만성 림프모구 백혈병에서 소설 NFAT2 대상 유전자를 식별 하는 Chromatin Immunoprecipitation 분석 결과

요약

만성 림프모구 백혈병 (CLL)은 서방 세계에서 가장 흔한 백혈병이 이다. NFAT 녹음 방송 요인 개발 및 많은 세포 유형에 활성화의 중요 한 레 귤 레이 터는. 여기, 우리 NFAT2의 소설 대상 유전자를 식별 하기 위해 인간의 CLL 세포에 chromatin immunoprecipitation (칩)의 사용에 대 한 프로토콜을 제시.

초록

만성 림프모구 백혈병 (CLL) 악성 B 세포 복제품 확장 특징 이다 고 서방 국가에서 가장 흔한 백혈병을 나타냅니다. CLL 환자의 대다수는 질병의 나태 한 과정 뿐만 아니라 그들의 백혈병 세포의 anergic 형 B 세포 수용 체 외부 자극에 응답을 참조를 표시 합니다. 우리는 최근 녹음 방송 요인 NFAT2 CLL에 아의 중요 한 레 귤 레이 터가 나타났습니다. 다른 질병에서 녹음 방송 요인의 역할의 분석의 주요 과제는 그것의 특정 대상 유전자의 id입니다. 이 pathogenetic 메커니즘 및 잠재적인 치료 내정간섭의 해명에 대 한 큰 의미입니다. Chromatin immunoprecipitation (칩) 단백질 DNA 상호 작용을 설명 하는 고전적인 기법 이며 포유류 세포에 있는 녹음 방송 요인의 직접적인 대상 유전자를 식별 하는 데 따라서 수 있습니다. 여기, 칩 인간 CLL 세포에 NFAT2의 직접적인 대상 유전자로 LCK 를 식별 하기 위해 사용 되었다. DNA와 관련 된 단백질 포름알데히드를 사용 하 여 가교 된 이며 이후 쥡니다 대략 200-500의 기본적인 쌍 (bp)의 DNA 파편에 의해 전단. NFAT2와 관련 된 상호 연결 된 DNA 파편은 다음 선택적으로 αNFAT2 항 체를 사용 하 여 셀 파편에서 immunoprecipitated. 정화, 후 관련된 DNA 파편은 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 통해 검색 됩니다. 분명 농축 된 DNA 시퀀스 NFAT2에서 비보에의해 타겟으로하는 게놈의 지구를 대표 한다. DNA와 필요한 항 체의 선택의 적절 한 전단 하는 것이이 방법의 성공적인 응용 프로그램에 대 한 특히 중요 합니다. 이 프로토콜은 대상 유전자와 NFAT2의 직접적인 상호 작용의 데모에 이상적입니다. 그것의 주요 한계는 그대로 생물의 여러 전사 인자 들의 대상 유전자 분석 대규모 분석에 칩을 사용 하는 데 어려움.

서문

만성 림프모구 백혈병 (CLL) 나타냅니다 서방 국가 있는 성인에서 가장 흔한 백혈병,¹세포 성숙 B 표현 CD19, CD23, 그리고 CD5의 고유한 축적을 전시. 대부분의 환자 들은 몇 년에 대 한 구체적인 치료를 필요로 하지 않는다는 나태 한 질병 과정을 전시 한다. 반면, 일부 환자는 면역 화학요법 또는 다른 표적으로 한 치료^2,3즉각적인 치료 내정간섭을 요구 하는 빠른 진행을 보여줍니다. 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 핵 요소는 다양 한 발달을 조절 하는 전사 인자와 수많은 셀 종류^4,,56활성화 프로세스의 집합입니다. 우리가 최근에⁷나태 한 질병 가진 환자에서 overexpression 헌법의 및 활성화 CLL 세포에 NFAT2 보여 주었다. 여기, 그것은 라는 아⁷B 세포 수용 체 자극에 응답 하지 않는 상태를 조절. NFAT2에 림프 톨 특정 단백질 티로신 키 니 아 제 (LCK) 발기인 및 인간 CLL 세포, 특정 chromatin immunoprecipitation 분석 결과에서 LCK 식 조절 (칩) 개발 및 고용.

칩은 유전자 표현⁸에 녹음 방송 요인의 역할을 조사 하기 위해 여러 가지 기술 중 하나. 유전자 발현은 밀접 하 게이 과정^9,10,,1112에 대신할 참여 하는 전사 인자와 매우 복잡 한 방식으로 여러 규제에 의해 조율 된. 공간과 시간적 맥락에서 유전자 발현을 조절 하는 전사 인자에 수많은 종 (예를 들어, 개발 및 차별화)^{13,,1415, 발견 되었습니다. 16,,1718}. 오류와 관련 된 녹음 방송 요인 복잡 한 제어 메커니즘에 암^19,20를 포함 하 여 pathologic 프로세스의 다양 한 발생할 수 있습니다. 따라서, 녹음 방송 요인 및 그들의 각각 대상의 식별 소설 치료 길^21,22를 제공할 수 있습니다. 이 흥미로운 분야를 조사 하기 위해 여러 가지 방법을 칩, 전기 이동 기동성 교대 분석 실험 (EMSA), 다양 한 DNA 풀 다운 분석 실험 및 기자-분석 실험^8,,1112, 처럼 사용할 수 있습니다. ^{23 , 24}.

특정 전사 인자는 게놈의 특정 지역 상호 작용 입증을 vivo에서 칩 이상적인 기술²⁵입니다. 이 위해 DNA와 살아있는 세포에 관련 된 단백질은 십자가 UV 방사선 조사 또는 포 름 알 데히드 (상호 연결 된 칩, XChIP)를 사용 하 여. 이 단계는 더 나은 DNA 및 단백질 복구 소위 기본 칩 (NChIP)²⁶에서 생략 됩니다. DNA 단백질 복합물은 이후 약 200-500의 기본적인 쌍 (bp)와 관심의 녹음 방송 요인에 대 한 특정 항 체를 사용 하 여 셀에서에서 immunoprecipitated의 파편으로 쥡니다에 의해 전단. 그리고 나 서 연결 된 DNA 파편 정화 PCR, 분자 클로닝 및 시퀀싱에 의해 특징. 대체 기술을 사용 하 여 microarrays (칩-온-칩) 또는 다음-세대 시퀀싱 (칩 Seq) immunoprecipitated DNA를 분석.

칩 길모어에 의해 처음 도입 및 1984 그들은 UV를 사용 하는 경우에 Lis covalently 상호 연결 DNA 빛과 생활에 단백질을 바운드 박테리아²⁷. 세포 세포의 용 해 및 세균성 RNA 중 합 효소의 immunoprecipitation, 알려진된 유전자의 특정 프로브는 vivo에서 유통 및 RNA 중 합 효소의 밀도 매핑하는 데 사용 되었다. 방법은 진 핵 RNA 중 합 효소 II 열 충격 단백질 유전자 초파리²⁸의 분포를 분석 하 같은 수 사관에 의해 연속적으로 사용 되었다. XChIP 분석 결과 Varshavsky와 동료 처음 열 충격 단백질 유전자^29,30와 H4 히스톤의 협회를 공부 cross-linking 포름알데히드를 사용 하 여 더 세련 되었다. 때문에 자연스럽 게 그대로 epitopes 더 나은 DNA와 단백질 복구의 이점을 운반 NChIP 접근 및, 따라서, 더 큰 항 체 특이성, 처음 Hebbes와 동료 1988³¹에 의해 설명 되었다.

칩의 DNA 단백질 상호 작용 분석을 다른 기술에 비해 장점은 사실, 녹음 방송 요인의 실제 상호 작용 수 조사 비보에 아무 프로브 또는 버퍼 또는 젤에 의해 만들어진 인공 조건 ^8,,1112고용. 차세대 시퀀싱 칩을 결합 하 여 여러 개의 목표를 동시에 확인할 수 있습니다.

이 방법의 주요 한계는 그대로 생물²⁵에 대규모 분석을 그것의 제한 적용. 도전만 수준 낮은 또는 좁은 시간 창 동안 각각 단백질 표현 됩니다 경우 칩 기술을 사용 하 여 차동 진 식 패턴의 분석 될 수 있습니다. 또 다른 잠재적으로 제한 요인은 적절 한 항 체 칩¹¹적합의 가용성 이다.

여기에 제시 된 칩 프로토콜 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)으로 대상 유전자의 녹음 방송 요인의 비보에 식별을 위해 사용할 수 있습니다. 특히, 목표 CLL에 NFAT2의 소설 대상 유전자를 확인 했다. 칩은 직접 인간의 CLL 환자 세포의 자연 조건 하에서 다른 대상 유전자의 발기인 지구에 NFAT2의 바인딩을 보여에 그것의 잠재력 때문에 선택 되었다.

프로토콜

모든 실험 인간의 소재와 실시 튀빙겐 대학교의 윤리 위원회에 의해 승인 했다 고 서 면된 동의 샘플이이 연구에 기여 하는 모든 환자에서 얻은.

1. 격리와 자극의 Jurkat 세포

참고: 프로토콜을 최적화 하려면 사용 Jurkat 세포 라인을 표현 하는 NFAT2의 높은 수준으로 알려져 있다. 모든 단계는 층 류 두건 아래 수행 됩니다.

1. 물 욕조에 37 ° C로 온난 하 여 10 %FCS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640의 50 mL를 준비 합니다.
2. RPMI 1640의 20 mL에서 37 ° C, 5% CO₂ 셀 문화 플라스 크에 1-2 d⁶ 셀/mL 10 %FCS 1% 페니실린/스 약 2 x 10의 밀도 보충을 위한 Jurkat 세포 문화 (셀 Trypan와 계산 됩니다 블루 얼룩 및 현미경 Neubauer 챔버) 200 x g에 5 분 동안 centrifuging 여 수확 하는 고.
3. 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 10 %FCS 1% 페니실린/스 보충 RPMI 1640의 10 mL에 셀 resuspend. 그 후, 기존의 trypan 푸른 얼룩 및 현미경 Neubauer 챔버 셀을 계산 합니다.
4. 200 x g 에 5 분 동안 1.3 단계에서 세포를 원심 하 고 열망 하 여는 상쾌한을 제거 합니다. 그런 다음 resuspend RPMI 1640 pipetting으로 10 %FCS 1% 페니실린/스와 전송 새로운 기존의 5 mL 튜브에 1 mL 보충에 2 x 10⁷ 셀/mL의 조밀도에 셀.
5. 32.4 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA) 및 1 µ M ionomycin 추가 하 여 세포를 자극. 다음 16 h 37 ° C와 5%의 CO₂ 열 튜브의 뚜껑에 대 한 셀을 품 어 (오염 방지 씰링 필름 공기 침투성 사용할 수 있습니다).

2. 절연 및 인간 환자에서 기본 CLL 세포의 자극

참고: 환자 샘플 인수 하 고 앞에서 설명한⁷자극 했다. 모든 단계는 층 류 두건 아래 수행 됩니다.

1. 환자 로부터 혈액을 그릴 하 고 밀도 그라데이션 분리를 수행 하기에 필요한 장비를 준비: 21 G 바늘, 지 혈 대, NH₄-헤 파 린-혈액 컬렉션 주사기 (예: S-monovettes), PBS, 그리고 밀도 그라데이션 중간 x 1 (밀도 1.077 g/mL) .
2. 따라 venipuncture, 주사기로 CLL 환자 (ca. 40 mL 혈액 환자 당)에서 혈액을 그립니다. 다음 50 mL 원뿔 튜브에 혈액을 전송 합니다. 10 mL PBS와 주사기를 세척 하 고 혈액-PBS-현 탁 액 (혈액의 볼륨에 튜브 수 조정) 50 mL 튜브에 수영장.
3. 신선한 50 mL 원뿔 튜브에 밀도 그라데이션 매체의 15 mL를 준비 합니다. 그 후, 레이어 35 mL는 혈액-PBS-현 탁 액의 밀도 그라데이션 중간에 신중 하 게. 이 위해 평면 각도에서 튜브를 보유 하 고 천천히 혈액-PBS-현 탁 액 50 mL 원뿔 튜브의 아래쪽 벽에 대 한 플라스틱. 더 많은 혈액-PBS-서 스 펜 션의 50 mL 원뿔 튜브에 축적은, 직각까지 튜브의 각도 증가 합니다. 혈액-PBS-서 스 펜 션의 볼륨에 따라이 단계를 반복 합니다.
4. (브레이크) 없이 20 분 560 x g 에서 원심 분리를 수행 다음 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)를 포함 하는 단 세포 단계를 추출 합니다. 이렇게 하려면 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 밀도 그라데이션 분리의 흰색 interphase를 수집 하 고 새로운 50 mL 원뿔 튜브에 전송 합니다.
5. PBS와 360 x g에서 5 분 동안 원심 분리기로 50 mL에 세포 현 탁 액을 채우십시오. 포부는 상쾌한을 제거 합니다. 275 x g에 5 분 동안 원심 분리와 함께이 단계를 반복 합니다. 그런 다음 5-10 mL 50 mL 원뿔 튜브에 PBS에에서 한 환자의 세포 수영장.
6. 1.3에서 설명한 대로 셀을 계산 합니다.
   참고: 그것은 CLL 세포 격리 된 PBMCs, 셀이이 절차에 대 한 직접 사용 될 수 또는 B 세포 격리 실시 하는 경우에, 예를 들어, 마그네틱 셀 정렬 (맥)을 통해의 비율에 따라 달라 집니다. B 세포 격리 좋지만 CLL 세포의 비율이 총 림프 톨 (cytometry 통해 결정)의 95% 이상 사용 하는 경우 생략할 수 있습니다. 혈액의 CLL 환자 고정 하 고 제조업체의 지침에 따라 lysed. 제조업체의 지침에 따라 수행 됩니다 CD19 FITC와 CD5-PE 항 체와 얼룩 그리고 셀 cytometry 통해 분석 된다. 모범 환자는 그림 1, 있는 CLL 세포의 비율 이다 89.03%에에서 표시 됩니다. 따라서, B 세포의 고립이이 환자에서 수행 되어야 하는. 생리 적인 B 세포의 비율은 무시할 수 (3.72% 예에서)는.
7. 10 %FCS, 1% 페니실린/스, 100mm 비 본질적인 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate와 50 m m β-mercaptoethanol 200 x g 에서 5 분 미리 따뜻하게 (37 ° C) 보충 RPMI 1640의 10 mL로 세포를 세척 하 고는 상쾌한 포부에 의해 제거.
8. 2 x 10⁷ 셀/ml RPMI 1640 FCS가 10%, 1% 페니실린/스, 100mm 비 본질적인 아미노산, 1mm 나트륨 pyruvate와 50 m m β-mercaptoethanol (37 ° C) 및 채우기 셀 서 스 펜 션의 1 mL 5 mL 튜브에 보충에 셀을 조정 합니다.
   참고: ß-mercaptoethanol 산화 스트레스를 중화 시킬 때 채택 된다.
9. 32.4 PMA nM 1 µ M ionomycin를 추가 하 여 세포를 자극. 다음 16 h 37 ° C와 5%의 CO₂ 열 튜브의 뚜껑에 대 한 셀을 품 어 (오염 방지 씰링 필름 공기 침투성 사용할 수 있습니다).
   참고: 스트레스의 수준을 감소 시키는 세포 자극의 16 h 이전 인큐베이터에서 37 ° C, 5% CO₂ 에서 1 시간에 대 한 휴식 될 수 있습니다.

3. 고정, 세포 세포의 용 해, 및 Chromatin 전단

참고: 환자 샘플 Jurkat 세포는 고정 및 수정⁷이전에 설명 된 대로 제조업체의 지시에 따라 상용 칩 키트 lysed. 고정 층 흐름 후드에서 수행 됩니다.

1. 셀의 고정을 위한 37% 포름알데히드, 1.25 M 글리신의 1 mL 1.5 mL 튜브, 1 x PBS의 4 mL 5ml 튜브와 얼음 상자 1 mL 1.5 mL 튜브를 준비 합니다.
2. 단계 1.5 또는 2.9에서에서 각각 보육 시간에 대 한 세포의 자극, 후 5 분 동안 200 x g 에 5 mL 튜브를 회전 하 고 resuspend 5 mL 튜브에 PBS의 500 µ L에 셀.
3. 340 µ M 포름알데히드 (37% 포름알데히드의 13.5 µ L)에 있는 셀에 추가 합니다. 신중 하 게 여기저기 pipetting으로 간단한 혼합 후 2.5 분 (Jurkat 세포) 또는 실 온에서 5 분 (환자 샘플) 정지를 품 어.
   참고: 장기간된 고정 시간 보장 최적의 전단 1 차 셀 필요 합니다.
4. 고정을 중지 하 고 즉시 그 후 얼음에 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 셀을 넣어 또 다른 5 분에 대 한 품 어 125 m m 글리신 (1.25 M 글리신의 57 µ L) 추가 포부는 상쾌한을 제거 합니다.
5. 4 ° C에서 5 분 동안 200 x g 에서 얼음 처럼 차가운 PBS의 1 mL로 두 번 셀을 세척 하 고 열망 하 여는 상쾌한 모든 시간을 제거.
   참고: 고정, 후 프로토콜 수 일시 정지 됩니다. 고정된 셀-80 ° c.에 저장 한다 테스트 하려면, 다음 프로토콜에서 사용 하기 위한 항 체 epitope 하지 고정 통해 복 면 하는 경우, 추가 샘플 통해 SDS 페이지 젤 전기 이동 법 그리고 서쪽 오 점 분석에 사용할 수 있습니다. 다음이 단계는 제조업체의 지침에 따라 단백질의 100 µ g으로 수행 됩니다. 모든 αNFAT2 항 체는 1:1000, 1:10000의 희석에서 GAPDH 항 체의 희석에 사용 됩니다. 적절 하 고 부적 절 한 항 체를 가진 Jurkat 세포에서 고정된 샘플의 모범적인 이미지는 그림 2에 표시 됩니다.
6. 아래로 pipetting으로 상업적으로 사용 가능한 세포의 용 해 버퍼 1의 5 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 그런 다음 샘플 통에 얼음에 놓고 떨고 있는 동안 10 분 동안 그들을 품 어.
   참고: 세포의 용 해, 이전 셀 수 있을 붕괴 10 액체 질소에 s. 이 Jurkat 세포에 대 한 유용 하지만 기본 환자 샘플에 피해 야 한다. 해체, 장소 5 5 mL 튜브는 특정 컨테이너에 액체 질소의 5-10 mL에 s. 안전 안경 및 적절 한 안전 장갑을 착용 하십시오.
7. 그 후, 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 튜브 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 제거 합니다.
8. 상업적으로 사용 가능한 세포의 용 해 버퍼 2의 5 mL에 셀 아래로 pipetting으로 균질 하 고 동요 하는 동안 얼음에 10 분 동안 품 어. 그런 다음 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 튜브 원심 고 pipetting으로 상쾌한을 신중 하 게 제거 하는 방법.
9. 500 µ L (Jurkat 세포)에 셀 펠 릿 resuspend 또는 전단의 140 µ L (환자 샘플) 버퍼 1 protease 억제제 x 1 (5 µ L 또는 1.4 µ L, 각각)와 얼음에 10 분을 위한 혼합물을 품 어.
10. Chromatin 전단에 대 한 전송할 셀-서 스 펜 션의 140 µ L 단계의 3.9 sonicator 튜브 (공기 방울 및 샘플 볼륨 때문에 필요한 경우이 단계 반복 생산 방지). 200-500 bp DNA 파편을 얻으려면 9.375 W의 평균 사건 힘 전단 10 분 (셀 라인) 또는 7.5 분 (환자 샘플) 7 ° C의 온도에 초점 맞춘된 울트라 sonicator에 튜브를 놓습니다.
11. 마지막으로, 작은 원심 분리기에서 4 ° C에서 10 분 동안 15700 x g 에서 원심 고 상쾌한 새로운 1.5 mL 튜브에 수집 합니다.
12. 적절 한 조각 크기에 대 한 테스트, 1.5% TBE agarose 젤에서 젤 전기 이동 법을 통해 전단된 chromatin의 20 µ L를 분석. 좋은 나쁜 품질의 Jurkat 세포에서 깎인된 chromatin의 모범적인 이미지는 그림 3에 표시 됩니다. 이 시점에서, 프로토콜 수 있습니다 잠재적으로 일시 정지 됩니다. 깎인된 chromatin-80 ° c.에 저장 한다

4. 염색 질 Immunoprecipitation

참고: chromatin immunoprecipitation 상용 칩 키트 수정⁷제조업체의 지침에 따라 수행 되었다.

1. Immunoprecipitations (70 µ L (Jurkat 세포) 또는 전단된 chromatin 플러스 1 항 체의 15 µ L (환자 샘플))의 수를 계산 하 고 1.5 mL 튜브에 있는 강 수 당 단백질 코팅 A 구슬의 20 µ L를 준비. 아래로 pipetting으로 강수량 당 칩 버퍼 1 x 1의 40 µ L에 비즈를 세척, 구슬 1 분 자기 선반에 휴식 하 고는 상쾌한 pipetting으로 제거. 4 번 총에이 단계를 수행 합니다. 결국, 1 x 칩 버퍼 1 원래 볼륨에 구슬 resuspend.
2. Immunoprecipitation 자체에 대 한 αNFAT2 항 체 (7A6)의 10 µ g을 사용 하 여 바인딩된 대상 시퀀스 NFAT2를 캡처. IgG-컨트롤로 토끼 IgG 항 체 (DA1E)의 2.5 µ g를 사용 합니다. 표 1에 표시 된 대로 신선한 1.5 mL 튜브에 반응을 준비 합니다.
   참고: 그것은 누구의 epitope는이 프로토콜에 대 한 고정 동안 마스크 하지 높은 선호도와 단일 클론 항 체를 사용 하는 것이 중요입니다. Polyclonal 항 체는 그것은 훨씬 더 어렵게 받은 결과 적절 하 게 해석 하는 변이의 추가 수준을 소개 합니다.
3. 6 rpm에 회전 바퀴에 4 ° C에서 하룻밤 4.2 단계에서 혼합물을 품 어.
4. 다음에 하루 5에 대 한 튜브를 회전 작은 원심 분리기에서 7000 x g s 1 분 자기 선반에 그들을 품 어 및 포부는 상쾌한 제거. 워시 워시 버퍼 1, 2, 3, 4의 각각을 한 번 구슬 연속적으로.
5. 이렇게 하려면 워시 버퍼의 350 µ L에 비즈를 resuspend 하 고 6 rpm에 회전 바퀴에 4 ° C에서 5 분 동안 그들을 품 어.
6. 그 후, 5에 대 한 튜브를 회전 s 7000 x g 작은 원심 분리기에서. 다음, 그들 자석 선반에서 1 분, 제거는 상쾌한 놓고 워시 버퍼를 추가 합니다.
7. 마지막 세척 단계 후 pipetting으로 상쾌한을 제거 하 고 차입 버퍼 1의 100 µ L에 구슬 차지 6 rpm에 회전 바퀴에 30 분 동안 그들을 품 어.
8. 튜브를 곧 스핀 (5 작은 원심 분리기에서 7000 x g s) 1 분 자기 선반에 두십시오.
9. 새로운 1.5 mL 튜브에 pipetting으로 상쾌한 전송 그리고 차입 버퍼 2의 4 µ L를 추가 합니다.
10. 입력된 컨트롤을 만들려면 1 µ L 깎인된 chromatin의 차입 버퍼 2의 차입 버퍼 1과 4 µ L의 99 µ L 믹스 (이 설정에는 환자 당 3 개의 튜브: 하나 입력 제어, IgG-컨트롤 및 하나 αNFAT2 샘플).
11. 4 h 65 ° C에서와 1.5 mL 튜브 통에 1300 rpm에 대 한 샘플을 품 어. 추가 100% 소 프로 파 놀, 소용돌이 및 스핀 100 µ L 5에 대 한 샘플 작은 원심 분리기에서 7000 x g 에서 s.
12. 철저 하 게 vortexing에 의해 사용 가능한 자석 구슬 resuspend, 모든 샘플을 구슬의 10 µ L을 추가 하 고 6 rpm에 회전 바퀴에 실 온에서 1 h에 품 어.
13. 부 화 후 5에 대 한 튜브를 회전 s 작은 7000 x g 에서 원심 및 자석 선반에 1 분 동안 넣어. 포부는 상쾌한을 제거 합니다.
14. 워시 버퍼 1의 100 µ L에 구슬 resuspend. 혼합 하 고 6 rpm에 회전 바퀴에 실 온에서 5 분 동안 품 어 튜브 반전.
15. 5에 대 한 튜브를 회전 s 7000 x g 작은 원심 분리기에서 그들 자석 선반에서 1 분 놓고는 상쾌한 pipetting으로 제거. 워시 버퍼 2 단계 4.13-4.14 반복 합니다.
16. 그 후, 포부에 의해 워시 버퍼를 제거 하 고 차입 버퍼의 55 µ L에 구슬 resuspend 하 고, 침전 된 DNA elute 하 6 rpm에 회전 바퀴에 실 온에서 15 분 동안 품 어. 마지막으로, 5에 대 한 튜브를 회전 s 7000 x g 작은 원심 분리기에서 자석 선반에 1 분 동안 그들을 배치 하 고 새로운 1.5 mL 튜브에는 상쾌한 전송.
    참고: 여기는 프로토콜 수 있습니다 잠재적으로 일시 정지 됩니다. -20 ° c.에 eluted DNA는 저장 합니다 다음

5. CLL 세포에 NFAT 대상 유전자의 탐지.

1. 표 2에 표시 된 대로 모든 샘플에 대 한 중복 qRT-PCR 반응을 수행 합니다.
   참고: 대상 유전자의 검출에 대 한 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)는 실시를 실시간 PCR 장비 상용 qRT-PCR 혼합을 사용 하 여.
2. 흰색 96-잘 반응 플레이트를 사용 하 여 반응 및 RT-PCR 악기에 대 한. 자전거 상태는 다음과 같습니다: 95 ° C 30에 대 한 s, [95 ° C 5에 대 한 s, 30 60 ° C s] 40 주기 x.
   참고: 입력 (undiluted 또는 희석 1시 10분, 1: 100과 nuclease 무료 물에서 1:1000)의 직렬 희석 상대 농축을 계산 하는 데 사용 됩니다. Jurkat 세포, 일리노이-2 긍정적인 컨트롤³²로 사용 되었다. CD40L, B 세포에 NFAT2의 잘 알려진 대상 CLL^33,34NFAT2의 소설 대상 유전자에 대 한 예제로 CLL 세포에 LCK 긍정적인 제어로 사용 되었다. CD40L, 일리노이-2 와 LCK 발기인 지역의 뇌관 특정 시 약 및 장비에 설명 되어 있습니다.

6. 정규화 및 데이터 분석

주:일리노이-2, CD40L ( LCK)의 발기인 지구에 대 한 상대적 농축 정규화에 대 한 IgG 제어를 사용 하 여 계산 됩니다.

1. 먼저, 입력된 직렬 희석, 일리노이-2, CD40L 와 qRT-PCR 데이터에서 평가 소프트웨어를 통해 LCK 발기인 지역에 대 한 Ct (임계값 주기) 값을 결정 합니다.
2. 통해 입력의 직렬 희석 농도 대 한 표준 곡선을 정의 합니다. 이 표준 곡선으로 일리노이-2, CD40L 집중력과 모든 샘플의 각 복제본에 대 한 LCK 발기인 영역을 계산 합니다.
3. 다음, 중복의 평균을 계산 합니다. 그런 다음 참조로 IgG immunoprecipitation 샘플을 설정 합니다. 이 샘플에 대 한 상대적인 농축 1.0으로 정의 하 고이 참조를 (NFAT2 immunoprecipitation)에서 다른 샘플을 비교.
4. 마지막으로, IgG 참조의 농도 의해 샘플의 농도 나누어 상대 농축을 계산 합니다.

결과

그림 1 에서는 CLL 환자 CD19 FITC와 CD5-PE 항 체와 얼룩 후 수행의 모범 흐름 cytometry 분석. 그림 1a 는 CLL 환자의 혈액에 있는 세포의 대부분을 대표는 림프 톨의 게이팅 보여 줍니다. 그림 1b CD19의 비율을 보여줍니다⁺/CD5⁺ CLL 세포, 림프 톨이 예에서 89.03%를 대표 하는. CD19 비율⁺/CD5^-

토론

성공적인 칩 분석 실험을 수행의 중요 한 단계는 적절 한 항 체의 선택과 과정²⁵전단 chromatin의 최적화. ΑNFAT2 항 체의 선택이이 프로토콜의 개발 중 특히 어려운 것으로 판명. 상업적으로 사용할 수 있는 여러 αNFAT2 항 체와이 작품 부 럽 잘 및 다른 응용 프로그램의 대부분은, 복제 7A6 칩⁷성공적으로 사용 될 수 있는 유일한 항 체 했다. 도 살 일 걸 요 다른 제조 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 X PBS	Sigma Aldrich	D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent	Thermo Scientific	B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer	Thermo Scientific	B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS	Roth	4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer	Thermo Scientific	B0007
Anti-NFAT2 antibody	Alexis	1008505	Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody	Cell Signaling	8032S	Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade	Abcam	ab2796	Clone 7A6
big Centrifuge	Eppendorf	5804R	Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human	BD Biosciences	555412	Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5	BD Biosciences	555353	Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml)	Merck	L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL	eppendorf	22431021
FBS superior	Merck	S0615
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACSCalibur	Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)	Thermo Scientific	78440
iBlot 2 Gel Transfer Device	Thermo Scientific	IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size	Thermo Scientific	IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones	Diagenode	C01010059
Ionomycin calcium salt	Sigma Aldrich	I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg	LI-COR Biosciences	926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg	LI-COR Biosciences	925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System	LI-COR Biosciences	B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white	Roche	4729692001	Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse B	Beckman Coulter	IM1400
M220 AFA-grade water	Covaris	520101
M220 Focused-ultrasonicator	Covaris	500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet	Thermo Scientific	12301D	Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X	Thermo Scientific	11140050
Microscope Axiovert 25	Zeiss	451200	Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm	Covaris	520045
Neubauer improved counting chamber	Karl Hecht GmbH &            Co KG	40442012	Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette	Sarstedt	02.1064
Nuclease-free water	Promega	P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well	Thermo Scientific	NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL	LI-COR Biosciences	927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X	Merck	A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix	Quanta Bio	95072-012
PMA	Sigma Aldrich	P1585
Primer CD40L promotor region forward	Sigma Aldrich		5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse	Sigma Aldrich		5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward	Sigma Aldrich		5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse	Sigma Aldrich		5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward	Sigma Aldrich		5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse	Sigma Aldrich		5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control	Cell Signaling	# 3900S	Clone DA1E
Real-time PCR instrument	Roche	LightCycler 480	Can be substituted with similar instruments
Roller mixers	Phoenix Instrument	RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Thermo Scientific	61870010
Safety-Multifly-needle 21G	Sarstedt	851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard	Thermo Scientific	LC5925
Shaker Duomax 1030	Heidolph Instruments	543-32205-00	Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge	Thermo Scientific	Heraeus Fresco 17	Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070
ß-Mercaptoethanol	Thermo Scientific	21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)	Cell Signaling	#12498
Trypan Blue solution	Sigma Aldrich	93595-50ML