JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Batı dünyasında en sık görülen lösemi var. NFAT transkripsiyon faktörleri önemli düzenleyiciler geliştirme ve harekete geçirmek içinde çok sayıda hücre tipleri vardır. Burada, NFAT2, roman hedef genlerin tanımlamak için insan CLL hücrelerinde kromatin immunoprecipitation (ChIP) kullanımı için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Kronik Lenfositik Lösemi (CLL) Malign B hücre klonlar genişlemesi ile karakterize ve Batı ülkelerinde en sık görülen lösemi temsil eder. CLL hastaların çoğu hastalığın bir tembel seyrini yanı sıra bir anergic fenotip onların lösemi hücrelerinin dış uyarmaya yanıt vermeyen bir B hücre reseptörü atıfta göster. Biz son zamanlarda transkripsiyon faktörü NFAT2 anerji CLL içinde çok önemli bir regülatör olduğunu göstermiştir. Farklı hastalıkların bir transkripsiyon faktör rol analizinde büyük bir sorun, belirli hedef genlerin tanımlamasıdır. Aydınlatma meydana mekanizmaları ve potansiyel terapötik müdahaleler için çok önemli bu. Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein-DNA etkileşimleri göstermek için klasik bir tekniktir ve bu nedenle, doğrudan hedef genlerin transkripsiyon faktörlerin memeli hücreleri tanımlamak için kullanılabilir. Burada, çip doğrudan hedef gen NFAT2 insan CLL hücrelerinde, LCK tanımlamak için kullanıldı. DNA ve ilişkili proteinler formaldehit kullanarak çapraz ve daha sonra yaklaşık 200-500 baz çifti (bp) DNA parçaları içine sonication tarafından sheared. NFAT2 ile ilişkili çapraz bağlı DNA parçalarının çoğu o zaman seçime bağlı olarak bir αNFAT2 antikor kullanarak hücre artıkları üzerinden immunoprecipitated. Arıtma sonra ilişkili DNA parçalarının nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) yolu ile tespit edilir. DNA dizileri belirgin zenginleştirme ile genom NFAT2 vivo içindetarafından hedef bölgeleri temsil eder. DNA ve gerekli antikor seçimi uygun kesme için bu yöntemin uygulama başarılı özellikle çok önemli. Bu iletişim kuralı NFAT2 doğrudan etkileşim hedef genleri olan gösteri için idealdir. Büyük ölçekli deneyleri birden fazla transkripsiyon faktörleri bozulmamış canlıda hedef genlerin Analizi çip istihdam için zorluk onun büyük kısıtlamadır.

Giriş

CD19, CD23 ve CD5 ayrı birikimi sergilenmesi olgun B ifade1hücreleri, Batı ülkelerinde erişkinlerde en sık görülen lösemi kronik lenfositik lösemi (CLL) temsil eder. Hastaların çoğunda uzun yıllar özel tedavi gerektiren değil bir tembel hastalığı kursu sergi. Buna ek olarak, bazı hastalarda acil tedavi müdahaleler bağışıklık-kemoterapi veya diğer hedefli tedaviler2,3ile gerektiren hızlı ilerleme göster. Nükleer faktör aktive T hücrelerinin (NFAT) transkripsiyon faktörleri çeşitli gelişim kontrol ve harekete geçirmek oluşum içinde çok sayıda hücre türleri4,5,6bir ailedir. Biz son zamanlarda overexpression ve anayasal NFAT2 CLL hücrelerin aktivasyonu hastaların tembel hastalığı7ile gösterdi. Burada, B hücre reseptörü stimülasyon anerji7adı verilen yanıt vermeyen bir durumuna düzenlemektedir. NFAT2 ve lenfosit özel protein Tirozin kinaz (LCK) organizatörü için bağlar LCK ifade insan hücrelerinde CLL, belirli kromatin immunoprecipitation tahlil düzenleyen göstermek için (ChIP) geliştirilen istihdam ve.

Çip transkripsiyon faktörleri gen ifade8' rolünü araştırmak için çeşitli teknikler biridir. Gen ifadesinin sıkıca çok karmaşık bir şekilde çeşitli düzenleyici kurumlar tarafından bu işlemi9,10,11,12' yeri doldurulamaz bir katılan transkripsiyon faktörleri ile orkestra. Zamansal ve mekansal bağlamda Gen ifadesinin düzenlenmesine transkripsiyon faktörleri çok sayıda türü (Örneğin, kalkınma ve farklılaşma)13,14,15'tespit edilmiştir, 16,17,18. Transkripsiyon faktörleri içeren karmaşık denetimi düzenekleri hataları patolojik süreçler kanser19,20de dahil olmak üzere çeşitli için yol açabilir. Bu nedenle, transkripsiyon faktörleri ve ilgili hedeflerine kimliği roman tedavi caddeleri21,22sunabilir. Bu ilginç alan araştırmak için çeşitli yöntemler çip, elektroforetik hareketlilik üst karakter tahlil (Emsan), çeşitli DNA açılan deneyleri ve muhabir-deneyleri8,11,12, gibi kullanılabilir 23 , 24.

Belirli bir transkripsiyon faktörü genom belirli bölgeleri ile etkileşim içinde vivo çip bir ideal tekniği25olduğunu göstermektir. Bu amaçla, DNA ve ilişkili proteinler canlı hücreler arasında UV ışınlama veya formaldehit (çapraz bağlı çip, XChIP) kullanarak çapraz bağlı. Bu adım daha iyi DNA ve protein kurtarma sözde yerli çip (NChIP)26içinde elde etmek için atlanır. DNA-protein kompleksleri daha sonra yaklaşık 200-500 baz çifti (bp) ve immunoprecipitated ilgi transkripsiyon faktörü karşı spesifik bir antikor kullanarak hücre artıkları üzerinden parçalara sonication tarafından nın yaşadığı. İlişkili DNA parçalarının sonra saf ve PCR, moleküler klonlama ve sıralama ile karakterize. İmmunoprecipitated DNA analiz için microarrays (ChIP-on-Chip) veya yeni nesil sıralama (ChIP-Seq) alternatif tekniklerini kullanın.

Çip Gilmour tarafından tanıtılan ilk ve ne zaman onlar kullanılan UV 1984 Lis ışık kovalent kullandığında DNA ve yaşam bağlı proteinler bakteriler27. Hücre lizis ve bakteriyel RNA polimeraz immunoprecipitation bilinen genlerin belirli probları RNA polimeraz yoğunluğu ve in vivo dağıtım eşlemek için kullanılmıştır. Yöntemi daha sonra aynı müfettişler tarafından ökaryotik RNA polimeraz II Isı şok protein genlerinde Drosophila28tarihinde dağıtım analiz etmek için kullanıldı. XChIP tahlil daha fazla Varshavsky ve histon H4 Derneği Isı şok protein genler29,30ile çalışmaya cross-linking formaldehit ilk kullanan iş arkadaşlarınızla tarafından rafine. Doğal olarak sağlam epitopları yüzünden daha iyi bir DNA ve protein kurtarma avantajı taşıyan NChIP yaklaşım ve bu nedenle, daha fazla antikor özgüllük, ilk açıklanan Hebbes ve 198831meslektaşları tarafından.

Çip DNA-protein etkileşimleri analiz etmek için diğer teknikleri ile karşılaştırıldığında aslında, transkripsiyon faktörü gerçek etkileşim incelenen vivo içinde ve hiçbir sondalar olabilir veya yapay koşullar arabellekleri veya jeller tarafından oluşturulan avantajdır 8,11,12istihdam. ChIP yeni nesil sıralama ile birleştirerek, birden çok hedef aynı anda belirlenebilir.

Bu tekniğin büyük sınırlamalar olduğu gibi organizmalar25büyük ölçekli deneyleri kendi sınırlı uygulanabilirliği vardır. Fark gen ifade desenleri analiz de ilgili proteinler düşük seviyelerde sadece ya da dar zaman pencereleri sırasında gösterilir Eğer çip teknikleri kullanarak zor olabilir. Başka bir potansiyel olarak sınırlayıcı faktör çip11için uygun uygun bir antikor durumu olduğunu.

Burada sunulan çip Protokolü hedef genlerin transkripsiyon faktörü in vivo tanımlanması için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) tarafından istihdam edilecek. Özellikle, yeni hedef genler CLL NFAT2 tanımlamak için hedefi oldu. Çip doğrudan NFAT2 bağlama organizatörü bölgelere farklı hedef genlerin insan CLL hasta hücrelerinde doğal koşullar altında göstermek için potansiyel nedeniyle seçildi.

Protokol

İnsan malzeme ile yapılan tüm deneylerde Tübingen Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmış ve Yazılı onam örnekleri bu çalışma için katkıda bulunan tüm hastalardan elde edildi.

1. izolasyon ve stimülasyon Jurkat hücreleri

Not: iletişim kuralı en iyi duruma getirmek için NFAT2 yüksek düzeyde ifade etmek için bilinen Jurkat hücre satırını kullanın. Tüm adımlar laminar akış başlık altında gerçekleştirilir.

  1. RPMI su banyosu 37 ° C'de ısınma % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş 1640 50 mL hazırlayın.
  2. Jurkat hücre için bir hücre kültür şişesi 37 ° C ve % 5 CO2 RPMI 1640 20 mL'de 1-2 d6 hücre/mL % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin yaklaşık 2 x 10 yoğunluğunun ile takıma Kültür (hücre Trypan ile sayılır mavi boyama ve bir Mikroskop altında Neubauer odası) ve bunları 200 x gde 5 min için centrifuging tarafından hasat.
  3. Bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve RPMI % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin ile 1640 10 mL hücrelerde resuspend. Daha sonra bir geleneksel trypan mavi boyama ve mikroskop altında Neubauer odası içeren hücreleri saymak.
  4. Adım 1.3 200 x g de 5 min için hücrelerden santrifüj kapasitesi ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. Sonra 2 x 107 hücre/mL RPMI pipetting tarafından % 10 FCS ve % 1 penisilin/streptomisin ve transfer yeni bir konvansiyonel 5 mL tüp 1 mL ile takıma 1640 yoğunluğu, hücre resuspend.
  5. Hücreleri 32,4 nM phorbol 12-myristate 13-asetat (PMA) ve 1 µM ionomycin ekleyerek teşvik. 16 h 37 ° C ve % 5 CO2 açıldı tüp kapaklı için hücreleri kuluçkaya (kirlenmesini önlemek için mühürleme film için hava geçirgen kullanılabilir).

2. izolasyon ve birincil CLL hücreleri insan hastalardan uyarılması

Not: Hasta numuneleri alındı ve yukarıda açıklanan7olarak uyarılmış. Tüm adımlar laminar akış başlık altında gerçekleştirilir.

  1. Hastalardan kan ve bir yoğunluk gradient ayrılık gerçekleştirmek için gerekli donanımları hazırlamak: 21-G iğneler, turnike, NH4-heparin-koleksiyon şırınga (örneğin, S-monovettes), 1 x PBS ve yoğunluk gradient orta kan (Yoğunluk 1.077 g/mL) .
  2. İz kan şırınga CLL hastalarda (ca. 40 mL kan hasta başına) çizin. Ardından 50 mL konik tüp kan aktarın. 10 mL PBS şırınga yıkama ve kan-PBS-süspansiyon (kan kan hacmi tüpler sayısını ayarlamak) 50 mL tüpler havuz.
  3. 15 mL taze 50 mL konik tüp yoğunluk gradient ortamda hazırlamak. Daha sonra 35 mL kan-PBS-süspansiyon dikkatle üzerinde yoğunluk gradient orta katman. Bu amaçla, tüp düz bir açıyla tutun ve yavaşça pipette kan-PBS-süspansiyon 50 mL konik tüp alt duvarına karşı. Daha fazla kan-PBS-süspansiyon biriken 50 mL konik Tüp, tüp dik açı kadar açısı artar. Kan-PBS-süspansiyon hacmine göre bu adımı yineleyin.
  4. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) içeren mononükleer hücre faz ayıklamak sonra 20 dk (olmadan fren) için Santrifüjü 560 x g de gerçekleştirmek. Bunu yapmak için 5 mL serolojik pipet ile yoğunluk gradient ayrılması beyaz interfaz topla ve bir yeni 50 mL konik tüp için transfer.
  5. Hücre süspansiyon 50 ml PBS ve 360 x gde 5 dk santrifüj ile doldurun. Süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. 275 x gde 5 min için Santrifüjü ile bu adımı yineleyin. O zaman, PBS 5-10 mL 50 mL konik tüp içinde bir hastada hücrelerinin havuz.
  6. 1. 3'açıklandığı gibi hücreleri saymak.
    Not: Hücreleri doğrudan bu yordam için kullanılabilir veya yapılacak bir B hücre izolasyon izole PBMCs hücrelerde CLL, Örneğin, manyetik hücre (Mac) sıralama yoluyla oranda bağlıdır. B hücre yalıtım önerilir ancak CLL hücre oranı toplam lenfositler (akış sitometresi ile saptanır) % 95'i yüksekse atlanabilir. CLL kan hastalar sabit ve üreticinin yönergelerine göre lysed. O zaman bir CD19-FITC ve CD5-PE antikorlar ile boyama üreticinin yönergelerine göre gerçekleştirilir ve hücreleri akış sitometresi ile analiz edilir. Bir örnek teşkil eden hasta CLL hücre oranı %89.03 olduğu Şekil 1' de gösterilmiştir. Böylece, B hücre izolasyon Bu hastada yapılması gerekiyor. Fizyolojik B hücreleri ihmal edilebilir (%3,72 örnekte) oranıdır.
  7. % 10 FCS, % 1 penisilin/streptomisin, 100 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate ve 50 mM β-mercaptoethanol 200 x g de 5 min için önceden ısıtılmış (37 ° C) RPMI takıma 1640 10 mL hücrelerle yıkama ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.
  8. 2 x 107 hücre/mL RPMI % 10 FCS, % 1 penisilin/streptomisin, 100 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM sodyum pyruvate ve 50 mM β-mercaptoethanol (37 ° C) ve dolgu hücre süspansiyon 1 mL 5 mL tüp içine takıma 1640 hücrelere ayarlayın.
    Not: ß-mercaptoethanol oksidatif stres önlemek için istihdam edilmektedir.
  9. Hücreleri 32,4 nM PMA ve 1 µM ionomycin ekleyerek teşvik. 16 h 37 ° C ve % 5 CO2 açıldı tüp kapaklı için hücreleri kuluçkaya (kirlenmesini önlemek için mühürleme film için hava geçirgen kullanılabilir).
    Not: stres düzeyini azaltmak için hücreleri 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka stimülasyon 16 h önce 1 h için dinlenmiş.

3. fiksasyon, hücre lizis ve Kromatin yamultma

Not: Hasta numuneleri ve Jurkat hücreleri sabit ve7daha önce açıklandığı gibi değişiklikler ile üretici yönergelerine göre piyasada bulunan bir çip seti ile lysed. Fiksasyonun laminar akış başlık altında gerçekleştirilir.

  1. 1 mL % 37 formaldehit, 1.25 M glisin 1 mL ile 1,5 mL Tüp, 4 mL 1 x PBS ile 5 mL tüp ve buz ile bir kutu ile 1,5 mL tüp hücreleri fiksasyonu için hazırlayın.
  2. Hücrelerin uyarılması için adım 1.5 ya da 2.9 ilgili kuluçka zamanında sonra 200 x g 5 min için de 5 mL tüpler spin ve PBS 500 µL 5 mL tüpler hücrelerde resuspend.
  3. 340 µM formaldehit (13.5 µL % 37 formaldehit) hücrelere ekleme. Dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetting tarafından kısa karıştırdıktan sonra 2.5 dk (Jurkat hücreleri) veya oda sıcaklığında 5 dk (hasta örnek) süspansiyon kuluçkaya.
    Not: Uzun süreli fiksasyon zaman primer hücre için en uygun kesme sağlamak gereklidir.
  4. Fiksasyonun durdurmak ve hemen sonra buz ve 4 ° C'de 5 min için 500 x g , santrifüj hücrelerdeyse koymak başka bir 5 dakika süreyle kuluçkaya 125 mM glisin (1.25 M glisin 57 µL) Ekle Süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.
  5. İki kez 200 x g 4 ° C'de 5 min için de buz gibi PBS 1 mL içeren hücreleri yıkama ve süpernatant her zaman aspirasyon tarafından kaldırın.
    Not: fiksasyon sonra protokol duraklatılmış. Sabit hücreleri-80 ° C'de muhafaza edilmelidir Aşağıdaki protokol kullanmak amacıyla antikor epitope fiksasyon ile maskeli değil eğer test için ek örnekler üzerinden SDS-sayfa Jel Elektroforez ve Western blot analizi için kullanılabilir. Bu adımlar protein üreticinin yönergelerine uygun 100 µg ile gerçekleştirilir. Tüm αNFAT2 antikorlar 1: 1000, GAPDH antikor 1:10000 seyreltme, seyreltme kullanılmaktadır. Uygun ve uygun olmayan antikorlar ile Jurkat hücrelerden sabit örnekleri örnek bir görüntü Şekil 2' de gösterilmiştir.
  6. Hücre Pelet yukarı ve aşağı pipetting tarafından ticari olarak mevcut lizis arabellek 1 5 mL resuspend. Sonra bir shaker buz örnekleri yer ve onlara sallayarak süre 10 dakikadır kuluçkaya.
    Not: lizis önce hücreleri için 10 dağıldı s sıvı azot. Bu Jurkat hücreler için yararlıdır ama birincil hasta örnekleri kaçınılmalıdır. Dağılma için 5 mL tüpler için 5 yer s 5-10 ml sıvı azot içinde belirli bir kapsayıcı. Koruyucu gözlük ve uygun Emanet eldiven giymek.
  7. Daha sonra 500 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatlice sökün pipetting tarafından.
  8. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından ticari olarak mevcut lizis arabelleğinin 2 5 mL hücrelerde homojenize ve sallayarak süre 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya. Sonra 500 x g 4 ° C'de 5 min için de tüpler santrifüj kapasitesi ve süpernatant dikkatlice sökün pipetting tarafından.
  9. Hücre Pelet 500 µL (Jurkat hücreleri) resuspend veya yamultma, 140 µL (hasta numuneleri) arabellek içeren 1 proteaz inhibitörü x 1 (5 µL veya 1.4 µL, sırasıyla) ve karışımı 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya.
  10. Kromatin yamultma için 140 µL hücre süspansiyon (hava kabarcıkları ve tekrar bu adım numune hacmi nedeniyle gerekirse üreten önlemek) sonicator tüpler içine adım 3.9 aktarın. Tüpler odaklanmış ultra-sonicator 200-500 bp DNA parçalarının elde etmek için Ortalama bir olay gücü olan 9.375 W 7 ° C ve kayma 10 dk (hücre kültürünü) veya 7.5 dak (hasta numuneleri) bir ısıda yerleştirin.
  11. Son olarak, vasıl 15700 x g küçük santrifüj 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi ve süpernatant yeni 1,5 mL tüp içinde toplamak.
  12. Uygun parça boyutları için test etmek için jel-elektroforez % 1.5 TBE özel jel içinde via yamultulmuş kromatin 20 µL analiz. İyi ve kötü kalite Jurkat hücrelerden yamultulmuş kromatin örnek bir görüntü Şekil 3' te gösterilmiştir. Bu noktada, protokol potansiyel olarak duraklatılmış. Yamultulmuş kromatin-80 ° C'de muhafaza edilmelidir

4. kromatin Immunoprecipitation

Not: Kromatin immunoprecipitation değişiklikler7ile üretici yönergelerine göre piyasada bulunan bir çip seti ile gerçekleştirildi.

  1. İmmunoprecipitations (70 µL (Jurkat hücreleri) veya 15 µL (hasta numuneleri) yamultulmuş kromatin artı bir antikor) sayısını hesaplamak ve protein kaplı A boncuk 1,5 mL tüp yağış başına 20 µL hazırlamak. Yukarı ve aşağı pipetting tarafından boncuk 1 ChIP arabellek yağış 1 x 40 µL yıkayın, boncuk bir manyetik raf için 1 dk içinde dinlenmek ve süpernatant pipetting tarafından kaldırmak izin. Bu adımı, toplam dört kez tamamlayın. Sonunda, 1 x yonga arabelleği 1 ile özgün birimdeki boncuk resuspend.
  2. İmmunoprecipitation kendisi için αNFAT2 antikor (7A6) 10 µg NFAT2 onun ilişkili hedef sıralarıyla yakalamak için kullanın. Bir tavşan IgG antikor (DA1E), 2,5 µg bir IgG denetimi olarak kullanın. Taze 1,5 mL tüpler reaksiyonlar Tablo 1' de belirtildiği şekilde hazırlayın.
    Not: Kimin epitope fiksasyon bu protokol sırasında maskeli değil yüksek benzeşimli monoklonal antikor kullanmak önemlidir. Poliklonal antikorlar ek bir düzeyi önemli ölçüde daha uygun şekilde alınan sonuçları yorumlamak zor hale varyasyon tanıtmak.
  3. 6 rpm'de dönen bir tekerlek basamakta 4.2 gecede 4 ° C'de karışım kuluçkaya.
  4. Ertesi gün spin tüpler için 5 s 7000 x g küçük santrifüj, onları bir manyetik raf için 1 dk içinde kuluçkaya ve süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın. Boncuk her yıkama arabellekleri 1, 2, 3 ve 4 ile bir kez arka arkaya yıkayın.
  5. Bunu yapmak için boncuk yıkama arabellek 350 µL içinde resuspend ve onları 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde 4 ° C'de 5 min için kuluçkaya.
  6. Bundan sonra tüpler 5 için spin küçük santrifüj 7000 x g s. Sonra onları manyetik bir rafa 1 dk. için yer, süpernatant kaldırın ve sonraki yıkama arabellek ekleyin.
  7. Son yıkama adım sonra süpernatant kaldırmak pipetting göre elüsyon arabelleği 1 100 µL boncuk almak ve onları 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
  8. Tüpler kısa bir süre spin (5 küçük santrifüj 7000 x g , s) ve 1 dk. için manyetik bir rafa koyun.
  9. Sonra yeni bir 1,5 mL tüp pipetting tarafından süpernatant transfer ve 4 µL elüsyon arabelleğinin 2 ekleyin.
  10. Giriş denetimi oluşturmak için 1 µL yamultulmuş kromatin elüsyon arabellek 1 ve 4 µL elüsyon arabelleğinin 2 99 µL ile karıştırın (Bu kurulum, hasta başına üç tüpler vardır: bir giriş denetimi, bir IgG-denetim ve bir αNFAT2 örnek).
  11. Örnekleri 4 h 65 ° c ve bir 1,5 mL tüp Shaker 1300 rpm için kuluçkaya. 100 µL % 100 isopropanol, girdap ve spin eklemek örnekleri 5 için küçük santrifüj 7000 x g s.
  12. Kullanılabilir manyetik boncuklar iyice vortexing tarafından resuspend, boncuk 10 µL her örnek için eklemek ve 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  13. Kuluçka sonra tüpler 5 için spin 7000 x g küçük s santrifüj kapasitesi ve manyetik bir rafa 1 dk. için koyun. Süpernatant aspirasyon tarafından kaldırın.
  14. Boncuk yıkama arabellek 1 100 µL içinde resuspend. Mix ve 6 rpm'de dönen bir tekerlek üzerinde oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya tüplere tersine çevirin.
  15. Tüpler 5 için spin küçük santrifüj 7000 x g s için 1dk manyetik bir rafa koyun ve süpernatant pipetting tarafından kaldırın. Yıkama arabelleği 2 ile 4.13-4.14 adımları yineleyin.
  16. Daha sonra yıkama arabellek aspirasyon tarafından kaldırmak, boncuk elüsyon arabellek 55 µL içinde resuspend ve 15 dakika oda sıcaklığında zarlarını DNA elute için 6 rpm'de dönen tekerlek üzerinde kuluçkaya. Son olarak, tüpler 5 için spin küçük santrifüj 7000 x g s için 1dk manyetik bir rafa koyun ve süpernatant yeni 1,5 mL tüpler içine aktarmak.
    Not: Burada protokol potansiyel olarak duraklatılmış. Eluted DNA sonra-20 ° C'de muhafaza edilmelidir

5. NFAT hedef genlerin CLL hücrelerdeki tespiti.

  1. QRT-PCR reaksiyonu her örnek için yinelenen Tablo 2' de gösterildiği gibi yapmak.
    Not: hedef genlerin tespiti için nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ticari olarak mevcut qRT-PCR karışımı ile gerçek zamanlı PCR enstrüman kullanarak yapılır.
  2. Beyaz 96-iyi tepki plakaları tepkiler ve RT-PCR enstrüman için kullanın. Bisiklet koşullarını aşağıdaki gibidir: 30 95 ° C s, [95 ° C 5 s, 30 60 ° C s] x 40 döngüleri.
    Not: Giriş (su katılmamış veya sulandırılmış 1:10, 1: 100 ve 1: 1000 su nükleaz içermeyen) bir seri seyreltme göreli zenginleştirme hesaplamak için kullanılır. Jurkat hücrelerde IL-2 olumlu denetim32kullanıldı. CD40L, NFAT2 B hücreleri, iyi bilinen bir hedef, NFAT2 bir roman hedef gen CLL33,34için örnek olarak CLL hücrelerinde ve LCK pozitif kontrol olarak kullanıldı. CD40L, IL-2 ve LCK organizatörü bölge için astar belirli reaktifler ve ekipman tabloda açıklanmıştır.

6. normalleştirme ve veri analizi

Not: İlgi (IL-2, CD40L veya LCK) göreli zenginleştirme organizatörü bölgeler için normalleştirme için IgG-denetim kullanılarak hesaplanır.

  1. Öncelikle, giriş seri seyreltme, IL-2, CD40L ve LCK organizatörü bölge qRT-PCR verilerden değerlendirme yazılımı aracılığıyla Ct (eşik döngüsü) değerlerini belirleyin.
  2. Konsantrasyonları ile giriş seri seyreltme için standart bir eğri tanımlayın. Bu standart eğri ile konsantrasyon için IL-2, CD40L ve LCK organizatörü bölge her örnek her kopyası için hesaplar.
  3. Daha sonra çoğaltmaları ortalamasını hesaplamak. Sonra IgG immunoprecipitation örnek bir başvuru oluşturun. Bu örnek için göreli zenginleştirme 1.0 tanımlamak ve diğer örnek (NFAT2 immunoprecipitation) Bu başvuru için karşılaştırın.
  4. Son olarak, göreli zenginleştirme örnekleri konsantrasyon IgG başvuru konsantrasyon tarafından bölünmesi ile hesaplayın.

Sonuçlar

Şekil 1 CD19-FITC ve CD5-PE antikorlar ile boyama sonra gerçekleştirilen bir CLL hasta bir örnek Akış Sitometresi Analizi gösterir. Şekil 1a lenfositler, perdeleme CLL hastaların kan hücrelerinde çoğunluğu temsil eden gösterir. Şekil 1b gösterir CD19 oranı+/CD5+ CLL hücreleri, %89.03 Bu örnekte lenfositlerin temsil eder. CD19 oranı+/CD5-...

Tartışmalar

Başarılı bir çip tahlil yapmak kritik uygun bir antikor yelpazesi ve kesme işlemi25kromatin optimizasyonu adımlardır. ΑNFAT2 antikor seçimini bu protokolü geliştirilmesi sırasında özellikle zor olduğu ortaya çıktı. Birkaç αNFAT2 antikorlar piyasada bulunan ve western Blot için bu inşaat para cezası ve diğer uygulamaların çoğunluğu olmakla birlikte, klon 7A6 başarıyla ChIP7için kullanılan tek antikor yapıldı. Hatta sözde aynı 7A6 antikorla...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bu eser DFG tarafından desteklenen MU 3340/1-1 ve Deutsche Krebshilfe vermek 111134 (her ikisi de M.R.M. için layık) verin. Elke Malenke mükemmel teknik destek için teşekkür ediyoruz).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1 X PBSSigma AldrichD8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfortEppendorf5355 000.011Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing AgentThermo ScientificB0009
20X Bolt MES SDS Running BufferThermo ScientificB0002
37 % Formaldehyde p.a., ACSRoth4979.1
4X Bolt LDS Sample BufferThermo ScientificB0007
Anti-NFAT2 antibodyAlexis1008505Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibodyCell Signaling8032SClone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP GradeAbcamab2796Clone 7A6
big CentrifugeEppendorf5804RCan be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-humanBD Biosciences555412Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5BD Biosciences555353Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml)MerckL 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mLeppendorf22431021
FBS superiorMerckS0615
Flow CytometerBD BiosciencesFACSCaliburCan be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Thermo Scientific78440
iBlot 2 Gel Transfer DeviceThermo ScientificIB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular sizeThermo ScientificIB23001
iDeal ChIp-seq kit for HistonesDiagenodeC01010059
Ionomycin calcium saltSigma AldrichI3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mgLI-COR Biosciences926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mgLI-COR Biosciences925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging SystemLI-COR BiosciencesB446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, whiteRoche4729692001Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse BBeckman CoulterIM1400
M220 AFA-grade waterCovaris520101
M220 Focused-ultrasonicatorCovaris500295
Magnetic rack, DynaMag-15 MagnetThermo Scientific12301DCan be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100XThermo Scientific11140050
Microscope Axiovert 25Zeiss451200Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mmCovaris520045
Neubauer improved counting chamberKarl Hecht GmbH &            Co KG40442012Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin MonovetteSarstedt02.1064
Nuclease-free waterPromegaP1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-wellThermo ScientificNP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mLLI-COR Biosciences927-50000
Penicillin/Streptomycin 100XMerckA2213
PerfeCTa SYBR Green FastMixQuanta Bio95072-012
PMASigma AldrichP1585
Primer CD40L promotor region forwardSigma Aldrich5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forwardSigma Aldrich5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverseSigma Aldrich5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forwardSigma Aldrich5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverseSigma Aldrich5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype ControlCell Signaling# 3900SClone DA1E
Real-time PCR instrumentRocheLightCycler 480Can be substituted with similar instruments
Roller mixersPhoenix InstrumentRS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870010
Safety-Multifly-needle 21GSarstedt851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein StandardThermo ScientificLC5925
Shaker Duomax 1030Heidolph Instruments543-32205-00Can be substituted with similar instruments
small CentrifugeThermo ScientificHeraeus Fresco 17Can be substituted with similar instruments
Sodium PyruvateThermo Scientific11360070
ß-MercaptoethanolThermo Scientific21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X)Cell Signaling#12498
Trypan Blue solutionSigma Aldrich93595-50ML

Referanslar

  1. Byrd, J. C., Jones, J. J., Woyach, J. A., Johnson, A. J., Flynn, J. M. Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician. Journal of Clinical Oncology. 32 (27), 3039-3047 (2014).
  2. Woyach, J. A. Survival of the weak (signalers): anergy in CLL. Blood. 121 (19), 3781-3783 (2013).
  3. Hallek, M., et al. Guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment and supportive management of chronic lymphocytic. Blood. , (2018).
  4. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes and Development. 17 (18), 2205-2232 (2003).
  5. Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nature Reviews Immunology. 5 (6), 472-484 (2005).
  6. Muller, M. R., Rao, A. NFAT, immunity and cancer: a transcription factor comes of age. Nature Reviews Immunology. 10 (9), 645-656 (2010).
  7. Marklin, M., et al. NFAT2 is a critical regulator of the anergic phenotype in chronic lymphocytic leukaemia. Nature Communications. 8 (1), 755 (2017).
  8. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
  9. Slattery, M., et al. Absence of a simple code: how transcription factors read the genome. Trends in Biochemical Sciences. 39 (9), 381-399 (2014).
  10. Cumbo, F., Vergni, D., Santoni, D. Investigating transcription factor synergism in humans. DNA Research. , (2017).
  11. Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin Immunoprecipitation Assay as a Tool for Analyzing Transcription Factor Activity. Methods in molecular biology. 809, 85-104 (2012).
  12. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  13. Flores, E., Picossi, S., Valladares, A., Herrero, A. Transcriptional regulation of development in heterocyst-forming cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta. , (2018).
  14. Callens, C., Tucker, M. R., Zhang, D., Wilson, Z. A. Dissecting the role of MADS-box genes in monocot floral development and diversity. Journal of Experimental Botany. 69 (10), 2435-2459 (2018).
  15. Shen, Q., Toulabi, L. B., Shi, H., Nicklow, E. E., Liu, J. The forkhead transcription factor UNC-130/FOXD integrates both BMP and Notch signaling to regulate dorsoventral patterning of the C. elegans postembryonic mesoderm. Developmental Biology. 433 (1), 75-83 (2018).
  16. Tang, X., Zhao, Y., Buchon, N., Engstrom, Y. The POU/Oct Transcription Factor Nubbin Controls the Balance of Intestinal Stem Cell Maintenance and Differentiation by Isoform-Specific Regulation. Stem Cell Reports. , (2018).
  17. Bertacchi, M., Parisot, J., Studer, M. The pleiotropic transcriptional regulator coup-tfi plays multiple roles in neural development and disease. Brain Research. , (2018).
  18. Aronson, B. E., Stapleton, K. A., Krasinski, S. D. Role of GATA factors in development, differentiation, and homeostasis of the small intestinal epithelium. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 306 (6), G474-G490 (2014).
  19. Fernandez, L. P., Lopez-Marquez, A., Santisteban, P. Thyroid transcription factors in development, differentiation and disease. Nature Reviews: Endocrinology. 11 (1), 29-42 (2015).
  20. Jiang, S., et al. Novel role of Forkhead box O 4 transcription factor in cancer: bringing out the good or the bad. Seminars in Cancer Biology. , (2018).
  21. Daniel, P. M., et al. PI3K Activation in Neural Stem Cells Drives Tumorigenesis which can be Ameliorated by Targeting the cAMP Response Element Binding (CREB) Protein. Neuro-Oncology. , (2018).
  22. Chen, W. T., Chen, Y. K., Lin, S. S., Hsu, F. T. Hyperforin Suppresses Tumor Growth and NF-kappaB-mediated Anti-apoptotic and Invasive Potential of Non-small Cell Lung Cancer. Anticancer Research. 38 (4), 2161-2167 (2018).
  23. Ausubel, F. M. . Current protocols in molecular biology. , (1994).
  24. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Research. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  25. Fujita, T., Fujii, H. Biochemical Analysis of Genome Functions Using Locus-Specific Chromatin Immunoprecipitation Technologies. Gene Regulation and Systems Biology. 10 (Suppl 1), 1-9 (2016).
  26. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  27. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  28. Gilmour, D. S., Lis, J. T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Molecular and Cellular Biology. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  29. Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
  30. Varshavsky, A. Discovery of cellular regulation by protein degradation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34469-34489 (2008).
  31. Hebbes, T. R., Thorne, A. W., Crane-Robinson, C. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin. EMBO Journal. 7 (5), 1395-1402 (1988).
  32. Decker, E. L., Skerka, C., Zipfel, P. F. The early growth response protein (EGR-1) regulates interleukin-2 transcription by synergistic interaction with the nuclear factor of activated T cells. Journal of Biological Chemistry. 273 (41), 26923-26930 (1998).
  33. Grammer, A. C., et al. The CD40 ligand expressed by human B cells costimulates B cell responses. Journal of Immunology. 154 (10), 4996-5010 (1995).
  34. Pham, L. V., Tamayo, A. T., Yoshimura, L. C., Lin-Lee, Y. C., Ford, R. J. Constitutive NF-kappaB and NFAT activation in aggressive B-cell lymphomas synergistically activates the CD154 gene and maintains lymphoma cell survival. Blood. 106 (12), 3940-3947 (2005).
  35. Zhou, Z. H., et al. The acid-sensing ion channel, ASIC2, promotes invasion and metastasis of colorectal cancer under acidosis by activating the calcineurin/NFAT1 axis. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 36 (1), 130 (2017).
  36. Estrada-Aviles, R., Rodriguez, G., Zarain-Herzberg, A. The cardiac calsequestrin gene transcription is modulated at the promoter by NFAT and MEF-2 transcription factors. PloS One. 12 (9), e0184724 (2017).
  37. Kadziolka, B., Lesniak, W., Filipek, A. Regulation of CacyBP/SIP expression by NFAT1 transcription factor. Immunobiology. 222 (8-9), 872-877 (2017).
  38. Lieb, J. D., Liu, X., Botstein, D., Brown, P. O. Promoter-specific binding of Rap1 revealed by genome-wide maps of protein-DNA association. Nature Genetics. 28 (4), 327-334 (2001).
  39. Ren, B., et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).
  40. Iyer, V. R., et al. Genomic binding sites of the yeast cell-cycle transcription factors SBF and MBF. Nature. 409 (6819), 533-538 (2001).
  41. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  42. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  43. Schmid, C. D., Bucher, P. ChIP-Seq data reveal nucleosome architecture of human promoters. Cell. 131 (5), 831-832 (2007).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser Ara t rmalarsay 142CLLNFATtranskripsiyon fakt rhedef genorganizat rkromatin immunoprecipitation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır