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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie in der westlichen Welt. NFAT Transkriptionsfaktoren sind wichtige Regulatoren von Entwicklung und Aktivierung in zahlreichen Zelltypen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verwendung von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) in menschlichen CLL-Zellen, neuartige Zielgene des NFAT2 zu identifizieren.

Zusammenfassung

Chronische lymphatischer Leukämie (CLL) zeichnet sich durch den Ausbau des malignen B-Zell-Klone und stellt die häufigste Leukämie in den westlichen Ländern. Die Mehrheit der CLL-Patienten zeigen eine indolenten Verlauf der Krankheit sowie eines Hauttestes Phänotyp ihrer Leukämie-Zellen unter Bezugnahme auf einen B-Zell-Rezeptor reagiert nicht auf externe Stimulation. Wir haben vor kurzem gezeigt, dass der Transkriptionsfaktor NFAT2 ein entscheidender Regulator der Anergie im CLL. Eine große Herausforderung in der Analyse der Rolle des Transkriptionsfaktors bei verschiedenen Krankheiten ist die Identifikation ihrer spezifischen Zielgene. Dies ist von großer Bedeutung für die Aufklärung der pathogenetische Mechanismen und mögliche therapeutische Interventionen. Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) ist eine klassische Technik um Protein-DNA-Wechselwirkungen zu demonstrieren und kann daher verwendet werden, um direkte Zielgene von Transkriptionsfaktoren in Säugetierzellen zu identifizieren. Hier wurde ChIP zur LCK als ein direktes Zielgen des NFAT2 in den menschlichen CLL-Zellen zu identifizieren. DNA und damit verbundenen Proteine sind vernetzt mit Formaldehyd und anschließend durch Ultraschallbehandlung in DNA-Fragmente von ca. 200-500 Basenpaaren (bp) geschoren. Vernetzte DNA-Fragmente, die mit NFAT2 verbunden sind dann selektiv Immunoprecipitated aus Zellenrückstand mit einem αNFAT2 Antikörper. Nach der Reinigung sind damit verbundenen DNA-Fragmente über quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) erkannt. DNA-Sequenzen mit offensichtlich Bereicherung darstellen Regionen des Genoms, die NFAT2 in Vivoausgerichtet sind. Geeigneten Scheren der DNA und die Auswahl der benötigten Antikörper sind besonders wichtig für die erfolgreiche Anwendung dieser Methode. Dieses Protokoll eignet sich für die Demonstration der direkten Wechselwirkung von NFAT2 mit Zielgene. Seine große Einschränkung ist die Schwierigkeit, ChIP in umfangreichen Tests, die Analyse der Zielgene von mehreren Transkriptionsfaktoren in intakter Organismen zu beschäftigen.

Einleitung

Chronischer lymphatischer Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie bei Erwachsenen in den westlichen Ländern, präsentiert unterschiedliche Ansammlung von CD19, CD23 und CD51Zellen Reifen B zum Ausdruck zu bringen. Die meisten Patienten zeigen eine träge Krankheitsverlauf, die keine spezifische Behandlung für viele Jahre erforderlich macht. Im Gegensatz dazu zeigen einige Patienten schnelle Progression erfordern sofortige therapeutische Interventionen mit Immun-Chemotherapie oder andere gezielte Therapien2,3. Nuklearer Faktor der aktivierten T-Zellen (NFAT) ist eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die Kontrolle der verschiedenen Entwicklungs- und Aktivierung Prozesse in vielen Zelle Arten4,5,6. Wir bewiesen kürzlich Überexpression und konstitutionelle Aktivierung des NFAT2 in CLL-Zellen von Patienten mit indolenten Krankheit7. Es regelt hier einen nicht interaktiver Status B-Zell-Rezeptor Stimulation Anergie7genannt. Um zu zeigen, dass NFAT2 an den Lymphozyten-spezifische Protein Tyrosin-Kinase (LCK) Veranstalter bindet und LCK Ausdruck in menschlichen CLL-Zellen, eine spezifische Chromatin Immunopräzipitation Assay regelt (ChIP) entwickelt und eingesetzt.

ChIP ist einer der mehrere Techniken, um die Rolle der Transkriptionsfaktoren in gen Ausdruck8zu untersuchen. Genexpression wird fest auf sehr komplexe Weise durch mehrere Regler mit Transkriptionsfaktoren, die unter eine unersetzliche Rolle in diesem Prozess9,10,11,12inszeniert. Transkriptionsfaktoren, die Regulierung der Genexpression in einem räumlichen und zeitlichen Kontext sind in zahlreichen Arten (z. B. für die Entwicklung und Differenzierung)13,14,15identifiziert worden, 16,17,18. Fehler in der komplizierten Kontrollmechanismen mit Transkriptionsfaktoren führen zu einer Vielzahl von pathologischen Prozessen einschließlich Krebs19,20. Identifizierung von Transkriptionsfaktoren und ihre jeweiligen Ziele könnte daher neue therapeutische Wege21,22bieten. Um dieses faszinierende Gebiet zu untersuchen sind mehrere Methoden verfügbar wie ChIP, elektrophoretische Mobilität Verschiebung Assay (EMSA), verschiedene DNA-Pulldown-Assays und Reporter-Assays8,11,12, 23 , 24.

Um zu zeigen, dass ein bestimmte Transkriptionsfaktor mit bestimmten Regionen des Genoms Interaktion ist in vivo ChIP eine ideale Technik25. Zu diesem Zweck sind DNA und damit verbundenen Proteine in lebenden Zellen vernetzt mit UV-Bestrahlung oder Formaldehyd (vernetzte ChIP, XChIP). Dieser Schritt entfällt, bessere DNA- und Protein-Erholung in der so genannten native ChIP (NChIP)26zu erhalten. Die DNA-Protein-komplexe werden anschließend durch Ultraschallbehandlung in Fragmente von ca. 200-500 Basenpaaren (bp) und Immunoprecipitated aus der Zellenrückstand mit einem spezifischen Antikörper gegen den Transkriptionsfaktor von Interesse geschoren. Die damit verbundenen DNA-Fragmente werden dann gereinigt und zeichnet sich durch PCR, molekulare Klonierung und Sequenzierung. Alternative Techniken mittels die Immunoprecipitated DNA analysieren Microarrays (ChIP-on-Chip) oder der Next Generation Sequencing (ChIP-Seq).

ChIP wurde erstmals von Gilmour und Lis 1984 wenn sie UV benutzt Licht auf kovalent Querverbindung DNA und Proteine in lebenden gebunden Bakterien27. Nach lyse der Zelle und Immunopräzipitation der bakteriellen RNA-Polymerase wurden spezifische Sonden bekannten Gene verwendet, um die in-Vivo -Verteilung und Dichte der RNA-Polymerase zuzuordnen. Die Methode wurde anschließend durch die gleichen Untersucher verwendet, um die Verteilung der eukaryotischen RNA-Polymerase II auf Hitze Schock Protein Gene in Drosophila28zu analysieren. XChIP-Assay wurde weiter verfeinert, Varshavsky und Kollegen, die Formaldehyd Vernetzung um die Vereinigung von Histon H4 mit Heat Shock Protein Gene29,30studieren zum ersten Mal verwendet. Der NChIP Ansatz, welcher den Vorteil einer besseren DNA- und Protein Erholung wegen natürlich intakt Epitope trägt und daher größere Antikörperbesonderheit wurde erstmals von Hebbes und Kollegen in 198831beschrieben.

Der Vorteil des Chips im Vergleich zu anderen Techniken, um DNA-Protein Interaktionen zu analysieren ist in der Tat, dass die tatsächliche Interaktion einen Transkriptionsfaktor untersuchten in Vivo und keine Sonden oder künstliche Bedingungen erstellt von Puffer oder Gele sind 8,11,12eingesetzt. Durch die Kombination von ChIP mit Next Generation Sequencing, können mehrere Ziele gleichzeitig identifiziert werden.

Wesentliche Einschränkungen dieser Technik sind seine begrenzte Anwendbarkeit auf groß angelegte Assays in intakter Organismen25. Die Analyse der differentiellen gen Expressionsmuster kann auch anspruchsvolle Techniken ChIP, wenn die jeweiligen Proteine nur in geringen Mengen oder bei engen Zeitfenstern ausgedrückt werden. Ein weiterer potentiell limitierende Faktor ist die Verfügbarkeit eines geeigneten Antikörpers für ChIP11geeignet.

Die hier vorgestellten ChIP-Protokoll kann für die in Vivo -Identifizierung der Zielgene von Transkriptionsfaktor durch quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) eingesetzt werden. Insbesondere war das Ziel, neuartige Zielgene von NFAT2 in CLL zu identifizieren. ChIP wurde wegen seines Potentials, die Bindung von NFAT2 an den Projektträger Regionen unterschiedliche Zielgene unter natürlichen Bedingungen in den menschlichen Patienten CLL-Zellen direkt unter Beweis stellen.

Protokoll

Alle Experimente mit menschlichem Material wurden von der Ethikkommission der Universität Tübingen genehmigt und schriftliche Einwilligung wurde von allen Patienten, die Proben zu dieser Studie beigetragen haben.

1. Isolierung und Stimulation der Jurkat-Zellen

Hinweis: Um das Protokoll zu optimieren, verwenden Sie die Jurkat-Zell-Linie bekannt ist, das hohe Niveau der NFAT2 zum Ausdruck bringen. Alle Schritte werden unter einem Laminar-Flow-Haube ausgeführt.

  1. Bereiten Sie 50 mL RPMI 1640 durch Erwärmung auf 37 ° C in einem Wasserbad mit 10 % FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt.
  2. Kultur Jurkat Zellen für 1-2-d in eine Zelle Kultur Kolben bei 37 ° C und 5 % CO2 in 20 mL RPMI 1640 mit 10 % FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin, eine Dichte von ca. 2 x 106 Zellen/mL ergänzt (Zellen werden gezählt, mit Trypan Blaufärbung und eine Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop) und Ernte sie durch 5 min bei 200 X gzentrifugieren.
  3. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und Aufschwemmen der Zellen in 10 mL RPMI 1640 mit 10 % FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin ergänzt. Danach zählen Sie die Zellen mit einem konventionellen Trypan blau-Färbung und eine Neubauer-Kammer unter dem Mikroskop.
  4. Die Zellen von Schritt 1.3 für 5 min bei 200 X g Zentrifugieren und den Überstand durch Absaugen entfernen. Dann erneut die Zellen bei einer Dichte von 2 x 107 Zellen/mL RPMI 1640 ergänzt mit 10 % FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin und Transfer 1 mL in einem neuen konventionellen 5 mL Röhrchen pipettieren.
  5. Stimulieren Sie die Zellen durch Zugabe von 32,4 nM Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) und 1 µM Ionomycin. Inkubieren Sie die Zellen für 16 h bei 37 ° C und 5 % CO2 mit dem Deckel des Schlauches geöffnet (um Kontaminationen zu vermeiden, kann eine Dichtfolie luftdurchlässig verwendet werden).

(2) Isolation und Stimulation der primären CLL-Zellen aus menschlichen Patienten

Hinweis: Patientenproben wurden erworben und als zuvor beschriebenen7angeregt. Alle Schritte werden unter einem Laminar-Flow-Haube ausgeführt.

  1. Bereiten Sie die Ausrüstung notwendig, Blutabnahme von Patienten und führen Sie eine Farbverlauf Dichtetrennung: 21-G-Nadeln, Tourniquet, NH4-Heparin-Blut-Sammlung Spritzen (z. B. S-Monovettes), 1 x PBS und Dichte-Gradienten-Medium (Dichte 1,077 g/mL) .
  2. Venenpunktion schöpfen Sie das Blut von Patienten mit CLL (ca. 40 mL Blut pro Patient) in die Spritzen. Übertragen Sie dann das Blut in 50 mL konische Röhrchen. Waschen Sie die Spritze mit 10 mL PBS und bündeln Sie die Blut-PBS-Aufhängung in der 50 mL-Tuben (passen Sie die Anzahl der Rohre auf das Volumen des Blutes).
  3. Bereiten Sie das Dichte Gradienten Medium in einem frischen 50 mL konische Röhrchen 15 mL. Anschließend Schicht 35 mL Blut-PBS-Aufhängung sorgfältig auf das Dichte-Gradienten-Medium. Halten Sie zu diesem Zweck das Röhrchen in einem flachen Winkel und langsam die Blut-PBS-Aufhängung gegen die untere Wand des konischen Rohres 50 mL pipette. Da mehr Blut-PBS-Aufhängung sammelt sich in der 50 mL konische Rohr, erhöhen Sie den Winkel des Rohres bis zu einem rechten Winkel. Wiederholen Sie diesen Schritt entsprechend dem Volumen der Blut-PBS-Aufhängung.
  4. Zentrifugation bei 560 X g für 20 min (ohne Bremse) durchführen und dann extrahieren der mononukleären Zellen-Phase die peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) enthält. Dies zu tun, sammeln die weißen Interphase gradient Dichtetrennung mit einer serologischen 5 mL-Pipette auf eine neue 50 mL konische Rohr übertragen.
  5. Füllen Sie die Zellsuspension auf 50 mL mit PBS und Zentrifuge für 5 min bei 360 X g. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration. Wiederholen Sie diesen Schritt mit Zentrifugation für 5 min bei 275 X g. Dann bündeln Sie die Zellen eines Patienten in ca. 5-10 mL PBS in einer 50 mL konische Röhre.
  6. Zählen der Zellen wie unter 1.3.
    Hinweis: Es hängt vom Anteil der CLL-Zellen in den isolierten PBMCs, wenn die Zellen direkt für dieses Verfahren verwendet werden oder eine B-Zell-Isolation muss durchgeführt werden, z. B. über magnetische Zelle sortieren (MACS). Die B-Zell-Isolation wird empfohlen aber weggelassen werden, wenn der Anteil der CLL-Zellen über 95 % des gesamten Lymphozyten (ermittelt über Durchflusszytometrie). Blut der CLL-Patienten ist fixiert und entsprechend den Anweisungen des Herstellers lysiert. Dann eine Färbung mit Antikörper CD19-FITC und CD5-PE ist nach den Anweisungen des Herstellers durchgeführt und die Zellen werden über Durchflusszytometrie analysiert. Ein vorbildlicher Patient ist in Abbildung 1dargestellt, der Anteil der CLL-Zellen 89.03 % ausmacht. So muss eine B-Zell-Isolierung bei diesem Patienten durchgeführt werden. Der Anteil der physiologischen B-Zellen ist vernachlässigbar (3,72 % im Beispiel).
  7. Waschen Sie die Zellen mit 10 mL vorgewärmten (37 ° C) RPMI 1640 ergänzt mit 10 % FCS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 100 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, Natrium-Pyruvat 1 mM und 50 mM β-Mercaptoethanol für 5 min bei 200 X g und entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
  8. Passen Sie die Zellen, die 2 x 107 Zellen/mL RPMI 1640 in eine 5 mL-Tube mit 10 % FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin, 100 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1 mM Natrium Pyruvat und 50 mM β-Mercaptoethanol (37 ° C) füllen 1 mL Zellsuspension ergänzt.
    Hinweis: Die ß-Mercaptoethanol wird eingesetzt, um oxidativen Stress entgegenzuwirken.
  9. Stimulieren Sie die Zellen durch Zugabe von 32,4 nM PMA und 1 µM Ionomycin. Inkubieren Sie die Zellen für 16 h bei 37 ° C und 5 % CO2 mit dem Deckel des Schlauches geöffnet (um Kontaminationen zu vermeiden, kann eine Dichtfolie luftdurchlässig verwendet werden).
    Hinweis: Um die Verringerung der Belastung können die Zellen für 1 h bei 37 ° C und 5 % CO2 im Inkubator vor 16 h der Stimulation ausgeruht sein.

(3) Fixierung und Zelle Lysis Chromatin Scheren

Hinweis: Patientenproben und Jurkat Zellen sind festgelegt und mit einem im Handel erhältlichen ChIP Kit nach Herstellerangaben mit Modifikationen wie zuvor beschrieben7lysiert. Die Fixierung erfolgt unter einem Laminar-Flow-Haube.

  1. Bereiten Sie ein 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL 37 % Formaldehyd, ein 1,5 mL Röhrchen mit 1 mL 1,25 M Glycin, eine 5 mL-Tube mit 4 mL 1 X PBS und eine Schachtel mit Eis für die Fixierung der Zellen.
  2. Nach der Stimulation der Zellen für die jeweiligen Inkubationszeit im Schritt 1.5 oder 2,9 spin 5 mL Röhrchen bei 200 X g für 5 min und Aufschwemmen der Zellen in 500 µL PBS in der 5 mL-Tuben.
  3. Die Zellen 340 µM Formaldehyd (13,5 µL 37 % Formaldehyd) hinzufügen. Nach dem kurzen Mischen von oben und unten vorsichtig Pipettieren inkubieren Sie die Suspension für 2,5 min (Jurkat-Zellen) oder 5 min (Patientenprobe) bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Längeren Fixierzeit ist für primäre Zellen gewährleisten optimale Scheren benötigt.
  4. Fügen Sie 125 mM Glycin (57 µL 1,25 M Glycin hinzu), um die Fixierung zu stoppen und ein weiteres 5 min. habe die Zellen auf Eis unmittelbar danach und Zentrifuge bei 500 X g für 5 min bei 4 ° c inkubieren Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
  5. Die Zellen zweimal mit 1 mL eiskaltem PBS bei 200 X g für 5 min bei 4 ° C zu waschen und überstand jedesmal durch Aspiration entfernen.
    Hinweis: Nach der Fixierung kann das Protokoll angehalten werden. Fixe Zellen sollte bei-80 ° c gelagert werden Um zu testen, ob das Epitop des Antikörpers in das folgende Protokoll verwenden soll über Fixierung nicht maskiert ist, können zusätzliche Proben für die Analyse über die SDS-PAGE-Gel-Elektrophorese und Western-Blot verwendet werden. Diese Schritte sind mit 100 µg Protein nach Herstellerangaben durchgeführt. Alle αNFAT2-Antikörper werden bei einer Verdünnung von 1: 1000, GAPDH-Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 10000 eingesetzt. Ein beispielhafte Bild von örtlich festgelegten Proben von Jurkat Zellen mit passenden und unpassenden Antikörper ist in Abbildung 2dargestellt.
  6. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL handelsübliche Lyse Puffer 1 durch Pipettieren rauf und runter. Dann legen Sie die Proben auf dem Eis in einen Shaker geben und inkubieren sie 10 min beim Schütteln.
    Hinweis: Vor der Lyse, die Zellen können sein zerfiel für 10 s in flüssigem Stickstoff. Dies ist nützlich für Jurkat Zellen aber in primären Patientenstichproben vermieden werden. Platz für den Zerfall der 5 mL-Tuben für 5 s in 5 bis 10 mL des flüssigen Stickstoffs in einem bestimmten Container. Tragen Sie Schutzbrille und geeignete Schutzhandschuhe.
  7. Anschließend Schläuche am 500 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand vorsichtig durch pipettieren.
  8. Homogenisieren Sie die Zellen in 5 mL handelsübliche Lyse Puffer 2 von oben und unten Pipettieren zu und inkubieren Sie für 10 min auf Eis beim Schütteln. Dann Schläuche am 500 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand sorgfältig durch Pipettieren entfernen.
  9. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL (Jurkat-Zellen) oder 140 µL (Patientenproben) Scheren Puffer 1 mit 1 x Protease-Inhibitor (5 µL oder 1,4 µL, beziehungsweise) und inkubieren Sie die Mischung für 10 min auf Eis.
  10. Übertragen Sie für Chromatin Scheren 140 µL der Zellsuspension aus Schritt 3,9 in Sonikator Röhren (Vermeidung von Herstellung von Luftblasen und wiederholen Sie diesen Schritt ggf. durch Probenvolumen). Legen Sie die Rohre in der fokussierten Ultra-Sonikator bei einer Temperatur von 7 ° C und Scherkräfte für 10 min (Zelllinie) bzw. 7,5 min (Patientenproben) mit einer einfallenden Durchschnittsleistung von 9,375 W 200-500 bp DNA-Fragmente zu erhalten.
  11. Zu guter Letzt 15700 X g für 10 min bei 4 ° C in der kleinen Zentrifuge Zentrifugieren und sammeln des Überstands in ein neues 1,5 mL-Tube.
  12. Um für die entsprechende Fragment Größen zu testen, analysieren Sie 20 µL des Chromatins durch Gel-Elektrophorese im Agarosegel 1,5 % TBE geschert. Ein beispielhafte Bild des geschert Chromatin von Jurkat Zellen von guten und schlechten Qualität ist in Abbildung 3dargestellt. An dieser Stelle kann das Protokoll möglicherweise angehalten werden. Sheared Chromatin sollte bei-80 ° c gelagert werden

4. Chromatin Immunopräzipitation

Hinweis: Das Chromatin Immunopräzipitation erfolgte mit einem kommerziell erhältlichen ChIP Kit nach Herstellerangaben mit Modifikationen7.

  1. Berechnen Sie die Anzahl der Immunperoxidase (70 µL (Jurkat-Zellen) oder 15 µL (Patientenproben) geschoren Chromatin plus einem Antikörper) und bereiten Sie 20 µL Protein A beschichtet Perlen pro Niederschläge in einem 1,5 mL-Tube. Waschen Sie die Perlen in 40 µL 1 x ChIP Puffer 1 pro Niederschläge durch Pipettieren rauf und runter, lassen Sie die Perlen in einem magnetischen Rack für 1 min ruhen und den Überstand durch Pipettieren entfernen zu. Führen Sie diesen Schritt insgesamt viermal. Schließlich erneut die Perlen des ursprünglichen Volumens mit 1 X ChIP Puffer 1.
  2. Verwenden Sie für die Immunopräzipitation selbst 10 µg αNFAT2 Antikörper (7A6), um NFAT2 mit seiner gebundenen Zielsequenzen zu erfassen. Verwenden Sie 2,5 µg ein Kaninchen-IgG-Antikörper (DA1E) als ein IgG-Steuerelement. Bereiten Sie die Reaktionen in frischen 1,5 mL-Tuben, wie in Tabelle 1angegeben.
    Hinweis: Es ist wichtig, einen monoklonaler Antikörper mit hoher Affinität zu verwenden, deren Epitop während Fixierung für dieses Protokoll nicht maskiert ist. Polyclonal Antikörper stellen ein zusätzliches Maß an Veränderung erschwert erheblich die erhaltenen Ergebnisse angemessen zu interpretieren.
  3. Inkubieren Sie die Mischung aus Schritt 4.2 über Nacht bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad bei 6 u/min.
  4. Am nächsten Tag drehen der Rohre für 5 s bei 7.000 X g in der kleinen Zentrifuge brüten sie in einem magnetischen Rack für 1 min und den Überstand durch Absaugen entfernen. Waschen Sie die Perlen einmal mit jedem Waschen-Puffer 1, 2, 3 und 4 nacheinander.
  5. Dazu, Aufschwemmen Sie die Perlen in 350 µL Waschpuffer und inkubieren sie 5 min bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad bei 6 u/min.
  6. Danach drehen Sie die Rohre für 5 s bei 7000 X g in der kleinen Zentrifuge. Dann legen Sie sie für 1 min in einem magnetischen Rack entfernen des Überstands und die nächste Waschpuffer.
  7. Nach dem letzten Waschschritt entfernen des Überstands durch pipettieren, nehmen die Perlen in 100 µL der Elution Puffer 1 und inkubieren sie für 30 min. auf einem rotierenden Rad bei 6 u/min.
  8. Drehen Sie die Rohre kurz (5 s bei 7000 X g in der kleinen Zentrifuge) und legen Sie sie in einem magnetischen Rack für 1 min.
  9. Danach transfer des Überstands durch eine neue 1,5 mL Röhrchen pipettieren und 4 µL Elution Puffer 2.
  10. Um das Eingabesteuerelement erstellen, mischen Sie 1 µL des Chromatins geschert mit 99 µL Elution Puffer 1 und 4 µL Elution Puffer 2 (in diesem Setup gibt es drei Röhrchen pro Patient: ein Eingang, Steuerung, eine IgG-Steuerung und eine αNFAT2 Probe).
  11. Inkubieren Sie die Proben für 4 h bei 65 ° C und 1300 u/min in einem 1,5 mL Tube Shaker. Hinzufügen von 100 µL 100 % Isopropanol, Wirbel und Spin die Proben für 5 s bei 7000 X g in der kleinen Zentrifuge.
  12. Aufschwemmen der verfügbaren magnetischen Kügelchen durch gründlich aufschütteln, 10 µL der Perlen zu jeder Probe hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad bei 6 u/min inkubieren.
  13. Nach der Inkubation, Drehen der Rohre für 5 s bei 7000 X g in der kleinen Zentrifugieren und legen Sie sie für 1 min in einem magnetischen Rack. Entfernen Sie den Überstand durch Aspiration.
  14. Die Perlen in 100 µL Waschpuffer 1 aufzuwirbeln. Invertieren Sie die Rohre zu mischen und 5 min bei Raumtemperatur auf einem rotierenden Rad bei 6 u/min inkubieren.
  15. Drehen Sie die Rohre für 5 s bei 7000 X g in der kleinen Zentrifuge, legen Sie sie für 1 min in einem magnetischen Rack und den Überstand durch Pipettieren zu entfernen. Wiederholen Sie die Schritte 4.13-4.14 mit Waschpuffer 2.
  16. Anschließend den Waschpuffer durch Aspiration entfernen, Aufschwemmen der Perlen in 55 µL Elution Buffer und inkubieren Sie für 15 min bei Raumtemperatur auf dem rotierenden Rad bei 6 u/min, die ausgefällte DNA eluieren. Schließlich Drehen der Rohre für 5 s bei 7000 X g in der kleinen Zentrifuge, legen Sie sie für 1 min in einem magnetischen Rack und den Überstand in neuen 1,5 mL Röhrchen zu übertragen.
    Hinweis: Hier kann das Protokoll möglicherweise angehalten werden. Die eluierten DNA sollte dann bei-20 ° c gelagert werden

5. Erkennung von NFAT Zielgene in CLL-Zellen.

  1. Führen Sie die qRT-PCR-Reaktion in zweifacher Ausfertigung für jede Probe, wie in Tabelle 2angegeben.
    Hinweis: Für den Nachweis von Zielgenen eine quantitative Echtzeit-PCR (qRT-PCR) erfolgt mit einem handelsüblichen qRT-PCR-Mix mit einem Real-Time PCR-Instrument.
  2. Verwenden Sie weiße 96-Well-Reaktion-Platten für die Reaktionen und die RT-PCR-Instrument. Der Radsport Bedingungen lauten wie folgt: 95 ° C für 30 s, [95 ° C für 5 s, 60 ° C für 30 s] x 40 Zyklen.
    Hinweis: Eine serielle Verdünnung des Eingangs (unverdünnt oder verdünnt 01:10, 1: 100 und 1: 1000 in Nuklease-freies Wasser) wird verwendet, um die relative Anreicherung zu berechnen. In Jurkat Zellen wurde IL-2 als eine Positivkontrolle32verwendet. CD40L, einem bekannten Ziel NFAT2 in B-Zellen, diente als Positivkontrolle bei CLL-Zellen und LCK als Vorbild für eine neuartige Zielgen des NFAT2 CLL33,34. Die Primer für die CD40L, die Il-2 und LCK Promotor-Region sind in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte beschrieben.

(6) Normalisierung und Datenanalyse

Hinweis: Relative Bereicherung für die Promoter-Regionen von Interesse (Il-2, CD40L oder LCK) wird anhand das IgG-Control für die Normalisierung.

  1. Ermitteln Sie zunächst, Ct (Schwelle Zyklus) Werte für die Eingabe serielle Verdünnung, IL-2, CD40L und die LCK -Promotor-Region über die Auswertesoftware von qRT-PCR-Daten.
  2. Definieren Sie eine Standardkurve für die Konzentrationen über die serielle Verdünnung des Eingangs. Berechnen Sie mit diesem standard Kurve die Konzentration für die IL-2, CD40L und die LCK -Promotor-Region für jedes Duplikat von jeder Probe.
  3. Als Nächstes berechnen Sie den Mittelwert der Duplikate. Legen Sie anschließend die IgG Immunopräzipitation Probe als Referenz. Definieren Sie die relative Bereicherung für dieses Beispiel als 1.0 und vergleichen Sie andere Probe (aus der NFAT2-Immunopräzipitation) zu dieser Referenz.
  4. Schließlich berechnen Sie die relative Anreicherung indem man die Konzentration der Proben durch die Konzentration der IgG-Referenz.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt eine vorbildlich Flow-Zytometrie-Analyse eines CLL-Patienten nach der Färbung mit CD19-FITC und CD5-PE Antikörper durchgeführt. Abbildung 1a zeigt die Anspritzung von Lymphozyten, vertritt die Mehrheit der Zellen im Blut von Patienten mit CLL. Abbildung 1 b zeigt den Anteil der CD19+/CD5+ CLL-Zellen, die 89.03 % der Lymphozyten in diesem Beispiel darstellen....

Diskussion

Die entscheidenden Schritte zur Durchführung einer erfolgreichen ChIP Tests sind die Auswahl eines geeigneten Antikörpers und die Optimierung des Chromatins Scheren Prozess25. Die Auswahl der αNFAT2 Antikörper erwies sich als besondere Herausforderung bei der Entwicklung dieses Protokolls. Zwar gibt es mehrere αNFAT2 Antikörper im Handel erhältlich und der Großteil dieser funktioniert gut für das westliche Beflecken und andere Anwendungen, war Klon 7A6 der einzige Antikörper, welcher fü...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der DFG unterstützt MU 3340/1-1 und der Deutschen Krebshilfe gewähren 111134 (beide an M.R.M. vergeben) zu gewähren. Wir danken Elke Malenke für hervorragende technische Unterstützung).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1 X PBSSigma AldrichD8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing AgentThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldehyde p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Sample BufferThermo ScientificB0007
Anti-NFAT2 antibodyAlexis1008505Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibodyCell Signaling8032SClone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP GradeAbcamab2796Clone 7A6
big CentrifugeEppendorf5804RCan be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-humanBD Biosciences555412Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5BD Biosciences555353Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mLeppendorf22431021
FBS superiorMerckS0615
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburCan be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Gel Transfer DeviceThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular sizeThermo ScientificIB23001
iDeal ChIp-seq kit for HistonesDiagenodeC01010059
Ionomycin calcium saltSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mgLI-COR Biosciences925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging SystemLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche4729692001Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 AFA-grade waterCovaris520101
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Magnetic rack, DynaMag-15 MagnetThermo Scientific12301DCan be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100XThermo Scientific11140050
Microscope Axiovert 25Zeiss451200Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mmCovaris520045
Neubauer improved counting chamberKarl Hecht GmbH &            Co KG40442012Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin MonovetteSarstedt02.1064
Nuclease-free waterPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-wellThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicillin/Streptomycin 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L promotor region forwardSigma Aldrich5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forwardSigma Aldrich5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forwardSigma Aldrich5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverseSigma Aldrich5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype ControlCell Signaling# 3900SClone DA1E
Real-time PCR instrumentRocheLightCycler 480Can be substituted with similar instruments
Roller mixersPhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein StandardThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Can be substituted with similar instruments
small CentrifugeThermo ScientificHeraeus Fresco 17Can be substituted with similar instruments
Sodium PyruvateThermo Scientific11360070
ß-MercaptoethanolThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling#12498
Trypan Blue solutionSigma Aldrich93595-50ML

Referenzen

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