Colorazione elastica su vetrini di tessuto gastrico pT3N0M0 gastrico

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo di colorazione elastica per identificare le fibre elastiche nei tessuti del cancro gastrico pT300M0 su sezioni di cancro in formalina e incorporate in paraffina. Successivamente, descriviamo un metodo per determinare se le cellule tumorali invadono oltre la lamina elastica.

Abstract

La lamina elastica, che di solito si trova nello strato sub-mesoteliale, adiacente alle cellule mesoteliali peritoneo, è anfifila sulla colorazione ematossia ed eosina (H&E), ma può essere visualizzata attraverso la colorazione elastica. Uno dei vantaggi importanti della colorazione elastica è che rende facile determinare se le cellule tumorali hanno invaso oltre la lamina elastica. Questo aiuta a esaminare l'estensione dell'invasione superficiale peritoneale, distinguendo così gli stadi pT3 e pT4 nel cancro gastrointestinale. In questo studio, presentiamo un protocollo per identificare le fibre elastiche nelle sezioni del tessuto del cancro gastrico pT3N0M0 fissato in formalina e incorporato in paraffina. Prepariamo sezioni di paraffina di 5-m fissate su vetrini, e poi tutti i vetrini vengono deparaffinati e reidratati durante la procedura di colorazione. Successivamente, tutte le sezioni sono ossidati da permanganato di potassio, sbiancate dall'acido osalico, macchiate da macchie elastiche e contrastate da Van Gieson. Infine, esaminiamo l'effetto della colorazione; la mina elastica è macchiata di blu-nero e le fibre di collagene sono colorate di rosso, mentre le cellule tumorali sono macchiate in varie tonalità di giallo. Descriviamo in dettaglio anche i metodi utilizzati per determinare la relazione posizionale tra le cellule tumorali e la lamina elastica. Questo metodo è semplice, a basso costo, e ampiamente applicabile nell'identificazione dell'invasione superficiale di superficie nel cancro gastrointestinale a causa della sua eccezionale selettività per fibre elastiche e risultati autentici.

Introduzione

Secondo il sistema di staging per tumore, nodo e metastasi (TNM), la prognosi del cancro gastrico allo stadio patologico pT4 è significativamente peggiore di quella di pT3 (8a UICC/AJCC)¹. Con il cancro gastrico, la classificazione del tumore primario (pT) di solito dipende dalla profondità dell'invasione del tumore². Lo stadio patologico per il cancro gastrico pT3 è definito come cancro gastrico che invade attraverso il muscolosi in tessuti sottosrosali, mentre il cancro gastrico pT4 è definito come cancro penetrante sulla superficie del peritoneo viscerale. La presenza dell'invasività superficiale della superficie è lachiave per distinguere le due fasi 2. Tuttavia, poiché lo strato di cellule mesoteliaper peritoneali è molto sottile, potrebbe essere danneggiato durante l'intervento chirurgico, il trattamento postoperatorio e la fissazione³. Inoltre, i cambiamenti infiammatori e la fibrosi correlati al tumore possono danneggiare la normale anatomia del peritoneo, il che rende molto difficile giudicare con precisione l'invasione superficiale peritoneale utilizzando solo la colorazione H&E⁴. Gli attuali metodi di diagnosi ausiliaria come la cattualelogologia e l'immunohistochimica hanno un valore diagnostico limitato^5,6 perché sono falsi positivi o hanno una bassa efficacia in termini di costi.

La membrana sirosale comprende il peritoneo, la pleura e il pericardio, ed è composta dal mesotelio, una membrana del seminterrato e uno strato sub-mesoteliale⁷. Una caratteristica istologica comune della membrana sirosa è la presenza di una lamina elastica nello strato sub-mesoteliale, adiacente alle cellule mesoteliali^8,9. La lamina elastica ha una forte capacità anti-dannosa e può servire come marcatore prognostico alternativo se le cellule mesoteliane vengono distrutte da una grave infiammazione o fibrosi del tumore³. La lamina elastica comprende principalmente elastina e microfibrilla¹⁰, che può essere visualizzata per colorazione elastica. La ragione principale dietro l'uso della colorazione elastica è che l'elastina forma un legame di idrogeno con il gruppo fenolico di risorcinolo nella soluzione di elastina, causando fibre elastiche da macchiare blu-nero. Dopo Van Gieson (VG) colorazione contrastante, fibre di collagene possono essere macchiati di rosso e fibre muscolari e globuli rossi possono essere macchiati giallo^8,11,12,13.

L'ottava edizione della messa in scena TNM del cancro del polmone definisce l'invasione pleretale viscerale (T2) come un'invasione tumorale oltre la lamina elastica o un'invasione sulla superficie della pleura viscerale². Studi sul cancro colorettale hanno dimostrato che l'invasione della lamina elastica nel cancro del colon-retto pT3 può essere la ragione per le previsioni poveri. Il tasso di sopravvivenza globale e privo di malattie di 5 anni del cancro colorettale si è dimostrato simile a pT4a^13,14,15. Sulla base dei nostri studi precedenti sulla colorazione elastica, invasione di lamina elastica è stato trovato per avere una significativa influenza negativa sulla prognosi del cancro gastrico pT3 e dovrebbe essere trattata allo stesso modo come il cancro gastrico pT4a¹². Di conseguenza, questo metodo semplice ed economico può aiutare a eliminare l'incertezza nei risultati ottenuti attraverso la colorazione H&E e altre limitazioni comuni associate ad altri metodi di diagnosi ausiliaria, tra cui la cattuale e l'immunohistochimica, tra cui Altri. Questo metodo può essere utilizzato in modo efficiente per diagnosticare invasioni superficiali peritoneali del cancro gastrointestinale, soprattutto in alcuni casi ambigui. E 'conveniente dal momento che H&E macchia e altre macchie di solito rendono difficile identificare tali invasioni. Questo metodo garantisce anche un'affidabilità dei risultati poiché è molto selettivo, in particolare per le fibre elastiche. Qui, conduciamo colorazione elastica per determinare se le cellule tumorali hanno invaso la lamina elastica nel cancro gastrico pT3N0M0¹².

Questo metodo viene utilizzato per identificare le fibre elastiche nei tessuti su sezioni con valori fissati con formalina, incorporati in paraffina, e può essere utilizzato anche per le sezioni congelate. Qui, scegliamo sezioni con paraffina incorporata per la migliore manutenzione della morfologia cellulare e tissutale. Tutte le fasi di questo protocollo si svolgono a temperatura ambiente. Nello studio presentato viene utilizzato un kit di colorazione commerciale che include una soluzione permanganata di potassio, una soluzione di acido osalico, una soluzione di elastina e una soluzione Van Gieson.

Protocollo

Tra il 1994 e il 2005, campioni di pazienti sono stati selezionati da due patologi gastrointestinali esperti presso l'Affiliated Cancer Hospital della Xiangya School of Medicine, Università Del Sud Centrale, da pazienti affetti da gastrectomia di neolasmi dello stomaco, con diagnosi patologica postoperatoria del cancro gastrico nella fase pT3N0M0 (secondo la settima messa in scena TNM). Questo studio è stato approvato dal comitato di revisione etica.

1. Sezionamento

1. Posizionare il blocco di paraffina in un supporto fisso del microtoma a slitta, che può muoversi avanti e indietro attraverso la lama. Regolare l'angolo ottimale tra il blocco e il coltello a microtomi.
   NOTA: L'angolo ottimale dipende non solo dalla geometria della lama, ma anche dalla velocità di taglio e dalla tecnica.
2. Tagliare il blocco di paraffina in base alle esigenze e tagliarlo in sezioni trasversali spesse 5 m.
3. Posizionare le sezioni di paraffina di 5 m in un bagno d'acqua a circa 40 - 45 gradi centigradi e montarlo, successivamente, dall'acqua allo scivolo di vetro, una sezione per scivolo.
4. Premere la sezione montata con attenzione su un tovagliolo di carta per rimuovere l'acqua residua e le potenziali bolle d'aria.
5. Lasciare asciugare le sezioni ad aria per 30 min e cuocerle in forno a 45 - 50 gradi centigradi per 2 ore.

2. Deparaffinazione e reidratazione di tutte le diapositive

1. Immergere i vetrini nello xilene in un barattolo Coplin per 10 min.
2. Togliere gli scivoli dal primo barattolo di xilene e immergerli nello xilene in un altro barattolo per 10 min.
3. Ora, immergere i vetrini in 100% etanolo in un barattolo Coplin per 5 min.
4. Immergi i vetrini al 100% di etanolo in un altro barattolo Coplin, anche per 5 min.
5. Immergere i vetrini nel 95% di etanolo in un barattolo Coplin per 2 min.
6. Immergere i vetrini nel 70% di etanolo in un barattolo Coplin per 2 min.
   NOTA: Assicurarsi che le diapositive siano completamente immerse nelle soluzioni durante l'esecuzione dei passaggi precedenti.
7. Sciacquare brevemente gli scivoli con acqua distillata in un nuovo barattolo.

3. Colorazione

1. Prima di procedere per la colorazione, pulire eventuali soluzioni in eccesso intorno al tessuto sul vetrino con una carta velina.
2. Posizionare i vetrini in ambiente e le condizioni di umidità della stanza per evitare l'essiccazione del tessuto sul vetrino durante l'intero processo di colorazione.
3. Ossidare i vetrini con qualche goccia di potassio permanganato per 5 min. Assicurarsi che il volume di permanganazione di potassio è sufficiente per coprire la sezione di tessuto su ogni diapositiva.
4. Sciacquare i vetrini ossidati con acqua distillata in un barattolo Coplin con 2 - 3 cambi. Osservare il colore blu del tessuto.
5. Ora, sbiancare questi vetrini aggiungendo alcune gocce di acido ossilico per 5 min. Assicurarsi che il volume di acido osalico sia sufficiente a coprire completamente la sezione di tessuto su ogni diapositiva.
6. Sciacquare gli scivoli immergendoli nel barattolo Coplin pieno di acqua distillata. Eseguire il risciacquo 2x - 3x.
7. Ora, lavare questi vetrini brevemente in 95% alcol, e poi immergere i vetrini in una soluzione di elastina (5 g /L) per 8 - 24 h.
   NOTA: La soluzione Elastin è volatile e il tempo di colorazione è relativamente lungo, quindi è meglio immergere i vetrini con colorazione elastica in un contenitore sigillato, come una bottiglia di vetro trasparente con un tappo di tenuta. La capacità del contenitore e il volume della soluzione elastin dipende dal numero di diapositive immerse, purché consenta l'immersione completa di tutte le diapositive.
8. Immergere questi vetrini direttamente nel 95% di etanolo per 1 - 2 min per differenziare bene ogni sezione di tessuto.
   NOTA: La differenziazione si riferisce al cambiamento nella carica della sezione del tessuto, che rimuove la colorazione in eccesso assorbita dal tessuto e rende i colori più chiari. Dopo la colorazione della soluzione di estensione, i campioni non devono essere lavati con acqua distillata per evitare qualsiasi difficoltà nella differenziazione. Controllare microscopicamente, se necessario, per le fibre elastiche blu-nero colorazione e sfondo grigio. È meglio sottodifferenziare il tessuto poiché la successiva contromacchia di Van Gieson può anche estrarre un po 'la macchia elastica.
9. Sciacquare completamente questi vetrini con acqua distillata dopo la differenziazione.
10. Contrapporre gli scivoli in una soluzione di Van Gieson per 1 min.
    NOTA: il volume della soluzione Van Gieson deve essere sufficiente per poter immergere completamente la sezione dei tessuti su ogni diapositiva.
11. Lasciare rapidamente cadere 95% etanolo su queste fette per alcuni secondi per differenziare bene ogni sezione di tessuto.
    NOTA: Non sciacquare i vetrini con acqua dopo la controtendenza del Van Gieson, in quanto ciò potrebbe indebolire o addirittura eluire il colore della controfazione del Van Gieson.

4. Disidratazione e montaggio

1. Immergere i vetrini al 95% di alcol per 5 min per farli disidratare rapidamente.
2. Continuare a disidratare queste fette da 2 cambiamenti di 100% alcol, ogni volta immergendo i vetrini per 5 min.
3. Immergere le diapositive in 2 cambiamenti di xilene, ogni volta per 3 min.
4. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio resinoso al vetrino e posizionare il coperchio sulla parte superiore.

5. Osservazione microscopica dei vetrini

1. Trova la direzione sirosa e osserva i risultati della colorazione elastica: le fibre elastiche (lamina) sono macchiate di blu-nero, le fibre di collagene sono di colore rosso e le fibre muscolari sono di colore giallo.
2. Cercare le cellule tumorali in tutto lo scivolo: le cellule tumorali sono macchiate di giallo¹².
3. Determinare la relazione posizionale tra le cellule tumorali e la lamina elastica.
   NOTA: Ci saranno due situazioni qui. Finché c'è una cellula tumorale che ha invaso oltre la lamina elastica in tutto lo scivolo, allora questo caso potrebbe essere considerato come invasione elastica della lamina. D'altra parte, solo quando non c'è nessuna cellula tumorale che ha invaso oltre la lamina elastica in tutta la diapositiva, questo caso potrebbe essere considerato come lamina elastica non-invasione.

Risultati

Una colorazione elastica di successo rivela chiaramente la lamina elastica e le cellule tumorali nel cancro gastrico pT3. Figura 1 - campo a bassa potenza, microscopicamente controllato dopo la colorazione soluzione di elastina, prima della contromacchia di Van Gieson come da parte del protocollo menzionato - mostra la lamina elastica è vicino alle cellule mesotelia sirosae ed è macchiato blu-nero nel forma di filamenti, e c'è ancora una certa distanza tra...

Discussione

Questo metodo qui proposto fornisce un approccio accurato per identificare la lamina elastica sottosrosale. Il metodo può essere utilizzato per valutare se le cellule tumorali hanno invaso la lamina elastica nel cancro gastrico pT3N0M0¹². La lamina elastica è rossastra nelle sezioni macchiate di H&E, che non potevano essere facilmente distinte dalle fibre di collagene, e altri metodi di diagnosi ausiliaria esistenti, come la citologia e l'immunohistochimica, esercitavano anche un valore diagnost...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585