تلطيخ مطاطي على الشرائح جزءا لا يتجزأ من البارافين من أنسجة سرطان المعدة pT3N0M0

Summary

هنا، نقدم بروتوكول تلطيخ مرنة لتحديد الألياف المرنة في أنسجة سرطان المعدة pT3N0M0 على أقسام رسمية ثابتة، البارافين جزءا لا يتجزأ. في وقت لاحق، ونحن نصف طريقة لتحديد ما إذا كانت الخلايا السرطانية تغزو وراء لامينا مرنة.

Abstract

اللامينا المرنة، التي تقع عادة في طبقة شبه mesothelial، المتاخمة للخلايا الوسطى العبية، هو amphiphilic على الهيماتوإكسلين وeosin (H & E) تلطيخ ولكن يمكن تصورها من خلال تلطيخ مرنة. واحدة من الفوائد الهامة للتلطيخ المرن هو أنه يجعل من السهل تحديد ما إذا كانت الخلايا السرطانية قد غزت وراء لامينا مرنة. وهذا يساعد في دراسة مدى الغزو السطحي البريكوني، وبالتالي التمييز بين مراحل pT3 و pT4 في سرطان الجهاز الهضمي. في هذه الدراسة، نقدم بروتوكول لتحديد الألياف المرنة في أقسام الأنسجة السرطانية المعدية المثبتة رسميا، البارافين جزءا لا يتجزأ من pT3N0M0. نحن إعداد أقسام البارافين 5-μm ثابتة على الشرائح، ومن ثم يتم إزالة جميع الشرائح وإعادة ترطيبها أثناء إجراء تلطيخ. في وقت لاحق، يتم أكسدة جميع الأقسام من قبل برمنغنات البوتاسيوم، مبيض بحمض الأكساليك، ملطخة بتلطيخ مرن، وملطخة من قبل فان غيسون. وأخيرا، فإننا ندرس تأثير تلطيخ؛ لامينا مرنة ملطخة الأزرق والأسود وألياف الكولاجين ملطخة الأحمر، في حين أن الخلايا السرطانية ملطخة في ظلال متفاوتة من الأصفر. كما أننا نصف بالتفصيل الأساليب المستخدمة لتحديد العلاقة الموضعية بين الخلايا السرطانية واللامينا المرنة. هذه الطريقة بسيطة، منخفضة التكلفة، وقابلة للتطبيق على نطاق واسع في تحديد غزو سطح البريكوني في سرطان الجهاز الهضمي بسبب انتقائيته المعلقة للألياف المرنة والنتائج الحقيقية.

Introduction

وفقا للورم، عقدة، وورم (TNM) نظام تنظيم السرطان، وتشخيص سرطان المعدة في المرحلة المرضية pT4 هو أسوأ بكثير من ذلك في pT3 (UICC 8/ AJCC)¹. مع سرطان المعدة ، عادة ما يعتمد تصنيف الورم الأولي (pT) على عمق غزو الورم². يتم تعريف سرطان المعدة pT3 المرحلة المرضية على أنه سرطان يغزو من خلال بروبريا العضلات في الأنسجة تحت الجلد، في حين يتم تعريف سرطان المعدة pT4 كسرطان اختراق إلى سطح البريطونالحشوي. وجود الغازية السطحية البريكونية هو المفتاح للتمييزبين المرحلتين 2. ومع ذلك، لأن طبقة الخلايا الوسطى العبية هي رقيقة جدا، يمكن أن تتلف خلال الجراحة، والعلاج بعد الجراحة، وتثبيت³. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات الالتهابية المرتبطة بالورم والتليف إلى تلف التشريح الطبيعي للحيط، مما يجعل من الصعب جداً الحكم بدقة على غزو سطح البريطون باستخدام H&E تلطيخ^{فقط 4}. طرق التشخيص المساعدة الحالية مثل علم الخلايا والكيمياء المناعية هي ذات قيمة تشخيصية محدودة^5،6 لأنها إيجابية كاذبة أو لديها فعالية منخفضة من حيث التكلفة.

الغشاء المصلي يشمل البريتوم، الجنبة، والتاميرة، ويتكون من الميسوثيوم، غشاء الطابق السفلي، وطبقة شبهميثيرية 7. إحدى السمات النسيجية الشائعة للغشاء المصلي هي وجود لامينا مرنة في الطبقة شبه الوسطى، بجوار الخلايا الوسطى^8،9. لامينا مرنة لديها قدرة قوية مضادة للضرر ويمكن أن تكون بمثابة علامة التكهن البديل إذا تم تدمير الخلايا الوسطى من قبل التهاب شديد ذات الصلة بالورم أو التليف³. لامينا مرنة تتألف أساسا من الإيلاستين وميكروفيبريل¹⁰، والتي يمكن تصورها عن طريق تلطيخ مرنة. السبب الرئيسي وراء استخدام تلطيخ مرنة هو أن الإيلاستين يشكل رابطة الهيدروجين مع مجموعة الفينول من ريسورسينول في محلول الإيلاستين، مما تسبب في الألياف المرنة لتكون ملطخة الأزرق والأسود. بعد فان غيسون (VG) تلطيخ المتناقضة، ألياف الكولاجين يمكن أن تكون ملطخة الأحمروألياف العضلات وخلايا الدم الحمراء يمكن أن تكون ملطخة الأصفر 8،^11،12،13.

الطبعة الثامنة من تنظيم TNM من سرطان الرئة يعرف الغزو الجنبي الحشوي (T2) بأنه غزو الورم وراء لامينا مرنة أو غزو على سطح الجنبة الحشوية². وقد أظهرت الدراسات على سرطان القولون والمستقيم أن غزو لامينا مرنة في سرطان القولون والمستقيم pT3 قد يكون السبب في ضعف التنبؤات. كما ثبت أن معدل البقاء على قيد الحياة الشامل لسرطان القولون والمستقيم لمدة 5 سنوات والعام يشبه pT4a^13و14و15. استنادا إلى دراساتنا السابقة على تلطيخ مرنة، وقد وجد غزو لامينا مرنة أن يكون لها تأثير سلبي كبير على التكهن بسرطان المعدة pT3 وينبغي أن تعامل بنفس الطريقة التي pT4a سرطان المعدة^12. وبالتالي، فإن هذه الطريقة البسيطة والفعالة من حيث التكلفة يمكن أن تساعد في القضاء على عدم اليقين في النتائج التي تم الحصول عليها من خلال تلطيخ H&E، وغيرها من القيود الشائعة المرتبطة بطرق التشخيص المساعدة الأخرى، بما في ذلك علم الخلايا والكيمياء المناعية، من بين الاخرين. يمكن استخدام هذه الطريقة بكفاءة لتشخيص غزوات سطح البريكوني لسرطان الجهاز الهضمي، وخاصة في بعض الحالات الغامضة. انها مريحة منذ H & E وصمة عار وغيرها من البقع عادة ما تجعل من الصعب تحديد مثل هذه الغزوات. كما تضمن هذه الطريقة موثوقية النتائج لأنها انتقائية للغاية، لا سيما للألياف المرنة. هنا، نقوم بإجراء تلطيخ مرن لتحديد ما إذا كانت الخلايا السرطانية قد غزت لامينا مرنة في سرطان المعدة pT3N0M0^12.

يتم استخدام هذه الطريقة لتحديد الألياف المرنة في الأنسجة على المواد الرسمية الثابتة، والبارافين جزءا لا يتجزأ، ويمكن استخدامها للأقسام المجمدة كذلك. هنا، نختار أقسام جزءا لا يتجزأ من البارافين للحصول على أفضل صيانة للمورفولوجيا الخلوية والأنسجة. جميع الخطوات في هذا البروتوكول تجري في درجة حرارة الغرفة. يتم استخدام مجموعة تلطيخ التجارية التي تشمل محلول برمنغنات البوتاسيوم، حل حمض الأكساليك، محلول الإيلاستين، ومحلول فان غيسون في الدراسة المقدمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

بين عامي 1994 و 2005، تم اختيار عينات المرضى من قبل اثنين من أخصائيي أمراض الجهاز الهضمي من ذوي الخبرة في مستشفى السرطان التابعة لمدرسة شيانغيا للطب، جامعة الجنوب الوسطى، من المرضى الذين عانوا من استئصال المعدة، مع التشخيص المرضي بعد الجراحة لسرطان المعدة في مرحلة pT3N0M0 (وفقا للمرحلة TNM السابع). وقد وافقت لجنة استعراض الأخلاقيات على هذه الدراسة.

1 - تقسيم الأقسام

1. ضع كتلة البارافين في حامل ثابت للميكروتومي الزلاجة، والتي يمكن أن تتحرك إلى الوراء وإلى الأمام عبر النصل. ضبط الزاوية المثلى بين كتلة وسكين microtome.
   ملاحظة: الزاوية المثلى لا تعتمد فقط على هندسة النصل ولكن أيضا على سرعة القطع وتقنية.
2. تقليم كتلة البارافين حسب الضرورة وقطعها إلى 5-ميكرومتر سميكة المقاطع العرضية.
3. ضع أقسام البارافين 5-ميكرومتر في حمام مائي عند حوالي 40 - 45 درجة مئوية وحمّله، بعد ذلك، من الماء على الشريحة الزجاجية، قسم واحد لكل شريحة.
4. اضغط على القسم المثبت بعناية ضد منشفة ورقية لإزالة أي المياه المتبقية وفقاعات الهواء المحتملة.
5. السماح للأقسام لتجفيف الهواء لمدة 30 دقيقة ثم خبز لهم في فرن في 45 - 50 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

2. إزالة البارافين والإماهة من جميع الشرائح

1. تزج الشرائح في الزيلين في جرة كوبلين لمدة 10 دقائق.
2. أخرج الشرائح من جرة الزيلين الأولى واغمرها في الزيلين في جرة أخرى لمدة 10 دقائق.
3. الآن، تزج الشرائح في الإيثانول 100٪ في جرة كوبلين لمدة 5 دقائق.
4. تزج الشرائح في الإيثانول 100٪ في جرة كوبلين أخرى، وأيضا لمدة 5 دقائق.
5. تزج الشرائح في الإيثانول 95٪ في جرة كوبلين لمدة 2 دقيقة.
6. تزج الشرائح في الإيثانول 70٪ في جرة كوبلين لمدة 2 دقيقة.
   ملاحظة: تأكد من أن الشرائح مغمورة تماماً في الحلول أثناء تنفيذ الخطوات المذكورة أعلاه.
7. شطف الشرائح لفترة وجيزة مع الماء المقطر في جرة جديدة.

3. تلطيخ

1. قبل الشروع في تلطيخ، مسح أي حلول زائدة حول الأنسجة على الشريحة مع ورقة الأنسجة.
2. ضع الشرائح في غرفة الحرارة وظروف رطوبة الغرفة لتجنب تجفيف الأنسجة على الشريحة طوال عملية تلطيخ كامل.
3. أكسدة الشرائح مع بضع قطرات من برمنغنات البوتاسيوم لمدة 5 دقائق.
4. شطف الشرائح المؤكسدة بالماء المقطر في جرة كوبلين مع 2 - 3 التغييرات. مراقبة اللون الأزرق للأنسجة.
5. الآن، تبييض هذه الشرائح عن طريق إضافة بضع قطرات من حمض الأكساليك لمدة 5 دقائق.
6. شطف الشرائح عن طريق غمر لهم في جرة كوبلين مليئة بالماء المقطر. أداء شطف 2X - 3X.
7. الآن، غسل هذه الشرائح لفترة وجيزة في الكحول 95٪، ومن ثم تزج الشرائح في محلول الإيلاستين (5 غرام / لتر) لمدة 8 - 24 ساعة.
   ملاحظة: حل الإيلاستين متقلبة، ووقته تلطيخ طويل نسبيا، لذلك فمن الأفضل لتزج الشرائح مع تلطيخ مرنة في حاوية مختومة، مثل زجاجة شفافة مع غطاء الختم. تعتمد سعة الحاوية وحجم حل الإيلاستين على عدد الشرائح المنغمسة، طالما أنها تمكن من الغمر الكامل لجميع الشرائح.
8. تزج هذه الشرائح مباشرة في الإيثانول 95٪ لمدة 1 - 2 دقيقة للتمييز بين كل قسم الأنسجة بشكل جيد.
   ملاحظة: التمايز يشير إلى التغيير في تهمة قسم الأنسجة، الذي يزيل تلطيخ الزائدة التي تمتصها الأنسجة ويجعل الألوان أكثر وضوحا. بعد تلطيخ محلول الإيلاستين، لا ينبغي غسل العينات بالماء المقطر لتجنب أي صعوبة في التمايز. تحقق مجهريًا، حسب الضرورة، للحصول على الألياف المرنة الزرقاء والسوداء والخلفية الرمادية. فمن الأفضل أن تنقص قليلا من الأنسجة منذ وصمة عار فان غيسون اللاحقة يمكن أيضا استخراج إلى حد ما وصمة عار مرنة.
9. شطف هذه الشرائح تماما بالماء المقطر بعد التمايز.
10. مضاد وصمة عار الشرائح في حل فان غيسون لمدة دقيقة واحدة.
    ملاحظة: حجم حل فان غيسون يجب أن يكون كافيا لتكون قادرة على تزج قسم الأنسجة على كل شريحة تماما.
11. إسقاط بسرعة 95٪ الإيثانول على هذه الشرائح لبضع ثوان للتمييز بين كل قسم الأنسجة بشكل جيد.
    ملاحظة: لا تشطف الشرائح بأي ماء بعد تلطيخ فان غيسون، لأن ذلك يمكن أن يضعف أو حتى ينزع لون مضاد التلطيخ في فان غيسون.

4. الجفاف والتركيب

1. تزج الشرائح في الكحول 95٪ لمدة 5 دقائق للسماح لهم بالجفاف بسرعة.
2. الاستمرار في تجفيف هذه الشرائح من قبل 2 التغييرات من الكحول 100٪، في كل مرة غمر الشرائح لمدة 5 دقائق.
3. تزج الشرائح في 2 التغييرات من الزيلين، في كل مرة لمدة 3 دقائق.
4. إضافة قطرة واحدة من المتوسط تصاعد الراتنج إلى الشريحة ووضع غطاء على الجزء العلوي.

5. المراقبة المجهرية للشرائح

1. العثور على الاتجاه المصلي ومراقبة نتائج تلطيخ مرنة: الألياف المرنة (lamina) ملطخة الأزرق والأسود، وألياف الكولاجين هي الأحمر الملون، وألياف العضلات هي الأصفر الملون.
2. ابحث عن الخلايا السرطانية في الشريحة بأكملها: الخلايا السرطانية ملطخة باللون الأصفر¹².
3. تحديد العلاقة الموضعية بين الخلايا السرطانية واللامينا المرنة.
   ملاحظة: سيكون هناك حالتين هنا. طالما أن هناك خلية ورم واحدة التي غزت وراء لامينا مرنة في الشريحة بأكملها، ثم يمكن اعتبار هذه الحالة كغزو لامينا مرنة. من ناحية أخرى، فقط عندما لا يكون هناك خلية الورم التي غزت وراء لامينا مرنة في الشريحة بأكملها، يمكن اعتبار هذه الحالة كما لامينا مرنة عدم الغزو.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تلطيخ مرن ناجح يكشف بوضوح لامينا مرنة والخلايا السرطانية في سرطان المعدة pT3. الشكل 1 - حقل الطاقة المنخفضة، فحص مجهري بعد تلطيخ محلول الإيلاستين، قبل وصمة عار فان غيسون وفقا للبروتوكول المذكور - يظهر لامينا مرنة قريبة من الخلايا المصلية المصلية وملطخة الأ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

توفر هذه الطريقة المقترحة هنا نهجاً دقيقاً لتحديد لامينا مطاطية تحت الجلد. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم ما إذا كانت الخلايا السرطانية قد غزت لامينا مرنة في سرطان المعدة pT3N0M0¹². لامينا مرنة هو المحمر في H & E-الملون المقاطع، والتي لا يمكن تمييزها بسهولة من ألياف الكولاجين، وغ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585