JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) является наиболее распространенным лейкемии в западном мире. NFAT транскрипционные факторы являются важными регуляторами развития и активации в многочисленных типах клеток. Здесь мы представляем собой протокол для применения иммунопреципитации chromatin (обломока) в клетках человека CLL для выявления новых целевых генов NFAT2.

Аннотация

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) характеризуется расширением злокачественные клетки B клонов и представляет собой наиболее распространенных лейкемии в западных странах. Большинство пациентов ХЛЛ показывают праздного течения заболевания, а также anergic фенотип их лейкозных клеток, ссылаясь на B клеточных рецепторов, не реагируют на внешней стимуляции. Недавно мы показали, что фактор транскрипции NFAT2 является важным регулятором анергия в ХЛЛ. Одной из основных задач в анализе роли фактора транскрипции в различных заболеваний заключается в определении своих конкретных целевых генов. Это имеет большое значение для разяснения патогенетических механизмов и потенциальных терапевтических вмешательств. Иммунопреципитации Chromatin (обломока) является классический способ продемонстрировать взаимодействий протеин дна и может таким образом, использоваться для выявления прямых целевых генов факторов транскрипции в mammalian клетках. Здесь чип использовался для выявления LCK как прямой целевого гена NFAT2 в клетках человека ХЛЛ. Связанные белков и ДНК, сшитые с помощью формальдегида и впоследствии стриженый sonication на фрагменты ДНК приблизительно 200-500 пар оснований (ВР). Сшитых фрагментов ДНК, связанные с NFAT2, затем выборочно immunoprecipitated от мусора ячейки с помощью αNFAT2 антитела. После очистки связанные фрагменты ДНК обнаруживаются через Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). Последовательности ДНК с очевидным обогащения представляют регионы генома, которые являются мишенью для NFAT2 в естественных условиях. Соответствующие стрижка ДНК и подбор необходимых антитела являются особенно важное значение для успешного применения этого метода. Этот протокол является идеальным для демонстрации прямого взаимодействия NFAT2 с генов-мишеней. Его основным ограничением является трудность использовать чип в крупномасштабных анализов, анализ генов-мишеней несколько факторов транскрипции в нетронутыми организмов.

Введение

Хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ) представляет собой наиболее распространенных лейкемии у взрослых в западных странах, выставке собственный накопление CD19, CD23 и CD5 выражая зрелые B клетки1. Большинство пациентов выставку праздного течения, которые не требуют специального лечения для многих лет. Напротив некоторые пациенты показать быстрой прогрессии, требующих немедленного терапевтических вмешательств с иммунной химиотерапии или другие целевые терапии2,3. Ядерный фактор активированные Т-клеток (NFAT) — семейство контроля развития различных факторов транскрипции и активации процессов в многочисленных ячейка типы4,5,6. Недавно мы продемонстрировали гиперэкспрессия и конституционных активации NFAT2 в клетки CLL от пациентов с праздного болезни7. Здесь он регулирует отвечать государства для стимуляции рецепторов клетки B называется анергия7. Чтобы продемонстрировать, что NFAT2 связывается с лимфоцитов специфические белки тирозин киназы (LCK) промоутер и регулирует LCK выражение в клетках человека ХЛЛ, assay иммунопреципитации конкретные хроматина (чип) разработана и занятых.

Чип представляет один из нескольких методов для изучения роли факторов транскрипции гена выражение8. Экспрессия генов плотно делается очень сложным образом несколькими регуляторами с транскрипционными факторами незаменимой участвуя в этот процесс9,10,и11,12. В многочисленных видов (например, для развития и дифференциации)13,14,15, выявлены транскрипционные факторы, регулирующие экспрессии генов в пространственной и временной контекст 16,17,18. Ошибки в замысловатые контрольных механизмов с участием транскрипционных факторов может привести к различных патологических процессов, включая рак19,20. Следовательно выявление факторов транскрипции и их соответствующие цели может предложить роман терапевтических направлений21,22. Расследовать этот интригующий поле несколько методов доступны как чип, assay переноса электрофоретической подвижности (EMSA), различные ДНК выпадающее assays и репортер анализов8,11,12, 23 , 24.

Чтобы продемонстрировать, что определенные транскрипционный фактор взаимодействует с конкретными регионами генома в естественных условиях, чип является идеальной техникой25. Для этой цели ДНК и связанных белков в живых клетках сшиты с помощью УФ-облучения и формальдегид (сшитый чип, XChIP). Этот шаг пропускается, для получения лучшего ДНК и белка восстановления в так называемых родной чип (NChIP)26. Комплексы ДНК белок впоследствии стриженый, sonication на фрагменты примерно 200-500 пар оснований (ВР) и immunoprecipitated от мусора ячейки, используя специфическое антитело против транскрипционный фактор интереса. Связанные фрагменты ДНК затем очищенный и характеризуется PCR, молекулярное клонирование и секвенирование. Альтернативные методы использовать microarrays (чип на Chip) или секвенирование нового поколения (чип-Seq) для анализа immunoprecipitated ДНК.

Чип был впервые введен Гилмор и лис в 1984 году, когда они использовали УФ света ковалентно перекрестных ссылок ДНК и связанных белков в живых бактерий27. После лизиса клеток и иммунопреципитации бактериальных РНК-полимеразы конкретных зонды известных генов были использованы для сопоставления в vivo распределения и плотности РНК-полимеразы. Для анализа распределения эукариот РНК-полимераза II на тепловой шок белок генов в дрозофилы28же следователей впоследствии использовался метод. XChIP проба была далее обогащена Варшавский и coworkers, которые впервые используется формальдегид cross-linking учиться ассоциации гистона H4 с тепловой шок белок генов29,30. NChIP подход, который несет в себе преимущества лучше восстановления ДНК и белка из-за естественно нетронутыми эпитопов и, следовательно, большей специфичности антитела, впервые был описан Hebbes и коллеги в 1988 году31.

Преимуществом чип по сравнению с другими методами для анализа ДНК белковых взаимодействий является на самом деле, что фактическое взаимодействие транскрипционный фактор может быть исследованы в естественных условиях и не зондов или искусственные условия, созданные буферов или гели работают8,,1112. Объединив чип с секвенирование нового поколения, одновременно могут быть определены несколько целей.

Основные ограничения этой техники являются его ограниченную применимость для крупномасштабных анализов в неповрежденной организмов25. Анализ картин выражения гена дифференциальных также может быть сложным, с использованием методов чип, если соответствующие белки выражаются только на низком уровне или в ходе узких временных окон. Еще одним потенциально ограничивающим фактором является наличие соответствующих антител, подходит для чипа11.

Протокол чип, представленные здесь может быть использован для идентификации генов-мишеней транскрипционного фактора в vivo Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР). В частности цель заключалась в выявлении новых целевых генов NFAT2 в ХЛЛ. Чип был выбран за его потенциал непосредственно продемонстрировать привязку NFAT2 промоутер регионам различных целевых генов в естественных условиях в клетках человека ХЛЛ пациента.

протокол

Все эксперименты с человеческого материала были утверждены Комитетом по этике университета Tübingen и письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, которые внесли образцы для этого исследования.

1. изоляция и стимуляции Jurkat клетки

Примечание: Для оптимизации протокола, используйте линии клеток Jurkat, который известен выразить высокий уровень NFAT2. Все действия выполняются под капотом ламинарного потока.

  1. Подготовка 50 мл RPMI 1640 с 10% FCS и 1% пенициллина/стрептомицина дополнена потепления до 37 ° C на водяной бане.
  2. Культура клетки Jurkat для 1-2 d в колбе культуры клеток при 37 ° C и 5% CO2 в 20 мл RPMI 1640 дополнена 10% FCS и 1% пенициллина/стрептомицина плотность примерно 2 х 106 клеток/мл (ячейки отсчитываются с Трипановый синий окрашивание и Нойбауер палата под микроскопом) и собирать их центрифугированием на 5 минут при 200 x g.
  3. Удалить супернатант с пипетки и Ресуспензируйте клетки в 10 мл RPMI 1640, дополненная FCS 10% и 1% пенициллина/стрептомицина. Впоследствии подсчитать количество ячеек с обычными Трипановый синий окрашивание и Нойбауэр камеры под микроскопом.
  4. Центрифуга клетки от шага 1.3 для 5 минут при 200 x g и удалить супернатант путем аспирации. Затем Ресуспензируйте клетки на плотность 2 x 107 кл/мл в RPMI 1640 с FCS 10% и 1% пенициллина/стрептомицина и передачи 1 мл в новой обычных 5 мл трубки дополнена закупорить.
  5. Стимулируют клетки путем добавления 32.4 Нм phorbol 12-миристат 13-ацетат (PMA) и ionomycin 1 мкм. Затем инкубации клеток для 16 ч при 37 ° C и 5% CO2 с крышкой трубки открыт (чтобы избежать загрязнения, могут использоваться герметизации фильм проницаем для воздуха).

2. изоляция и стимуляция клеток первичных ХЛЛ от человека пациентов

Примечание: Пациентов образцов были приобретены и стимулировали как описано выше7. Все действия выполняются под капотом ламинарного потока.

  1. Подготовьте необходимое нарисовать кровь от пациентов и выполнить разделение градиента плотности оборудование: 21-G иглы, жгут, NH4-гепарин-крови коллекции шприцы (например, S-monovettes), 1 x PBS и средний градиент плотности (плотность 1,077 г/мл) .
  2. При венепункции Нарисуйте кровь от ХЛЛ пациентов (ОК. 40 мл крови на пациента) в шприцы. Затем перенесите крови в 50 мл конические трубы. Вымойте шприц 10 мл PBS и бассейн крови PBS-подвеска в 50 мл трубки (отрегулировать количество трубок объемом крови).
  3. Подготовка 15 мл среды градиента плотности в свежий 50 мл Конические трубки. Впоследствии слой 35 мл крови PBS-подвеска тщательно на средний градиент плотности. Для этого держать трубку на плоский угол и медленно Пипетка крови PBS-подвеска к стене нижней конической трубки 50 мл. Как больше из крови PBS-подвеска накапливается в 50 мл Конические трубки, увеличьте угол трубки до прямого угла. Повторите этот шаг, по словам объем крови PBS-подвеска.
  4. Выполнять центрифугирования в 560 x g 20 мин (без тормозов), а затем извлечь этапа мононуклеарных клеток, который содержит мононуклеаров периферической крови (получения). Чтобы сделать это, собирать белые интерфаза разделения градиента плотности с 5 мл Серологические Пипетки и перенести его на новой 50 мл Конические трубки.
  5. Заполните до 50 мл суспензии клеток с PBS и центрифуги для 5 мин на 360 x g. Удалите супернатант аспирации. Повторите этот шаг с центрифугированием на 5 мин на 275 x g. Затем объединить клетки одного пациента в 5-10 мл PBS в 50 мл Конические трубки.
  6. Подсчет количества ячеек, как описано в разделе 1.3.
    Примечание: Это зависит от доли клетки CLL в изолированных репликацию, если клетки могут быть использованы непосредственно для этой процедуры или изоляция клетки B должен проводиться, например, через магнитные ячейку Сортировка (ПДК). Изоляция клетки B рекомендуется, но может быть опущен, если доля клетки CLL выше 95% всего лимфоцитов (определяется через проточной цитометрии). CLL крови больных является фиксированной и анализироваться в соответствии с инструкциями производителя. Клетки анализируются через проточной цитометрии и затем окрашивание с CD19 FITC и CD5-PE антитела производится согласно инструкциям производителя. Один пациент образцовое показано на Рисунок 1, в котором доля клетки CLL 89.03%. Таким образом изоляция клетки B должна выполняться в этом пациента. Доля физиологических клетки B является незначительным (3,72% в примере).
  7. Вымыть клетки с 10 мл подогретым (37 ° C) RPMI 1640 дополнены с 10% FCS, 1% пенициллина/стрептомицина, 100 мм несущественные аминокислот, пируват натрия 1 мм и 50 мм β-меркаптоэтанол 5 минут при 200 x g и удалить супернатант стремлением.
  8. Отрегулируйте клетки 2 x 107 кл/мл в RPMI 1640 дополнена FCS 10%, 1% пенициллина/стрептомицина, 100 мм несущественные аминокислот, 1 мм натрия 50 мм и пирувата β-меркаптоэтанол (37 ° C) и заполнить 1 мл суспензии клеток в 5 мл трубку.
    Примечание: ß меркаптоэтанол используется для противодействия оксидативного стресса.
  9. Стимулируют клетки путем добавления 32.4 Нм PMA и ionomycin 1 мкм. Затем инкубации клеток для 16 ч при 37 ° C и 5% CO2 с крышкой трубки открыт (чтобы избежать загрязнения, могут использоваться герметизации фильм проницаем для воздуха).
    Примечание: Чтобы уменьшить уровень стресса клетки можно отдыхал за 1 ч при 37 ° C и 5% CO2 в инкубаторе до 16 h стимуляции.

3. Фиксация, лизис клеток и Chromatin стрижка

Примечание: Пациентов образцов и Jurkat клетки фиксированной и анализироваться с комплектом коммерчески доступных чип согласно инструкциям производителя с изменениями, как описано выше7. Фиксация выполняется под капотом ламинарного потока.

  1. Подготовьте 1,5 мл с 1 мл 37% формальдегида, 1,5 мл с 1 мл 1,25 М глицин, 5 мл с 4 мл ПБС и коробку со льдом для фиксации клеток.
  2. После стимуляции клеток для соответствующих инкубации время на шаге 1.5 или 2.9 спина 5 мл пробирок на 200 x g 5 мин и Ресуспензируйте клетки в 500 мкл PBS в 5 мл пробирок.
  3. Добавьте 340 мкм формальдегида (13,5 мкл 37% формальдегида) клетки. После краткого перемешивания, тщательно закупорить вверх и вниз Инкубируйте подвеска для 2,5 мин (клетки Jurkat) или 5 мин (пациент образец) при комнатной температуре.
    Примечание: Время длительной фиксации необходим для первичных элементов для обеспечения оптимального стрижки.
  4. Добавить 125 мм глицин (57 мкл 1,25 М глицин) остановить фиксации и инкубировать еще 5 минут поставил клетки на льду сразу же после этого и центрифуги на 500 x g 5 мин при 4 ° C. Удалите супернатант аспирации.
  5. Вымыть клетки дважды с 1 мл ледяной PBS на 200 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант каждый раз путем аспирации.
    Примечание: После фиксации, протокол может быть приостановлена. Фиксированные клетки должны храниться при температуре-80 ° C. Для проверки, если epitope антитела, предназначенных для использования в следующий протокол не маскируется через фиксацию, дополнительные образцы могут использоваться для анализа через электрофореза геля SDS-PAGE и западную помарку. Эти шаги выполняются с 100 мкг белка согласно инструкциям производителя. Все αNFAT2 антитела используются в разведении 1: 1000, GAPDH антител при разбавлении 1: 10000. Образцовое изображения фиксированной образцов от Jurkat клеток с соответствующими и неуместные антитела показан на рисунке 2.
  6. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл коммерчески доступных литического буфера 1, закупорить вверх и вниз. Затем поместите образцы на льда в шейкере и инкубировать их за 10 мин при встряхивании.
    Примечание: Перед лизиса, клетки можно распался в 10 s в жидком азоте. Это полезно для Jurkat клеток, но следует избегать в первичных проб пациентов. Для распада, место 5 мл трубки для 5 s в 5-10 мл жидкого азота в определенном контейнере. Надевайте защитные очки и соответствующие защитные перчатки.
  7. Впоследствии центрифуга трубы на 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант тщательно закупорить.
  8. Однородный клетки в 5 мл коммерчески доступных литического буфера 2, закупорить вверх и вниз и проинкубируйте втечение 10 мин на льду при встряхивании. Затем центрифуга трубы на 500 x g 5 минут при температуре 4 ° C и удалить супернатант тщательно закупорить.
  9. Ресуспензируйте Пелле клеток в 500 мкл (Jurkat клеток) или 140 мкл (пациентов образцов) стрижка буфера 1, содержащие 1 x ингибитор протеазы (5 мкл или 1.4 мкл, соответственно) и инкубировать смесь для 10 мин на льду.
  10. Для сдвига хроматина, перевести 140 мкл суспензии клеток с шагом 3,9 на sonicator трубы (избегайте производить воздушные пузыри и повторите этот шаг, при необходимости, из-за объема образца). Место труб в целенаправленной ультра sonicator при температуре 7 ° C и сдвига для 10 мин (клеточная линия) или 7,5 мин (пациентов образцов) мощностью средняя инцидента 9,375 W для получения фрагментов ДНК 200-500 bp.
  11. Наконец центрифуги на 15700 x g 10 мин при температуре 4 ° C в небольших центрифуг и собирать супернатант в новой 1,5 мл трубки.
  12. Для проверки размеров соответствующий фрагмент, анализировать 20 мкл стриженый хроматина через гель электрофореза в геле агарозы 1,5% КЭ. Образцовое образ стриженый хроматина из Jurkat клеток, хорошие и плохие качества показан на рисунке 3. На данный момент Протокол может быть потенциально приостановлена. Стриженый хроматина должны храниться при температуре-80 ° C.

4. chromatin иммунопреципитации

Примечание: Иммунопреципитации chromatin была выполнена с комплектом коммерчески доступных чип согласно инструкциям производителя с изменениями7.

  1. Рассчитать количество immunoprecipitations (70 мкл (Jurkat клеток) или 15 мкл (пациентов образцов) стриженый хроматина плюс одного антитела) и подготовить 20 мкл протеина A покрытием бусы за осадков в 1,5 мл. Мыть бисер в 40 мкл 1 x буфер 1 чип на осадки, закупорить вверх и вниз, пусть бусы отдых в магнитной стойке за 1 мин и удалить супернатант, закупорить. Выполните этот шаг четыре раза в общей сложности. В конце концов Ресуспензируйте бисер в исходный том с 1 x чип буфера 1.
  2. Для иммунопреципитации, сам используйте 10 мкг αNFAT2 антител (7A6) для захвата NFAT2 с его связанного целевого объекта последовательности. Используйте 2,5 мкг, антитела IgG кролика (DA1E) как элемент IgG. Подготовьте реакции в свежих 1.5 мл пробирок, как указано в таблице 1.
    Примечание: Важно использовать моноклонального антитела с высоким сродством, чьи epitope не масках во время фиксации для этого протокола. Антитела Polyclonal ввести дополнительный уровень колебаний, что делает его значительно более трудным, чтобы надлежащим образом интерпретировать полученные результаты.
  3. Инкубируйте смесь из шага 4.2 на ночь при 4 ° C на вращающееся колесо на 6 об/мин.
  4. На следующий день спин трубы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг, инкубировать их в магнитной стойке за 1 мин и удалить супернатант путем аспирации. Вымойте бусины с каждый из буферов мыть, 1, 2, 3 и 4 последовательно.
  5. Чтобы сделать это, Ресуспензируйте бисер в 350 мкл буфера мытья и проинкубируйте 5 мин при 4 ° C на вращающееся колесо на 6 об/мин.
  6. После этого, спин трубы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг. Затем, место их за 1 мин в магнитной стойке, удалить супернатант и добавьте следующий буфер мыть.
  7. После последнего шага Стиральная удалить супернатант, дозирование, занимают бусины в 100 мкл Элюирующий буфер 1 и Инкубируйте 30 мин на вращающееся колесо на 6 об/мин.
  8. Вскоре спин трубы (5 s на 7000 x g в небольших центрифуг) и поместите их в магнитной стойке за 1 мин.
  9. Затем передача супернатант закупорить к новой 1,5 мл трубки и 4 мкл буфера 2.
  10. Чтобы создать элемент управления вводом, смешайте 1 мкл стриженый хроматина с 99 мкл Элюирующий буфер 1 и 4 мкл буфера 2 (в этом случае, существует три трубы одного пациента: один входной контроль, один IgG контроль и один образец αNFAT2).
  11. Проинкубируйте образцы для 4 ч при температуре 65 ° C и 1300 rpm в шейкере 1,5 мл трубки. Добавить 100 µL 100% изопропиловый спирт, вихрь и спин образцы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг.
  12. Ресуспензируйте доступных магнитных шариков, тщательно vortexing, 10 мкл бисер для каждой выборки и инкубировать 1 час при комнатной температуре на вращающееся колесо на 6 об/мин.
  13. После инкубации, спин трубы для 5 s на 7000 x g в малых центрифуги и разместить их на 1 мин в магнитной стойке. Удалите супернатант аспирации.
  14. Ресуспензируйте бисер в 100 мкл мыть буфера 1. Инвертируйте трубы смешивать и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре на вращающееся колесо на 6 об/мин.
  15. Спин трубы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг, разместите их за 1 мин в магнитной стойке и удалить супернатант, закупорить. Повторите шаги 4.13 и 4.14 с буфером 2 мыть.
  16. Впоследствии удалить буфер мыть стремлением, Ресуспензируйте бисер в 55 мкл буфера и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре на вращающееся колесо на 6 rpm элюировать осажденный ДНК. Наконец, спин трубы для 5 s на 7000 x g в небольших центрифуг, разместить их на 1 мин в магнитной стойке и передачи супернатант в новый 1,5 мл пробирок.
    Примечание: Здесь протокол может быть потенциально приостановлена. Eluted дна затем должны храниться при температуре-20 ° C.

5. Обнаружение NFAT целевых генов в клетки CLL.

  1. Проведение реакции qRT-PCR в двух экземплярах для каждого образца, как указано в таблице 2.
    Примечание: Для обнаружения генов-мишеней Количественная ПЦР в реальном времени (qRT ПЦР) проводится с использованием смеси коммерчески доступных qRT ПЦР с в реальном масштабе времени PCR инструмент.
  2. Используйте белый 96-луночных реакции пластины для реакции и ПЦР-инструмент. Велоспорт условия заключаются в следующем: 95 ° C за 30 сек, [95 ° C за 5 сек, 60 ° C за 30 s] x 40 циклов.
    Примечание: Серийный разрежения ввода (неразбавленный или разбавленных 1:10, 1: 100 и 1: 1000 в свободной от нуклеиназы воды) используется для вычисления относительного обогащения. В Jurkat клетках Ил-2 был использован как положительный контроль32. CD40L, известных целевых NFAT2 в клетки B, был использован как позитивный элемент управления в клетки CLL и LCK в качестве примера для Роман целевого гена NFAT2 в CLL33,34. Праймеры для региона промоутер CD40L, IL-2 и LCK описаны в таблице конкретных реагенты и оборудование.

6. Нормализация и анализ данных

Примечание: Относительная обогащения для регионов промоутер интерес (IL-2, CD40L или LCK) рассчитывается с использованием IgG управления для нормализации.

  1. Во-первых определите значения (порог цикл) Ct для ввода серийного разрежения, IL-2, CD40L и LCK промоутер региона посредством оценки программного обеспечения от данных qRT-PCR.
  2. Определение стандартной кривой концентрации через последовательный разрежения входных данных. С этой стандартной кривой Рассчитайте концентрацию для Ил-2, CD40L и регионе промоутер LCK для каждого дубликата каждого образца.
  3. Далее Вычислите среднее дубликаты. Затем установите образца иммунопреципитации IgG как ссылка. Определение относительной обогащения для этого образца как 1.0 и сравнить другие образца (от NFAT2 иммунопреципитации) к этой ссылке.
  4. Наконец вычислить относительную обогащения путем деления концентрации образцов концентрацию IgG ссылки.

Результаты

Рисунок 1 демонстрирует образцовую потока cytometry анализ ХЛЛ пациента после окрашивания с CD19 FITC и CD5-PE антител. Рисунок 1a показывает стробирования лимфоцитов, представляющие большинство клеток в крови пациентов ХЛЛ. Рисунок 1b

Обсуждение

Важнейшие шаги выполнения успешно пробирного чип являются выбор соответствующей антитела и оптимизации хроматина, стрижка процесса25. Выбор αNFAT2 антитела оказалось особенно сложным во время разработки этого протокола. Хотя есть несколько αNFAT2 антител коммерчески доступн?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа была поддержана DFG Грант му 3340/1-1 и Deutsche Krebshilfe Грант 111134 (оба присуждена M.R.M.). Мы благодарим Elke Malenke за отличную техническую помощь).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 X PBSSigma AldrichD8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing AgentThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldehyde p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Sample BufferThermo ScientificB0007
Anti-NFAT2 antibodyAlexis1008505Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibodyCell Signaling8032SClone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP GradeAbcamab2796Clone 7A6
big CentrifugeEppendorf5804RCan be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-humanBD Biosciences555412Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5BD Biosciences555353Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mLeppendorf22431021
FBS superiorMerckS0615
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburCan be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Gel Transfer DeviceThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular sizeThermo ScientificIB23001
iDeal ChIp-seq kit for HistonesDiagenodeC01010059
Ionomycin calcium saltSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mgLI-COR Biosciences925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging SystemLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche4729692001Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 AFA-grade waterCovaris520101
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Magnetic rack, DynaMag-15 MagnetThermo Scientific12301DCan be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100XThermo Scientific11140050
Microscope Axiovert 25Zeiss451200Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mmCovaris520045
Neubauer improved counting chamberKarl Hecht GmbH &            Co KG40442012Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin MonovetteSarstedt02.1064
Nuclease-free waterPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-wellThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicillin/Streptomycin 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L promotor region forwardSigma Aldrich5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forwardSigma Aldrich5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forwardSigma Aldrich5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverseSigma Aldrich5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype ControlCell Signaling# 3900SClone DA1E
Real-time PCR instrumentRocheLightCycler 480Can be substituted with similar instruments
Roller mixersPhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein StandardThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Can be substituted with similar instruments
small CentrifugeThermo ScientificHeraeus Fresco 17Can be substituted with similar instruments
Sodium PyruvateThermo Scientific11360070
ß-MercaptoethanolThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling#12498
Trypan Blue solutionSigma Aldrich93595-50ML

Ссылки

  1. Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
  2. Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
  3. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
  4. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
  5. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
  6. Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
  7. Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
  8. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
  9. Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
  10. Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
  11. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
  12. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  13. Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
  14. Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
  15. Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
  16. Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
  17. Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
  18. Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
  19. Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
  20. Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
  21. Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
  22. Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
  23. Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
  24. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  25. Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
  26. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  27. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  28. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  29. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  30. Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
  31. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
  32. Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
  33. Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
  34. Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
  35. Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
  36. Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
  37. Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
  38. Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
  39. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  40. Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
  41. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  42. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  43. Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

142NFATchromatin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены