Elastische Färbung auf Paraffin-eingebetteten Dias von pT3N0M0 Magenkrebsgewebe

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll der elastischen Färbung vor, um elastische Fasern in pT3N0M0 Magenkrebsgeweben auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Abschnitten zu identifizieren. Anschließend beschreiben wir eine Methode, um zu bestimmen, ob Tumorzellen über die elastische Lamina hinaus eindringen.

Zusammenfassung

Die elastische Lamina, die sich in der Regel in der submesothelialen Schicht neben den Peritoneum-Mesothelzellen befindet, ist amphiphil auf Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E), kann aber durch elastische Färbung visualisiert werden. Einer der wichtigen Vorteile der elastischen Färbung ist, dass es leicht zu bestimmen, ob Tumorzellen über die elastische Lamina eingedrungen sind. Dies hilft bei der Untersuchung des Ausmaßes der peritonealen Oberflächeninvasion, wodurch die pT3- und pT4-Stadien bei Magen-Darm-Krebs unterschieden werden. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung elastischer Fasern in den formal infixierten, paraffin-eingebetteten pT3N0M0 Magenkrebsgewebeabschnitten vor. Wir bereiten 5-m Paraffinabschnitte auf Dias fest, und dann werden alle Dias während des Färbevorgangs deparaffiniert und rehydriert. Anschließend werden alle Abschnitte durch Kaliumpermanganat oxidiert, mit Oxalsäure gebleicht, durch elastische Färbung gebeizt und von Van Gieson gegengefärbt. Schließlich untersuchen wir die Wirkung der Färbung; elastische Lamina ist blau-schwarz gefärbt und Kollagenfasern sind rot gefärbt, während die Krebszellen in verschiedenen Gelbtönen gefärbt sind. Wir beschreiben auch detailliert die Methoden zur Bestimmung der Positionsbeziehung zwischen Krebszellen und elastischer Lamina. Diese Methode ist einfach, kostengünstig und weit verbreitet bei der Identifizierung von peritonealen Oberflächeninvasion bei Magen-Darm-Krebs wegen seiner hervorragenden Selektivität für elastische Fasern und authentische Ergebnisse.

Einleitung

Gemäß dem Tumor-, Knoten- und Metastasen-(TNM)-Krebs-Staging-System ist die Prognose von Magenkrebs im pathologischen Stadium pT4 signifikant schlechter als bei pT3 (8. UICC/AJCC)¹. Bei Magenkrebs hängt die Klassifizierung des Primärtumors (pT) in der Regel von der Tiefe der Tumorinvasion^{ab 2}. Pathologisches Stadium pT3 Magenkrebs ist definiert als Krebs, der durch die muscularis propria in subserosales Gewebe eindringt, während pT4 Magenkrebs als Krebs definiert wird, der auf die Oberfläche des viszeralen Peritoneums eindringt. Das Vorhandensein der peritonealen Oberflächeninvasivität ist der Schlüssel, um die beiden Stadien²zu unterscheiden. Da die peritoneale mesotheliale Zellschicht jedoch sehr dünn ist, könnte sie während der Operation, der postoperativen Behandlung und der Fixierung³beschädigt werden. Darüber hinaus können tumorbedingte entzündliche Veränderungen und Fibrose die normale Anatomie des Peritoneums schädigen, was es sehr schwierig macht, die peritoneale Oberflächeninvasion nur mit H&E-Färbung⁴genau zu beurteilen. Aktuelle Hilfsdiagnosemethoden wie Zytologie und Immunhistochemie sind von begrenztem diagnostischem Wert^5,6, weil sie falsch-positiv sind oder eine geringe Wirtschaftlichkeit haben.

Die serosale Membran umfasst das Peritoneum, Pleura und Perikard und besteht aus dem Mesothel, einer Kellermembran und einer submesotheliaalen Schicht⁷. Ein gemeinsames histologisches Merkmal der Serosalmembran ist das Vorhandensein einer elastischen Lamina in der submesotheliaalen Schicht, die an die mesotheliale Zellen^8,9angrenzt. Elastische Lamina hat eine starke anti-schädliche Fähigkeit und kann als alternativer prognostischer Marker dienen, wenn die Mesothelzellen durch schwere tumorbedingte Entzündungen oder Fibrose zerstört werden³. Elastische Lamina besteht hauptsächlich aus Elastin und Mikrofibril¹⁰, die durch elastische Färbung visualisiert werden können. Der Hauptgrund für die Verwendung der elastischen Färbung ist, dass das Elastin eine Wasserstoffbindung mit der phenolischen Gruppe von Resorcin in der Elastinlösung bildet, wodurch elastische Fasern blau-schwarz gefärbt werden. Nach Van Gieson (VG) kontrastierende Färbung, Kollagenfasern können rot gefärbt werden und Muskelfasernund rote Blutkörperchen können gelb 8,^11,12,13gebeizt werden.

Die achte Ausgabe der TNM-Inszenierung von Lungenkrebs definiert viszerale Pleurainvasion (T2) als Tumorinvasion jenseits der elastischen Lamina oder eine Invasion an der Oberfläche der viszeralen Pleura². Studien über Dickdarmkrebs haben gezeigt, dass die elastische Lamina-Invasion bei pT3-Darmkrebs der Grund für schlechte Prognosen sein kann. Die 5-Jahres-Krankheitsfreie und Gesamtüberlebensrate von Dickdarmkrebs haben sich auch als pT4a^13,14,15erwiesen. Basierend auf unseren früheren Studien über elastische Färbung, elastische Lamina Invasion wurde festgestellt, dass einen signifikanten negativen Einfluss auf die Prognose von pT3 Magenkrebs haben und sollte auf die gleiche Weise wie pT4a Magenkrebs behandelt werden¹². Daher kann diese einfache und kostengünstige Methode dazu beitragen, Unsicherheiten in den Ergebnissen zu beseitigen, die durch H&E-Färbung und andere häufige Einschränkungen im Zusammenhang mit anderen Hilfsdiagnosemethoden, einschließlich Zytologie und Immunhistochemie, unter Andere. Diese Methode kann effizient verwendet werden, um peritoneale Oberflächeninvasionen von Magen-Darm-Krebs zu diagnostizieren, vor allem in einigen mehrdeutigen Fällen. Es ist bequem, da H&E Flecken und andere Flecken es in der Regel schwierig machen, solche Invasionen zu identifizieren. Diese Methode gewährleistet auch eine Zuverlässigkeit der Ergebnisse, da sie sehr selektiv ist, insbesondere für elastische Fasern. Hier führen wir elastische Färbungen durch, um festzustellen, ob Tumorzellen in die elastische Lamina bei pT3N0M0 Magenkrebs¹²eingedrungen sind.

Diese Methode wird zur Identifizierung von elastischen Fasern in Geweben auf formalinfixierten, paraffineingebetteten Abschnitten verwendet und kann auch für gefrorene Abschnitte verwendet werden. Hier wählen wir Paraffin-eingebettete Abschnitte für die beste Erhaltung der Zell- und Gewebemorphologie. Alle Schritte in diesem Protokoll finden bei Raumtemperatur statt. In der vorgestellten Studie wird ein kommerzielles Färbeset verwendet, das eine Kaliumpermanganatlösung, eine Oxalsäurelösung, eine Elastinlösung und eine Van Gieson-Lösung enthält.

Protokoll

Zwischen 1994 und 2005 wurden Patientenproben von zwei erfahrenen Magen-Darm-Pathologen im Affiliated Cancer Hospital der Xiangya School of Medicine, Central South University, von Patienten ausgewählt, die an einer Magenneoplasmen-Darm-Darm-Erkrankung litten, postoperative pathologische Diagnose von Magenkrebs im pT3N0M0-Stadium (nach der siebten TNM-Inszenierung). Diese Studie wurde von der Ethik-Überprüfungskommission genehmigt.

1. Schnitt

1. Legen Sie den Paraffinblock in einen festen Halter des Schlittenmikrotomes, der sich rückwärts und vorwärts über die Klinge bewegen kann. Passen Sie den optimalen Winkel zwischen dem Block und dem Mikrotomemesser an.
   HINWEIS: Der optimale Winkel hängt nicht nur von der Geometrie der Klinge ab, sondern auch von der Schnittgeschwindigkeit und -technik.
2. Schneiden Sie den Paraffinblock nach Bedarf ab und schneiden Sie ihn in 5-m-dicke Querschnitte.
3. Legen Sie die Paraffin-Abschnitte in ein Wasserbad bei ca. 40 - 45 °C und montieren Sie es anschließend vom Wasser auf die Glasrutsche, einen Abschnitt pro Rutsche.
4. Drücken Sie den montierten Abschnitt vorsichtig gegen ein Papiertuch, um Restwasser und mögliche Luftblasen zu entfernen.
5. Abschnitte 30 min lufttrocknen lassen und dann im Ofen bei 45 - 50 °C für 2 h backen.

2. Deparaffinierung und Rehydrierung aller Dias

1. Tauchen Sie die Dias in Xylol in ein Coplin-Glas für 10 min.
2. Nehmen Sie die Dias aus dem ersten Xylol-Glas und tauchen Sie sie in Xylol in ein anderes Glas für 10 min.
3. Tauchen Sie nun die Dias in 100% Ethanol in ein Coplin-Glas für 5 min ein.
4. Tauchen Sie die Dias in 100% Ethanol in ein anderes Coplin-Glas, auch für 5 min.
5. Tauchen Sie die Dias in 95% Ethanol in ein Coplin-Glas für 2 min.
6. Tauchen Sie die Dias in 70% Ethanol in ein Coplin-Glas für 2 min.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Folien vollständig in die Lösungen eingetaucht sind, während Sie die oben genannten Schritte ausführen.
7. Spülen Sie die Dias kurz mit destilliertem Wasser in einem neuen Glas.

3. Färbung

1. Bevor Sie mit der Färbung fortfahren, wischen Sie überschüssige Lösungen um das Gewebe auf dem Dia mit einem Tissuepapier ab.
2. Platzieren Sie die Dias in Raumtemperatur und Raumfeuchtigkeit, um eine Trocknung des Gewebes während des gesamten Färbevorgangs auf dem Dia zu vermeiden.
3. Oxidieren Sie die Dias mit ein paar Tropfen Kaliumpermanganat für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Volumen von Kaliumpermanganat genug ist, um den Gewebeabschnitt auf jedem Dia zu decken.
4. Spülen Sie die oxidierten Dias mit destilliertem Wasser in einem Coplin-Glas mit 2 - 3 Veränderungen. Beobachten Sie die blaue Farbe des Gewebes.
5. Nun, bleichen Sie diese Dias durch Zugabe von ein paar Tropfen Oxalsäure für 5 min. Stellen Sie sicher, dass das Volumen von Oxalsäure genug ist, um den Gewebeabschnitt auf jedem Dia vollständig zu decken.
6. Spülen Sie die Dias, indem Sie sie in das mit destilliertem Wasser gefüllte Coplin-Glas eintauchen. Führen Sie die Spülung 2x - 3x aus.
7. Waschen Sie nun diese Dias kurz in 95% Alkohol, und tauchen Sie dann die Dias in eine Elastin-Lösung (5 g/L) für 8 - 24 h.
   HINWEIS: Die Elastin-Lösung ist flüchtig und ihre Färbezeit ist relativ lang, daher ist es am besten, die Dias mit elastischen Färbungen in einen versiegelten Behälter einzutauchen, wie z. B. eine transparente Glasflasche mit einer Dichtkappe. Die Kapazität des Behälters und das Volumen der Elastin-Lösung hängt von der Anzahl der eingetauchten Dias ab, sofern sie das vollständige Eintauchen aller Dias ermöglicht.
8. Tauchen Sie diese Dias direkt in 95% Ethanol für 1 - 2 min ein, um jeden Gewebeabschnitt gut zu unterscheiden.
   HINWEIS: Differenzierung bezieht sich auf die Änderung der Ladung des Gewebeabschnitts, die die überschüssige Färbung entfernt, die vom Gewebe absorbiert wird, und die Farben klarer macht. Nach der Färbung der Elastinlösung sollten Proben nicht mit destilliertem Wasser gewaschen werden, um Differenzierungsschwierigkeiten zu vermeiden. Prüfen Sie bei Bedarf mikroskopisch auf blau-schwarze elastische Fasern Färbung und grauen Hintergrund. Besser ist es, das Gewebe leicht zu unterdifferenzieren, da der anschließende Van Gieson-Gegenfleck auch den elastischen Fleck etwas extrahieren kann.
9. Diese Dias nach der Differenzierung vollständig mit destilliertem Wasser abspülen.
10. Gegenstain die Rutschen in einer Van Gieson Lösung für 1 min.
    HINWEIS: Das Volumen der Van-Gieson-Lösung muss ausreichen, um den Gewebeabschnitt auf jedem Dia vollständig eintauchen zu können.
11. Lassen Sie schnell 95% Ethanol auf diese Scheiben für ein paar Sekunden fallen, um jeden Gewebeabschnitt gut zu unterscheiden.
    HINWEIS: Spülen Sie die Dias nach der Gegenfärbung des Van Gieson nicht mit Wasser ab, da dies die Farbe der Van-Gieson-Gegenfärbung schwächen oder sogar verfälen könnte.

4. Dehydrierung und Montage

1. Tauchen Sie die Dias in 95% Alkohol für 5 min ein, um sie schnell dehydrieren zu lassen.
2. Fahren Sie fort, diese Scheiben durch 2 Veränderungen von 100% Alkohol zu dehydrieren, jedes Mal tauchen die Rutschen für 5 min.
3. Tauchen Sie die Dias in 2 Änderungen von Xylol, jedes Mal für 3 min.
4. Fügen Sie einen Tropfen harziges Montagemedium auf die Folie und legen Sie den Deckelrutsch auf der Oberseite.

5. Mikroskopische Beobachtung der Dias

1. Finden Sie die serosale Richtung und beobachten Sie die Ergebnisse der elastischen Färbung: elastische Fasern (Lamina) sind blau-schwarz gefärbt, Kollagenfasern sind rot gefärbt und Muskelfasern sind gelb gefärbt.
2. Suchen Sie nach den Krebszellen in der ganzen Folie: Krebszellen sind gelb gefärbt¹².
3. Bestimmen Sie die Positionsbeziehung zwischen den Krebszellen und elastischen Lamina.
   HINWEIS: Hier wird es zwei Situationen geben. Solange es eine Tumorzelle gibt, die über die elastische Lamina im gesamten Dia eingedrungen ist, könnte dieser Fall als elastische Laminainvasion betrachtet werden. Andererseits könnte dieser Fall nur dann als elastische Lamina-Nicht-Invasion betrachtet werden, wenn es keine Tumorzelle gibt, die über die elastische Lamina im gesamten Dia hinaus eingedrungen ist.

Ergebnisse

Eine erfolgreiche elastische Färbung zeigt deutlich elastische Lamina und Krebszellen bei pT3 Magenkrebs. Abbildung 1 - Low-Power-Feld, mikroskopisch nach Elastin-Lösung Färbung überprüft, vor Van Giesons Gegenfleck nach dem erwähnten Protokoll - zeigt, dass die elastische Lamina in der Nähe der serosalen mesotheliale Zellen ist und blau-schwarz in der Form von Filamenten, und es gibt immer noch einen gewissen Abstand zwischen den Tumorzellen und der e...

Diskussion

Diese hier vorgeschlagene Methode bietet einen genauen Ansatz zur Identifizierung der subserosalen elastischen Lamina. Die Methode kann verwendet werden, um zu bewerten, ob Tumorzellen in die elastische Lamina bei pT3N0M0 Magenkrebs eingedrungen sind¹². Elastische Lamina ist rötlich in H&E-gefärbten Abschnitten, die nicht leicht von Kollagenfasern unterschieden werden konnte, und andere bestehende Hilfsdiagnosemethoden, wie Zytologie und Immunhistochemie, übten ebenfalls einen begrenzten diagno...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Elastin-Van Gieson staining kit	Baso	BA4083B	Used for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers
Permount TM Mounting Medium	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Used for mounting
Ethanol	LMAI Bio	LM64-17-5	100%
Xylene	LMAI Bio	LX820585