بان تجري، مثلاً، عن طريق خلية المغناطيسي الفرز (ماك). ويوصي بعزل الخلية بلكن يمكن حذفها إذا كانت نسبة الخلايا CLL أعلاه 95% من مجموع الخلايا الليمفاوية (تحدد عن طريق التدفق الخلوي). مرضى الدم CLL الثابتة وتفكيك وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. ثم تلطيخ مع الأجسام المضادة CD19 فيتك و CD5-PE فتتم وفقا لإرشادات الشركة المصنعة ويتم تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. ويبين الشكل 1، الذي هو نسبة الخلايا CLL 89.03% مريض مثالي واحد. وهكذا، قد عزل خلية ب يجب القيام بها بهذا المريض. نسبة الفسيولوجية ب الخلايا هي ضئيلة (3.72% في المثال).
  7. تغسل الخلايا مع 10 مل من قبل حرارة (37 درجة مئوية) 1640 RPMI تستكمل مع السفح 10% والأحماض الأمينية غير الأساسية 100 مم، بيروفات صوديوم 1 مم والبنسلين/ستربتوميسين 1% 50 مم β-ميركابتوثانول لمدة 5 دقائق في 200 x ز وإزالة المادة طافية بالطموح.
  8. ضبط الخلايا إلى 2 × 107 خلايا/مل في 1640 RPMI تستكمل مع FCS 10%، 1% البنسلين/ستربتوميسين، والأحماض الأمينية غير الأساسية 100 مم، 1 مم الصوديوم بيروفات و 50 مم β-mercaptoethanol (37 درجة مئوية) والتعبئة 1 مل تعليق خلية في أنبوب 5 مل.
    ملاحظة: يعمل ß-mercaptoethanol لمقاومة الأكسدة.
  9. تنشيط الخلايا عن طريق إضافة 32.4 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية وإيونوميسين 1 ميكرومتر. ثم احتضان الخلايا ح 16 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 مع غطاء أنبوب فتح (لتفادي التلوث، فيلم ختم نفاذية الهواء يمكن استخدامها).
    ملاحظة: لخفض مستوى التوتر يمكن أن تقع الخلايا ح 1 في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في الحاضنة قبل ح 16 من التحفيز.

3-التثبيت وتحلل الخلية، والقص الكروماتين

ملاحظة: خلايا جوركات وعينات المرضى هي ثابتة وأن تفكيك مع مجموعة شرائح متاحة تجارياً وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مع التعديلات كما هو موضح سابقا7. ويتم التثبيت تحت غطاء الاندفاق الصفحي.

  1. إعداد أنبوب 1.5 مل مع 1 مل من 37% فورمالدهيد وأنبوب 5 مل مع 4 مل من 1 x PBS وأنبوب 1.5 مل مع 1 مل جليكاين 1.25 متر مربع مع الجليد لتثبيت الخلايا.
  2. وبعد تنشيط الخلايا للحضانة كل الوقت في الخطوة 1، 5 أو 2.9، تدور أنابيب 5 مل في 200 x ز لمدة 5 دقائق ريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني في أنابيب 5 مل.
  3. إضافة 340 ميكرون فورمالدهايد (13.5 ميليلتر من 37% فورمالدهيد) في الخلايا. بعد خلط موجزاً بعناية بيبيتينج صعودا وهبوطاً احتضان تعليق 2.5 دقيقة (الخلايا جوركات) أو (عينة المريض) مدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: يلزم وقت التثبيت المطول للخلايا الأولية أؤكد للقص المثلى.
  4. إضافة 125 مم جليكاين (57 ميليلتر من جليكاين 1.25 متر) إيقاف التثبيت واحتضانها لآخر دقيقة 5 وضع الخلايا على الجليد بعد ذلك على الفور، وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية بالطموح.
  5. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني المثلج في 200 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية في كل مرة بتطلع.
    ملاحظة: بعد تثبيت البرنامج، البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً. يجب أن يتم تخزين الخلايا الثابتة في-80 درجة مئوية. لاختبار، إذا كان هو لا مقنعة حانمه من الأجسام المضادة التي تعتزم استخدامها في البروتوكول التالية عن طريق تثبيت، يمكن استخدام عينات إضافية للتحليل عن طريق التفريد جل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي ولطخة غربية. يتم تنفيذ هذه الخطوات مع 100 ميكروغرام من البروتين طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة. وتستخدم جميع الأجسام المضادة αNFAT2 في إضعاف 1: 1000، جسم جابده في إضعاف 1:10000. ويرد في الشكل 2صورة مثالية لعينات محددة من الخلايا جوركات مع الأجسام المضادة الملائمة وغير الملائمة.
  6. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 مل من تحلل المتاحة تجارياً المخزن المؤقت 1 من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. ثم وضع العينات على الجليد على شاكر واحتضانها لهم لمدة 10 دقائق في حين تهتز.
    ملاحظة: قبل تحلل، الخلايا يمكن أن تفككت 10 s في نيتروجين سائل. وهذا مفيد لخلايا جوركات لكن ينبغي تجنبها في عينات المريض الأولية. للتفكك، ضع أنابيب مل 5 ل 5 ق في 5-10 مل من سائل النيتروجين في حاوية محددة. ارتداء نظارات السلامة وقفازات السلامة المناسبة.
  7. وفي وقت لاحق، الطرد المركزي هذه الأنابيب في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية بعناية قبل بيبيتينج.
  8. مجانسة الخلايا في 5 مل من تحلل المتاحة تجارياً العازلة 2 من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان لمدة 10 دقائق على الجليد بينما تهتز. ثم الطرد المركزي هذه الأنابيب في 500 x ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وإزالة المادة طافية بعناية قبل بيبيتينج.
  9. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر (الخلايا جوركات) أو 140 ميليلتر (عينات المرضى) من القص المخزن المؤقت 1 يحتوي على 1 × مثبطات البروتياز (5 ميليلتر أو 1.4 ميليلتر، على التوالي)، واحتضان هذا الخليط لمدة 10 دقائق على الجليد.
  10. لإمالة الكروماتين، نقل 140 ميليلتر من الخلية-التعليق من الخطوة 3.9 في أنابيب سونيكاتور (تجنب إنتاج فقاعات الهواء وكرر هذه الخطوة إذا كان ذلك ضروريا بسبب حجم العينة). ضع الأنابيب في مركزة الترا-سونيكاتور في درجة حرارة 7 درجة مئوية والقص لمدة 10 دقائق (خط الخلية) أو 7.5 دقيقة (عينات المرضى) مع قوة حادث متوسط من 9.375 ث للحصول على 200-500 bp أجزاء الحمض النووي.
  11. وأخيراً، الطرد المركزي في 15700 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية في النابذة الصغيرة وجمع المادة طافية في أنبوب 1.5 مل جديدة.
  12. لاختبار لأحجام بلغة مناسبة، تحليل 20 ميليلتر من الكروماتين المنفصمة عن طريق التفريد جل في TBE 1.5% [اغروس] هلام. ويرد في الشكل 3صورة مثالية من الكروماتين المنفصمة من الخلايا جوركات من نوعية جيدة وسيئة. عند هذه النقطة، يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول المحتمل. يجب أن يتم تخزين المنفصمة الكروماتين في-80 درجة مئوية.

4-الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن

ملاحظة: أجرى إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين مع مجموعة شرائح متاحة تجارياً وفقا لإرشادات الشركة المصنعة مع التعديلات7.

  1. حساب عدد إيمونوبريسيبيتيشنز (70 ميليلتر (الخلايا جوركات) أو 15 ميليلتر (عينات المرضى) الكروماتين المنفصمة بالإضافة إلى جسم واحد) وإعداد 20 ميليلتر من البروتينات المغلفة بالخرز الواحدة وهطول الأمطار في أنبوب 1.5 مل. أغسل الخرز في 40 ميكروليتر 1 × الرقائق العازلة 1 كل هطول الأمطار من بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واسمحوا الخرز الراحة في رف مغناطيسية لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة طافية بيبيتينج. تنفيذ هذه الخطوة أربع مرات في المجموع. في نهاية المطاف، ريسوسبيند الخرز في وحدة التخزين الأصلية مع المخزن المؤقت رقاقة x 1 1.
  2. إيمونوبريسيبيتيشن نفسها، استخدام 10 ميكروغرام لجسم αNFAT2 (7A6) لالتقاط NFAT2 مع تسلسل المستهدفة المرتبطة به. استخدام 2.5 ميكروغرام من جسم مفتش أرنب (DA1E) كعنصر مفتش. إعداد ردود الفعل في أنابيب جديدة 1.5 مل كما هو مبين في الجدول 1.
    ملاحظة: من المهم استخدام جسم [مونوكلونل] مع تقارب عالية الذين حانمه هو عدم ملثمين أثناء التثبيت لهذا البروتوكول. [بولكلونل] أجسام إدخال مستوى إضافي من تباين يجعلها أكثر صعوبة إلى حد كبير تفسير النتائج الواردة على نحو ملائم.
  3. احتضان هذا الخليط من الخطوة 4، 2 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة 6 لفة في الدقيقة.
  4. في القادم تدور اليوم في أنابيب 5 ق في س 7,000 ز في النابذة الصغيرة، احتضان لهم في رف مغناطيسية لمدة 1 دقيقة وإزالة المادة طافية بالطموح. أغسل حبات مرة واحدة مع كل من مخازن المياه والصرف الصحي 1، 2، 3 و 4 متتالية.
  5. للقيام بذلك، ريسوسبيند الخرز في 350 ميليلتر من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي واحتضانها لهم لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية على عجلة دوارة 6 لفة في الدقيقة.
  6. وبعد ذلك، تدور في أنابيب 5 s في 7000 x ز في النابذة الصغيرة. ثم، وضعها لمدة 1 دقيقة في رف مغناطيسية وإزالة المادة طافية وإضافة المخزن المؤقت يغسل المقبلة.
  7. بعد آخر خطوة الغسيل، إزالة المادة طافية بيبيتينج، وتناول الخرز في 100 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت 1 واحتضانها لهم لمدة 30 دقيقة على عجلة دوارة 6 لفة في الدقيقة.
  8. تدور هذه الأنابيب قريبا (5 s في 7000 x ز في النابذة الصغيرة) ووضعها في رف مغناطيسية لمدة 1 دقيقة.
  9. ثم نقل المادة طافية بيبيتينج إلى أنبوب 1.5 مل جديدة وإضافة 4 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت 2.
  10. لإنشاء عنصر تحكم الإدخال، مزيج 1 ميليلتر من الكروماتين المنفصمة مع ميليلتر 99 من شطف المخزن المؤقت 1 و 4 ميليلتر من شطف العازلة 2 (في هذا الإعداد، هناك ثلاثة أنابيب للمريض الواحد: أحد مدخلات التحكم ومراقبة مفتش واحد وعينه αNFAT2 واحدة).
  11. احتضان العينات ح 4 في 65 درجة مئوية و 1300 دورة في الدقيقة في شاكر أنبوب 1.5 مل. إضافة 100 ميليلتر من الايزوبروبانول 100%، ودوامه، وتدور النماذج ل 5 s في 7000 x ز في النابذة الصغيرة.
  12. ريسوسبيند الخرز المغناطيسي المتاحة بدقة فورتيكسينج وإضافة 10 ميليلتر من الخرز لكل عينة واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة 6 لفة في الدقيقة.
  13. بعد الاحتضان، تدور في أنابيب 5 s في 7000 x ز في الصغيرة الطرد المركزي ووضعها لمدة 1 دقيقة في رف مغناطيسية. إزالة المادة طافية بالطموح.
  14. ريسوسبيند الخرز في 100 ميليلتر ليغسل المخزن المؤقت 1. عكس هذه الأنابيب لخلط واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة على عجلة دوارة 6 لفة في الدقيقة.
  15. تدور في أنابيب 5 ق في س 7000 ز في النابذة الصغيرة، مكان لهم لمدة 1 دقيقة في رف مغناطيسية وإزالة المادة طافية بيبيتينج. كرر الخطوات 4.13-4.14 مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2.
  16. بعد ذلك، إزالة المخزن المؤقت أغسل بتطلع وريسوسبيند الخرز في 55 ميليلتر من المخزن المؤقت شطف واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على عجلة الدورية 6 لفة في الدقيقة الوت الحمض النووي سرع. وأخيراً، تدور في أنابيب 5 ق في س 7000 ز في النابذة الصغيرة، مكان لهم لمدة 1 دقيقة في رف مغناطيسية ونقل المادة طافية في أنابيب 1.5 مل جديدة.
    ملاحظة: هنا البروتوكول يمكن أن يحتمل أن مؤقتاً. يجب تخزين الحمض النووي التيد ثم عند-20 درجة مئوية.

5-كشف نفات الهدف الجينات في الخلايا CLL.

  1. إجراء رد فعل qRT-PCR في تكرار لكل عينة كما هو مبين في الجدول 2.
    ملاحظة: للكشف عن الجينات المستهدفة يجري PCR الوقت الحقيقي كمية (قرة-PCR) باستخدام مزيج PCR qRT متاحة تجارياً مع أداة PCR الوقت الحقيقي.
  2. استخدام لوحات بيضاء 96، حسنا فعل لردود الفعل والصك RT-PCR. شروط ركوب الدراجات كما يلي: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، [95 درجة مئوية 5 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s] × 40 دورات.
    ملاحظة: يتم استخدام إضعاف مسلسل من المدخلات (غير مخفف أو المخفف 01:10، 1: 100 و 1: 1000 في المياه خالية من نوكلاس) لحساب إثراء النسبي. في الخلايا جوركات، و إيل-2 كمراقبة إيجابية32. CD40L، هدفا معروفة من NFAT2 في الخلايا ب، استخدمت كعنصر إيجابي في الخلايا CLL و لك كمثال لجين المستهدف رواية من NFAT2 في CLL33،34. الإشعال لمنطقة المروج CD40L، و إيل-2 ، و لك موصوفة في الجدول من الكواشف محددة والمعدات.

6-تطبيع وتحليل البيانات

ملاحظة: يحسب الإثراء النسبي لمناطق المروج للفائدة (إيل-2، أو CD40L ، أو لك) استخدام مفتش--عنصر تحكم للتطبيع.

  1. أولاً، تحديد القيم (عتبة دورة) Ct لتمييع المسلسل الإدخال، و إيل-2، CD40L ومنطقة المروج لك عن طريق تقييم البرامج من بيانات PCR قرت.
  2. تعريف منحنى قياسي للتركيزات عبر تمييع المسلسل من المدخلات. مع هذا المنحنى القياسي حساب تركيز ل إيل-2، CD40L ، ومنطقة المروج لك لكل تكرار لكل عينة.
  3. وبعد ذلك، حساب متوسط التكرارات. ثم تعيين مفتش إيمونوبريسيبيتيشن العينة كمرجع. تعريف الإثراء النسبي لهذه العينة ك 1.0 ومقارنتها عينة أخرى (من إيمونوبريسيبيتيشن NFAT2) إلى هذا المرجع.
  4. وأخيراً، حساب إثراء النسبي بقسمة تركيز العينات بتركيز الإشارة مفتش.

النتائج

ويبين الشكل 1 تحليل الخلوي تدفق مثالي للمريض CLL المنجزة بعد تلطيخ مع الأجسام المضادة CD19 فيتك و CD5-PE. ويبين الشكل 1a النابضة الخلايا الليمفاوية، يمثلون غالبية الخلايا في الدم لدى المرضى CLL. ويبين الشكل 1 باء نسبة CD19+/CD5+ ...

Discussion

الخطوات الحاسمة القيام مقايسة رقاقة ناجحة هي اختيار جسم المناسبة والاستفادة المثلى من الكروماتين القص عملية25. اختيار جسم αNFAT2 ثبت أن يشكل تحديا كبيرا أثناء وضع هذا البروتوكول. بينما توجد العديد من الأجسام المضادة αNFAT2 المتاحة تجارياً وغالبية هذه يعمل بشكل جيد النشاف الغربية ...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها DFG منح مو 3340/1-1 وكريبشيلفي الألمانية منح 111134 (سواء منحت إلى M.R.M.). ونحن نشكر ملنك الكه للمساعدة التقنية الممتازة).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 X PBSSigma AldrichD8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing AgentThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldehyde p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Sample BufferThermo ScientificB0007
Anti-NFAT2 antibodyAlexis1008505Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibodyCell Signaling8032SClone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP GradeAbcamab2796Clone 7A6
big CentrifugeEppendorf5804RCan be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-humanBD Biosciences555412Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5BD Biosciences555353Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mLeppendorf22431021
FBS superiorMerckS0615
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburCan be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Gel Transfer DeviceThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular sizeThermo ScientificIB23001
iDeal ChIp-seq kit for HistonesDiagenodeC01010059
Ionomycin calcium saltSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mgLI-COR Biosciences925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging SystemLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche4729692001Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 AFA-grade waterCovaris520101
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Magnetic rack, DynaMag-15 MagnetThermo Scientific12301DCan be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100XThermo Scientific11140050
Microscope Axiovert 25Zeiss451200Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mmCovaris520045
Neubauer improved counting chamberKarl Hecht GmbH &            Co KG40442012Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin MonovetteSarstedt02.1064
Nuclease-free waterPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-wellThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicillin/Streptomycin 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L promotor region forwardSigma Aldrich5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forwardSigma Aldrich5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forwardSigma Aldrich5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverseSigma Aldrich5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype ControlCell Signaling# 3900SClone DA1E
Real-time PCR instrumentRocheLightCycler 480Can be substituted with similar instruments
Roller mixersPhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein StandardThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Can be substituted with similar instruments
small CentrifugeThermo ScientificHeraeus Fresco 17Can be substituted with similar instruments
Sodium PyruvateThermo Scientific11360070
ß-MercaptoethanolThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling#12498
Trypan Blue solutionSigma Aldrich93595-50ML

References

  1. Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
  2. Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
  3. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
  4. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
  5. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
  6. Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
  7. Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
  8. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
  9. Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
  10. Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
  11. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
  12. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  13. Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
  14. Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
  15. Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
  16. Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
  17. Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
  18. Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
  19. Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
  20. Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
  21. Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
  22. Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
  23. Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
  24. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  25. Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
  26. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  27. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  28. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  29. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  30. Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
  31. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
  32. Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
  33. Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
  34. Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
  35. Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
  36. Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
  37. Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
  38. Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
  39. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  40. Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
  41. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  42. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  43. Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

142 CLL

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved