Tinción elástica en diapositivas incrustadas en parafina de tejido de cáncer gástrico pT3N0M0

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo de tinción elástica para identificar fibras elásticas en los tejidos de cáncer gástrico pT3N0M0 en secciones fijas de formalina, incrustadas en parafina. Posteriormente, describimos un método para determinar si las células tumorales invaden más allá de la lámina elástica.

Resumen

La lámina elástica, que generalmente se encuentra en la capa submesotelial, adyacente a las células mesoteliales del peritoneo, es anfifílica sobre la hematoxilina y la tinción de eosina (H&E), pero se puede visualizar a través de la tinción elástica. Uno de los beneficios importantes de la tinción elástica es que facilita la determinación de si las células tumorales han invadido más allá de la lámina elástica. Esto ayuda a examinar el alcance de la invasión de la superficie peritoneal, distinguiendo así las etapas pT3 y pT4 en el cáncer gastrointestinal. En este estudio, presentamos un protocolo para identificar fibras elásticas en las secciones de tejido de cáncer gástrico pT3N0M0 fijados por formalina, incrustados en parafina. Preparamos secciones de parafina de 5 m fijadas en los portaobjetos, y luego todas las diapositivas se desparanyan y se rehidratan durante el procedimiento de tinción. Posteriormente, todas las secciones son oxidadas por permanganato de potasio, blanqueados por ácido oxálico, manchados por manchas elásticas y contrarrestados por Van Gieson. Por último, examinamos el efecto de la tinción; la lámina elástica se tiñe de color azul-negro y las fibras de colágeno se tiñen de rojo, mientras que las células cancerosas se tiñen en diferentes tonos de amarillo. También describimos en detalle los métodos utilizados para determinar la relación posicional entre las células cancerosas y la lámina elástica. Este método es simple, de bajo costo, y ampliamente aplicable en la identificación de la invasión superficial peritoneal en el cáncer gastrointestinal debido a su excepcional selectividad para fibras elásticas y resultados auténticos.

Introducción

Según el sistema de estadificación del cáncer de tumor, nodo y metástasis (TNM), el pronóstico del cáncer gástrico en la etapa patológica pT4 es significativamente peor que el de pT3 (8o UICC/AJCC)¹. Con el cáncer gástrico, la clasificación del tumor primario (pT) generalmente depende de la profundidad de la invasión tumoral². El cáncer gástrico pT3 en estadio patológico se define como el cáncer invadiendo a través de la musculación propria en los tejidos subserosales, mientras que el cáncer gástrico pT4 se define como cáncer que penetra en la superficie del peritoneo visceral. La presencia de la invasividad de la superficie peritoneal es la clave para distinguir las dos etapas^2. Sin embargo, debido a que la capa de células mesoteliales peritoneales esmuy delgada, podría dañarse durante la cirugía, el tratamiento postoperatorio y la fijación 3. Además, los cambios inflamatorios relacionados con tumores y la fibrosis pueden dañar la anatomía normal del peritoneo, lo que hace que sea muy difícil juzgar con precisión la invasión de la superficie peritoneal usando sólo la tinción H&E⁴. Los métodos actuales de diagnóstico auxiliar, como la citologíay la inmunohistoquímica, son de valor diagnóstico limitado 5,⁶ porque son falsos positivos o tienen una baja rentabilidad.

La membrana serosal incluye el peritoneo, la pleura y el pericardio, y se compone del mesotelio, una membrana del sótano y una capa submesotelial^7. Una característica histológica común de la membrana serosal es la presencia de una lámina elástica en la capasubmesotelial, adyacente a las células mesoteliales 8,^9. La lamina elástica tiene una fuerte capacidad antirticida y puede servir como un marcador de pronóstico alternativo si las células mesoteliales son destruidas por inflamación grave relacionada con tumores o fibrosis³. La lámina elástica se compone principalmente de elastina y microfibril^10,que se puede visualizar mediante tinción elástica. La razón principal detrás del uso de la tinción elástica es que la elastina forma un enlace de hidrógeno con el grupo fenólico de resorcinol en la solución de elastina, haciendo que las fibras elásticas se tiñen de azul-negro. Después de van Gieson (VG) manchas contrastantes, las fibras de colágeno se pueden teñir de rojo y las fibras musculares y los glóbulos rojos se pueden teñir de amarillo^8,11,12,13.

La octava edición de la estadificación TNM del cáncer de pulmón define la invasión pleural visceral (T2)como una invasión tumoral más allá de la lámina elástica o una invasión en la superficie de la pleura visceral 2. Los estudios sobre el cáncer colorrectal han demostrado que la invasión de la lámina elástica en el cáncer colorrectal pT3 puede ser la razón de los malos pronósticos. También se ha demostrado que la tasa de supervivencia global de 5 años libre de enfermedades y de supervivencia global del cáncer colorrectal es como pT4a^13,14,15. Según nuestros estudios previos sobre tinción elástica, se ha encontrado que la invasión de lamina elástica tiene una influencia negativa significativa en el pronóstico del cáncer gástrico pT3 y debe tratarse de la misma manera que el cáncer gástrico pT4a¹². Por lo tanto, este método simple y rentable puede ayudar a eliminar la incertidumbre en los resultados obtenidos a través de la tinción de H&E, y otras limitaciones comunes asociadas con otros métodos de diagnóstico auxiliar, incluyendo citología e inmunohistoquímica, entre Otros. Este método se puede utilizar eficientemente para diagnosticar invasiones superficiales peritoneales de cáncer gastrointestinal, especialmente en algunos casos ambiguos. Es conveniente ya que la mancha de H&E y otras manchas generalmente hacen que sea difícil identificar tales invasiones. Este método también garantiza una fiabilidad de los resultados ya que es muy selectivo, especialmente a las fibras elásticas. Aquí, llevamos a cabo la tinción elástica para determinar si las células tumorales han invadido la lámina elástica en el cáncer gástrico pT3N0M0¹².

Este método se utiliza para identificar fibras elásticas en tejidos en secciones fijas en formalina, incrustadas en parafina, y también se puede utilizar para secciones congeladas. Aquí, elegimos secciones incrustadas en parafina para el mejor mantenimiento de la morfología celular y tisular. Todos los pasos de este protocolo tienen lugar a temperatura ambiente. En el estudio presentado se utiliza un kit de tinción comercial que incluye una solución de permanganato de potasio, una solución de ácido oxálico, una solución de elastina y la solución de Van Gieson.

Protocolo

Entre 1994 y 2005, dos patólogos gastrointestinales experimentados en el Hospital Oncológico Afiliado de la Escuela de Medicina Xiangya de la Universidad Central del Sur, de pacientes que sufrieron gastrectomía de neoplasias estomacales, con un diagnóstico patológico postoperatorio de cáncer gástrico en la etapa pT3N0M0 (según la séptima escenificación de TNM). Este estudio fue aprobado por el comité de revisión ética.

1. Seccionamiento

1. Coloque el bloque de parafina en un soporte fijo del microtomo de trineo, que puede moverse hacia atrás y hacia adelante a través de la hoja. Ajuste el ángulo óptimo entre el bloque y el cuchillo microtome.
   NOTA: El ángulo óptimo no sólo depende de la geometría de la hoja, sino también de la velocidad de corte y la técnica.
2. Recorte el bloque de parafina según sea necesario y córtelo en secciones transversales de 5 m de espesor.
3. Colocar las secciones de 5-m en un baño de agua a unos 40 - 45 oC y montarlo, posteriormente, desde el agua hasta el portaobjetos de vidrio, una sección por diapositiva.
4. Presione la sección montada cuidadosamente contra una toalla de papel para eliminar cualquier agua residual y posibles burbujas de aire.
5. Dejar secar al aire las secciones durante 30 minutos y luego hornearlas en un horno a 45 - 50 oC durante 2 h.

2. Desparafinación y rehidratación de todas las diapositivas

1. Sumerja las diapositivas en xileno en un frasco de Coplin durante 10 min.
2. Saca las diapositivas del primer frasco de xileno y sumérgelas en xileno en otro frasco durante 10 min.
3. Ahora, sumerja las diapositivas en etanol 100% en un frasco de Coplin durante 5 min.
4. Sumerja las diapositivas en etanol 100% en otro frasco de Coplin, también durante 5 min.
5. Sumerja las diapositivas en etanol al 95% en un frasco de Coplin durante 2 min.
6. Sumerja las diapositivas en 70% de etanol en un frasco de Coplin durante 2 min.
   NOTA: Asegúrese de que las diapositivas estén completamente inmersas en las soluciones mientras realiza los pasos anteriores.
7. Enjuague los portaobjetos brevemente con agua destilada en un frasco nuevo.

3. Tinción

1. Antes de proceder a la tinción, limpie cualquier exceso de soluciones alrededor del tejido en la diapositiva con un papel tisular.
2. Coloque los portaobjetos en las condiciones de temperatura y humedad ambiente para evitar el secado del tejido en el portaobjetos durante todo el proceso de tinción.
3. Oxida relincar los portaobjetos con unas gotas de permanganato de potasio durante 5 min. Asegúrese de que el volumen de permanganato de potasio sea suficiente para cubrir la sección de tejido en cada diapositiva.
4. Enjuague los portaobjetos oxidados con agua destilada en un frasco de Coplin con 2 - 3 cambios. Observe el color azul del tejido.
5. Ahora, blanquear estas diapositivas mediante la adición de unas gotas de ácido oxálico durante 5 min. Asegúrese de que el volumen de ácido oxálico es suficiente para cubrir completamente la sección de tejido en cada diapositiva.
6. Enjuague los portaobjetos sumergiéndolas en el frasco de Coplin lleno de agua destilada. Realice el enjuague 2x - 3x.
7. Ahora, lave estos portaobjetos brevemente en un 95% de alcohol y luego sumerja los portaobjetos en una solución de elastina (5 g/L) durante 8 - 24 h.
   NOTA: La solución de elastina es volátil, y su tiempo de tinción es relativamente largo, por lo que es mejor sumergir las diapositivas con tinción elástica en un recipiente sellado, como una botella de vidrio transparente con una tapa de sellado. La capacidad del contenedor y el volumen de la solución de elastina depende del número de diapositivas sumergidas, siempre que permita la inmersión completa de todas las diapositivas.
8. Sumerja estas diapositivas directamente en etanol 95% durante 1 - 2 min para diferenciar bien cada sección tisular.
   NOTA: La diferenciación se refiere al cambio en la carga de la sección del tejido, que elimina el exceso de tinción absorbido por el tejido y hace que los colores sean más claros. Después de la tinción de elastina, las muestras no deben lavarse con agua destilada para evitar cualquier dificultad en la diferenciación. Compruebe microscópicamente, según sea necesario, para ver si hay fibras elásticas azul-negras que tiñen y fondo gris. Es mejor subdiferenciar ligeramente el tejido ya que la contramancha posterior de Van Gieson también puede extraer un poco la mancha elástica.
9. Enjuague completamente estos portaobjetos con agua destilada después de la diferenciación.
10. Contraventa de los portaobjetos en la solución de Van Gieson durante 1 min.
    NOTA: El volumen de la solución de Van Gieson debe ser suficiente para poder sumergir completamente la sección de tejido en cada diapositiva.
11. Rápidamente caer 95% etanol sobre estas rodajas durante unos segundos para diferenciar bien cada sección de tejido.
    NOTA: No enjuague los portaobjetos con agua después de la contramancha del Van Gieson, ya que eso podría debilitar o incluso eluir el color de la contramancha del Van Gieson.

4. Deshidratación y montaje

1. Sumerja los portaobjetos en 95% de alcohol durante 5 minutos para dejar que se deshidraten rápidamente.
2. Continúe deshidratando estas rodajas en 2 cambios de 100% de alcohol, cada vez que sumerce los portaobjetos durante 5 min.
3. Sumerja las diapositivas en 2 cambios de xileno, cada vez durante 3 min.
4. Agregue una gota de medio de montaje resinoso a la corredera y coloque el cubreobjetos en la parte superior.

5. Observación microscópica de las diapositivas

1. Encuentra la dirección serosal y observa los resultados de la tinción elástica: las fibras elásticas (láminas) se tiñen de color azul-negro, las fibras de colágeno se tiñen de rojo, y las fibras musculares están teñidas de amarillo.
2. Busque las células cancerosas en toda la diapositiva: las células cancerosas están teñidas de amarillo^12.
3. Determinar la relación posicional entre las células cancerosas y la lámina elástica.
   NOTA: Habrá dos situaciones aquí. Mientras haya una célula tumoral que haya invadido más allá de la lámina elástica en toda la diapositiva, entonces este caso podría considerarse como invasión de lámina elástica. Por otro lado, sólo cuando no hay células tumorales que haya invadido más allá de la lámina elástica en toda la diapositiva, este caso podría considerarse como lamina elástica no invasión.

Resultados

Una tinción elástica exitosa revela claramente la lámina elástica y las células cancerosas en el cáncer gástrico pT3. La Figura 1 - campo de baja potencia, comprobada microscópicamente después de la tinción de la solución de elastina, antes de la contramancha de Van Gieson según el protocolo mencionado - muestra que la lámina elástica está cerca de las células mesoteliales serosales y está teñida de azul-negro en el forma de filamentos, y to...

Discusión

Este método propuesto aquí proporciona un enfoque preciso para identificar la lámina elástica subserosal. El método se puede utilizar para evaluar si las células tumorales han invadido la lámina elástica en el cáncer gástrico pT3N0M0^12. La lámina elástica es rojiza en secciones teñidas con H&E, que no se podía distinguir fácilmente de las fibras de colágeno, y otros métodos de diagnóstico auxiliares existentes, como la citología y la inmunohistoquímica, también ejercieron un v...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585