一种检测慢性淋巴细胞白血病新 nfat2 靶基因的染色质免疫沉淀法

摘要

慢性淋巴细胞白血病 (cll) 是西方世界最常见的白血病。nfat 转录因子是多种细胞类型发育和激活的重要调节剂。在这里, 我们提出了一个在人的 cll 细胞中使用染色质免疫沉淀 (chip) 来识别 nfat2 的新靶向基因的协议。

摘要

慢性淋巴细胞白血病 (clones) 的特点是恶性 b 细胞克隆的扩张, 是西方国家最常见的白血病。大多数 cll 患者表现出疾病的懒散过程, 以及他们的白血病细胞的过敏性表型, 指的是 b 细胞受体对外部刺激没有反应。我们最近已经证明, 转录因子 nfat2 是 cll 过敏的关键调节剂。在分析转录因子在不同疾病中的作用方面的一个主要挑战是确定其特定的目标基因。这对于阐明发病机制和潜在的治疗干预措施具有重要意义。染色质免疫沉淀 (chip) 是一种典型的技术, 以证明蛋白质与 dna 的相互作用, 因此, 可以用来识别直接的目标基因转录因子在哺乳动物细胞。在这里, chip 被用来鉴定lck作为人 cll 细胞中 nfat2 的直接靶向基因。dna 和相关蛋白质使用甲醛交联, 然后通过超声剪断成大约200-500 碱基对 (bp) 的 dna 片段。然后, 使用α-nfat2 抗体从细胞碎片中选择性地进行免疫沉淀。纯化后, 通过定量实时 pcr (qrt-pcr) 检测相关的 dna 片段。具有明显富集的 dna 序列代表了 nfat2在体内所针对的基因组区域。适当的 dna 剪切和所需抗体的选择对这种方法的成功应用特别关键。该方案是证明 nfat2 与目标基因直接相互作用的理想方案。其主要局限性在于难以在大规模检测中应用 chip 分析完整生物体内多种转录因子的靶向基因。

引言

慢性淋巴细胞白血病 (cll) 是西方国家成年人中最常见的白血病, 表现出明显的 cd19、cd23 和 cd5 积累, 表达成熟的 b 细胞¹。大多数患者表现出懒散的疾病过程, 这不需要多年的具体治疗。相反, 一些患者表现出快速进展, 需要立即采取免疫化疗或其他靶向治疗的^{治疗干预 2,3}。活化 t 细胞 (nfat) 的核因子 (nfat) 是控制 4^{、5、6 种}多种细胞类型的各种发育和活化过程的转录因子家族。我们最近从懒散病患者⁷中证明了 nfat2 在 cll 细胞中的过度表达和宪法激活。在这里, 它调节 b 细胞受体刺激的无反应状态称为过敏 7。为了证明 nfat2 与淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶 (lck) 启动子结合并调节人 cll 细胞中lck 的表达, 研制并应用了一种特异性染色质免疫沉淀法 (chip)。

chip 是研究转录因子在基因表达中的作用的几种技术之一.基因表达是由几个调控者以非常复杂的方式紧密协调的, 转录因子在这一过程^中占不可替代的作用 9^{、10、11、12}。在许多物种中 (例如, 用于发育和分化), 已经确定了在空间和时间范围内调节基因表达的转录因子 (例如,用于发育和分化)^13、14、^{15、 16,17,18}。涉及转录因子的复杂控制机制中的错误可导致各种病理过程, 包括癌症^19,20。因此, 转录因子及其各自靶点的鉴定可能提供新的治疗途径^21,22。为了研究这个有趣的领域, 有几种方法可用, 如 chip, 电泳移动转移分析 (emsa), 各种 dna 下拉分析和报告^{检测 8,11, 12,23,24岁}

为了证明一定的转录因子与体内基因组的特定区域相互作用, chip 是一种理想的技术²⁵。为此, 使用紫外线照射或甲醛 (交联 chip, xchip) 将活细胞中的 dna 和相关蛋白质交联。这一步被省略, 以获得更好的 dna 和蛋白质恢复在所谓的本地 chip (nchip)²⁶。dna-蛋白质复合物随后通过超声复制被剪切成大约200-500 碱基对 (bp) 的片段, 并利用针对感兴趣的转录因子的特定抗体从细胞碎片中免疫沉淀。然后通过 pcr、分子克隆和测序对相关的 dna 片段进行纯化和定性。替代技术使用微阵列 (芯片上的 ChIP-on-Chip) 或下一代测序 (ChIP-on-Chip) 来分析免疫沉淀的 dna。

chip 最初是由 gilmour 和 lis 在1984年引入的, 当时它们利用紫外光在活细菌27中共价交联 dna 和结合蛋白.在细菌 rna 聚合酶的细胞裂解和免疫沉淀时, 利用已知基因的特异性探针绘制 rna 聚合酶的体内分布和密度图。该方法随后被同一研究人员用于分析真核rna 聚合酶 ii 在果蝇²⁸热休克蛋白基因上的分布。varshavsky 和同事们进一步完善了 xchip 检测方法, 他们首先使用甲醛交联研究组蛋白 h4 与热休克蛋白基因^{29、30 的}相关性。nchip 方法, 具有更好的 dna 和蛋白质恢复的优势, 由于自然完整的表位, 因此, 更大的抗体特异性, 首次由 hebbes 和他的同事在 1988年^31年描述。

与其他分析 dna-蛋白质相互作用的技术相比, chip 的优势在于, 转录因子的实际相互作用可以在体内进行研究, 而不是由缓冲液或凝胶产生的探针或人工条件。雇用^8,11,12。通过将 chip 与下一代测序相结合, 可以同时识别多个目标。

这种技术的主要局限性在于它对完整生物体中的大规模检测的适用性有限25。差异基因表达模式的分析也可以挑战使用 chip 技术, 如果各自的蛋白质只在低水平或在狭窄的时间窗口表达。另一个潜在的限制因素是是否有适合 chip¹¹的合适抗体。

本文提出的 chip 协议可用于定量实时 pcr (qrt-pcr) 在体内识别转录因子的靶基因。具体而言, 目标是在 cll 中识别 nfat2 的新靶向基因。选择 chip 是因为它有可能直接证明 nfat2 在人 cll 患者细胞自然条件下与不同靶向基因的启动子区域的结合。

研究方案

所有使用人类材料进行的实验都得到了图宾根大学道德委员会的批准, 并获得了为这项研究提供样本的所有患者的书面知情同意。

1. 陪审员室的分离和刺激

注: 若要优化协议, 请使用已知表示高级别 nfat2 的 jurkat 细胞系。所有步骤都是在层流罩下执行的。

1. 在水浴中将 rpmi 1640 加入50毫升, 并加入10% 的 fcs 和1% 的青霉素/链霉素。
2. 在37°c 的细胞培养瓶中培养 1-2 d 的 jurkat 细胞, 在 rpmi 1640 的20毫升中培养 5% co2, 辅以10% 的 fcs 和1% 的 penicillin/streptomycin, 密度约为 2 x^{6 6}细胞/ml (细胞用 trypan blue 染色和 a 计数neubauer 室在显微镜下), 并通过离心 5分钟, 在 200 x g。
3. 用移液器取出上清液, 在 rpmi 1640 的10毫升中重新悬浮细胞, 辅以10% 的 fcs 和1% 的青霉素/链霉素。随后, 用传统的色氨酸蓝色染色和显微镜下的 neubauer 室数着细胞。
4. 将步骤1.3 中的细胞在 200 x克处离心 5分钟, 并通过抽吸去除上清液。然后, 在 rpmi 1640 中以 2 x^{10 7} cellsl 的密度重新悬浮细胞, 辅以10% 的 fcs 和1% 的 penicilinm®链霉素, 并通过移液在新的常规 5 ml 管中转移1毫升。
5. 通过添加 32.4 nm phorbol 12-myristate 13-cate (pma) 和 1μm ionomycin 来刺激细胞。然后在37°c 下孵育细胞 16小时, 在管盖打开的情况下孵育 5% co 2 (为避免污染, 可以使用渗透空气的密封膜)。

2. 人患者原发性 cll 细胞的分离与刺激

注: 如前面所述, 患者样本被采集并受到刺激。所有步骤都是在层流罩下执行的。

1. 准备必要的设备, 以提取患者的血液和进行密度梯度分离:21 g 针, 止血带, nh₄肝素血液收集注射器 (例如, s-单肝), 1x pbs, 和密度梯度介质 (密度 077 g/ml).
2. 静脉穿刺后, 将 cll 患者的血液 (每个患者约40毫升血液) 抽入注射器。然后将血液转移到50毫升的锥形管中。用10毫升 pbs 清洗注射器, 并将血 pbs 悬浮液集中在50毫升管中 (根据血量调整试管数量)。
3. 在一个新鲜的50毫升锥形管中制备密度梯度介质的15毫升。随后, 血 pbs 悬浮液层35毫升在密度梯度介质上仔细。为此, 将管保持在一个平坦的角度, 并慢慢地将血 pbs 悬液移到50毫升锥形管的底壁上。由于更多的血 pbs 悬浮液在50毫升锥形管中积累, 将管的角度增加到直角。根据血 pbs 悬浮液的体积重复此步骤。
4. 在 560 x克进行离心 20分钟 (不刹车), 然后提取含有外周血单个核细胞 (pbmc) 的单个核细胞相。为此, 用5毫升血清学移液器收集密度梯度分离的白色间相, 并将其转移到新的 50 ml 锥形管。
5. 用 pbs 和离心机将细胞悬浮液灌满50毫升, 时间为 5分钟, 在 360 x g。通过抽吸去除上清液。在 275 x g 处离心 5分钟, 重复此步骤. 然后, 将一个病人的细胞集中在一个50毫升的锥形管中, 在5-10 毫升的 pbs 中。
6. 按1.3 中所述对单元格进行计数。
   注: 这取决于 cll 细胞在隔离 pbmc 中的比例, 如果这些细胞可以直接用于此过程, 或者必须进行 b 细胞分离,例如,通过磁性细胞分选 (macs)。建议使用 b 细胞分离, 但如果 cll 细胞的比例超过总淋巴细胞的 95% (通过流式细胞仪确定), 则可以省略 b 细胞分离。cll 患者的血液根据制造商的说明进行固定和裂解。然后根据制造商的说明对 cd19-fitc 和 cd5-pe 抗体进行染色, 并通过流式细胞仪对细胞进行分析。图 1显示了一个模范患者, 其中 cll 细胞的比例为8903。因此, 必须在这个病人身上进行 b 细胞隔离。生理 b 细胞的比例可以忽略不计 (例子中为 3.72)。
7. 用10毫升的预热 (37°c) rpmi 1640 清洗细胞, 辅以10% 的 fcs, 1% 青霉素/链霉素, 100 mm 非必需氨基酸, 1 mm 丙酮酸钠和 50 mm β-丙醇, 5分钟, 200 x g, 并通过吸入去除上清液.
8. 在 rpmi 1640 中, 将细胞调整为 2x^{10 7} cellsl, 辅以10% 的 fcs, 1% 青霉素/链霉素, 100 mm 非必需氨基酸, 1 mm 丙酮酸钠和 50 mm β-硫醇 (37°c), 并将细胞悬浮液的1毫升填充到5毫升的管中。
   注: z-硫醇用于抵消氧化应激。
9. 通过添加 32.4 nm pma 和 1μm ionomycin 刺激细胞。然后在37°c 下孵育细胞 16小时, 在管盖打开的情况下孵育 5% co 2 (为避免污染, 可以使用渗透空气的密封膜)。
   注: 为了降低压力水平, 在刺激16小时之前, 细胞可以在37°c 时休息 1小时, 在孵化器中休息5%。

3. 固定、细胞裂解和染色质剪切

注: 患者样本和 jurkat 细胞是固定的, 并与商业上可用的 chip 套件根据制造商的说明, 并进行修改, 如前面^所述7。固定是在层流罩下进行的。

1. 准备一个 1.5 ml 管与1毫升的37% 甲醛, 1.5 ml 管与1毫升 1.25 m 甘氨酸1毫升, 5 ml 管与4毫升的 1x pbs 和一个盒子与冰的固定细胞。
2. 在步骤1.5 或2.9 中刺激细胞各自的培养时间后, 将 5 ml 管在 200 x g下旋转 5分钟, 并在5毫升管中重新悬浮500μl 的 pbs 中的细胞。
3. 在细胞中加入340μm 甲醛 (13.5μl, 即37% 的甲醛)。经过短暂的混合, 在室温下通过仔细的向上和向下移液孵育悬浮液2.5 分钟 (jurkat 细胞) 或 5分钟 (患者样本)。
   注: 原代细胞需要延长固定时间, 以确保最佳剪切。
4. 加入 125 mm 甘氨酸 (57μl 的 1.25 m 甘氨酸), 停止固定, 再孵育 5分钟, 然后立即将细胞放在冰上, 在4°c 时以 500 x g离心5分钟。通过抽吸去除上清液。
5. 在4°c 下, 用 200 x g的冰冷 pbs 用1毫升清洗细胞 5分钟, 每次通过吸入取出上清液。
   注: 固定后, 可以暂停该方案。固定单元应存储在-80°c。为了测试, 如果打算在以下协议中使用的抗体表位没有通过固定掩盖, 则可以通过 sds-page 凝胶电泳和西方印迹进行分析。根据制造商的说明, 这些步骤使用100μg 的蛋白质。所有的α-nfat2 抗体在稀释1:1000 时使用, gapdh 抗体在稀释1:1000 时使用。图 2显示了来自 jurkat 细胞的固定样本的示例图像, 其中含有适当和不适当的抗体。
6. 通过上下移液, 将细胞颗粒在市售裂解缓冲液1的5毫升中重新使用。然后, 将样品放在摇床上的冰上, 在晃动的同时孵育 1 0分钟。
   注: 在裂解之前, 细胞可以在液氮中分解10秒。这对 jurkat 细胞很有用, 但在初级患者样本中应避免使用。对于崩解, 将5毫升管在5-10 毫升液氮中的5毫升放置在一个特定的容器中。戴上安全眼镜, 戴上适当的安全手套。
7. 随后, 在4°c 下, 以 500 x g的速度离心管 5分钟, 并通过移液仔细取出上清剂。
8. 通过上下移液, 使细胞在5毫升的5毫升中同质化, 并在晃动时在冰上孵育10分钟。然后在4°c 下, 以 500 x g的速度离心管 5分钟, 并通过移液仔细取出上清剂。
9. 将含有1x 蛋白酶抑制剂 (分别为5μl 或 1.4μl) 的剪切缓冲液1的细胞颗粒在 500μl (jurkat 细胞) 或 140μl (患者样本) 中重新注射, 并在冰上孵育混合物10分钟。
10. 对于染色质剪切, 将140μl 的细胞悬浮液从步骤3.9 转移到声纳管中 (避免产生气泡, 并在必要时由于样品体积而重复此步骤)。将管放在聚焦的超超声器中, 温度为 7°c, 剪切时间为 10分钟 (细胞系) 或 7.5分钟 (患者样本), 平均入射功率为 9.375 w, 以获得 200-500 bp dna 片段。
11. 最后, 在 15700 x g的离心机在4°c 下, 在小型离心机中进行10分钟的离心, 并将上清液收集在一个新的 1.5 ml 管中。
12. 为了测试合适的片段尺寸, 通过凝胶电泳在 1.5% tbe 琼脂糖凝胶中分析了剪切染色质的20μl。图 3显示了从质量好和质量差的 jurkat 细胞中剪切染色质的典型图像。此时, 协议可能会暂停。剪切染色质应存放在-80°c。

4. 染色质免疫沉淀

注: 染色质免疫沉淀是根据制造商的说明进行的, 并进行了修改⁷。

1. 计算剪切染色质的免疫沉淀 (70μl (jurkat 细胞) 或 15μl (患者样本) 加上一个抗体) 的数量, 并在 1.5 ml 管中每次沉淀制备20μl 的蛋白质 a 包覆珠子。每次沉淀时, 用40μl 的 chip 缓冲液1清洗珠子, 上下移液, 让珠子在磁性机架中休息 1分钟, 并通过移液去除上清液。总共执行此步骤四次。最终, 使用 1x chip 缓冲区1重新挂起原始卷中的珠子。
2. 对于免疫沉淀本身, 使用10μg 的αnfat2 抗体 (7a6) 捕获带有约束目标序列的 nfat2。使用2.5 微克的兔 igg 抗体 (da1e) 作为 igg 对照。如表 1所示, 用新鲜 1.5 ml 管准备反应。
   注: 重要的是使用高亲和力的单克隆抗体, 其表位在固定过程中没有被掩盖的该方案。多克隆抗体引入了额外的变异水平, 使其更难以正确地解释收到的结果。
3. 在转速为旋转轮提供4.2 步4.2 隔夜的旋转轮。
4. 第二天, 在小型离心机中以 7000xg 的速度将管旋转 5秒, 将其在磁性机架中孵育 1分钟, 并通过吸入去除上清液。用每个洗涤缓冲液1、2、3和4连续清洗珠子一次。
5. 为此, 请将珠子重新悬挂在350μl 的洗涤缓冲液中, 并在4°c 的旋转轮上, 在下午6点将其孵育5分钟。
6. 此后, 在小型离心机中以 7000 x克的速度将管材旋转5秒。然后, 将它们放置在磁性机架中 1分钟, 取出上清液并添加下一个洗涤缓冲液。
7. 最后一步洗涤后, 通过移液去除上清液, 在100μl 洗脱缓冲液1中取出珠子, 并在转速为6转的旋转轮上孵育30分钟。
8. 很快旋转管 (在 7000 x g的小离心机 5 s), 并将它们放在一个磁性机架1分钟。
9. 然后通过移液将上清液转移到新的 1.5 ml 管中, 加入4μl 洗脱缓冲液2。
10. 要创建输入控制, 请将剪切染色质的1μl 与99μl 洗脱缓冲液1和4μl 洗脱缓冲液2混合 (在此设置中, 每个患者有三个管: 一个输入控制、一个 igg 控制和一个αnfat2 样品)。
11. 在65°c 下将样品培养 4年, 在 1.5 ml 管振动台中培养1300转/分。在小型离心机中加入100μl 的100% 异丙醇, 涡旋, 并将样品在 7000 x克的情况下旋转5秒。
12. 通过彻底的涡流重新注入可用的磁珠, 在每个样品中加入10μl 的磁珠, 并在室温下在转速的旋转轮上孵育1小时。
13. 孵育后, 将管在 7000 x克的小型离心机中旋转 5秒, 并将其放置在磁性机架中1分钟。通过抽吸去除上清液。
14. 将珠子重新用100μl 的洗涤缓冲液1重新填充。将管材倒置, 在室温下在转速 6 rpm 的旋转轮上混合和孵育5分钟。
15. 将管道在 7000 x克的小型离心机中旋转 5秒, 将其放置在磁性机架中 1分钟, 并通过移液去除上清液。重复步骤 4.13-4.13 与洗涤缓冲液2。
16. 随后, 通过抽吸取出洗涤缓冲液, 在55μl 洗脱缓冲液中重新悬浮珠子, 并在室温下在旋转轮上孵育 15分钟, 以在下午6点将沉淀的 dna 洗掉。最后, 在小型离心机中以 7000 x克的速度将管旋转 5 s, 将其放置在磁性机架中 1分钟, 并将上清液转移到新的 1.5 ml 管中。
    注: 在这里, 协议可能会暂停。然后, 洗脱的 dna 应储存在-20°c。

5. 检测 cll 细胞中的 nfat 靶基因。

1. 如表 2所示, 对每个样品进行一式两份的 qrt-pcr 反应。
   注: 为了检测目标基因, 使用市售的 qrt-pcr 混合物和实时 pcr 仪器进行定量实时 pcr (qrt-pcr)。
2. 使用白色96孔反应板进行反应和 rt-pcr 仪器。循环条件如下: 95°c 30秒, [95°c 为 5秒, 60°c 为 30秒] x 40周周期。
   注: 在无核酸酶水中, 采用连续稀释输入 (未稀释或稀释 1:10、1: 100 和 1: 1000) 来计算相对富集。在 jurkat 细胞中, il-2被用作阳性^{对照 32}。cd40l是 b 细胞中众所周知的 nfat2 靶点, 在 cll^细胞中作为阳性对照, lck作为 cll 33^、34中 nfat2 新靶点基因的一个例子。在特定试剂和设备的表中描述了cd40l、 il-2和lck促进剂区域的引物。

6. 规范化和数据分析

注: 有关促进器区域 (il-2、 cd40l或lck) 的相对富集是使用 igg 控制进行归一化计算的。

1. 首先, 通过 qrt-pcr 数据的评估软件, 确定输入串行稀释、 il-2、 cd40l和lck启动子区域的 ct (阈值循环) 值。
2. 通过输入的串行稀释, 定义浓度的标准曲线。利用该标准曲线计算每个样品的每个副本的 il-2、cd40l和lck启动子区域的浓度。
3. 接下来, 计算重复项的平均值。然后, 将 igg 免疫沉淀样本设置为参考。将此样本的相对富集定义为 1.0, 并将其他样品 (来自 nfat2 免疫沉淀) 与此参考进行比较。
4. 最后, 通过将样品浓度除以 igg 基准的浓度来计算相对富集。

结果

图 1显示了用 cd19-fitc 和 cd5-pe 抗体染色后对 cll 患者进行的典型流式细胞仪分析。图 1a显示了淋巴细胞的门控, 代表了 cll 患者血液中的大多数细胞。图 1b显示了 cd19⁺/cd5⁺ cll 细胞的比例, 在本例中占淋巴细胞的8.9.03%。cd19⁺/cd5-b 细胞在患者中的比例为3.72。

讨论

执行 chip 分析成功的关键步骤是选择合适的抗体和优化染色质剪切过程²⁵。在该协议的开发过程中, α-nfat2 抗体的选择被证明是特别具有挑战性的。虽然有几种α-nfat2 抗体在商业上可以买到, 其中大多数适用于西方印迹和其他应用, 克隆7a6 是唯一可以成功用于 chip⁷的抗体。即使是来自不同制造商的相同的7a6 抗体在 chip 中的性能也有显著差异。一个主要的挑战是在...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 X PBS	Sigma Aldrich	D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent	Thermo Scientific	B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer	Thermo Scientific	B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS	Roth	4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer	Thermo Scientific	B0007
Anti-NFAT2 antibody	Alexis	1008505	Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody	Cell Signaling	8032S	Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade	Abcam	ab2796	Clone 7A6
big Centrifuge	Eppendorf	5804R	Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human	BD Biosciences	555412	Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5	BD Biosciences	555353	Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml)	Merck	L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL	eppendorf	22431021
FBS superior	Merck	S0615
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur	Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440
iBlot 2 Gel Transfer Device	Thermo Scientific	IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size	Thermo Scientific	IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones	Diagenode	C01010059
Ionomycin calcium salt	Sigma Aldrich	I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg	LI-COR Biosciences	926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg	LI-COR Biosciences	925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System	LI-COR Biosciences	B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white	Roche	4729692001	Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse B	Beckman Coulter	IM1400
M220 AFA-grade water	Covaris	520101
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet	Thermo Scientific	12301D	Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Thermo Scientific	11140050
Microscope Axiovert 25	Zeiss	451200	Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm	Covaris	520045
Neubauer improved counting chamber	Karl Hecht GmbH &            Co KG	40442012	Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette	Sarstedt	02.1064
Nuclease-free water	Promega	P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Scientific	NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL	LI-COR Biosciences	927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X	Merck	A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix	Quanta Bio	95072-012
PMA	Sigma Aldrich	P1585
Primer CD40L promotor region forward	Sigma Aldrich		5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse	Sigma Aldrich		5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward	Sigma Aldrich		5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse	Sigma Aldrich		5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward	Sigma Aldrich		5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse	Sigma Aldrich		5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control	Cell Signaling	# 3900S	Clone DA1E
Real-time PCR instrument	Roche	LightCycler 480	Can be substituted with similar instruments
Roller mixers	Phoenix Instrument	RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Scientific	61870010
Safety-Multifly-needle 21G	Sarstedt	851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925
Shaker Duomax 1030	Heidolph Instruments	543-32205-00	Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge	Thermo Scientific	Heraeus Fresco 17	Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070
ß-Mercaptoethanol	Thermo Scientific	21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)	Cell Signaling	#12498
Trypan Blue solution	Sigma Aldrich	93595-50ML