JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול של כתמים אלסטיים כדי לזהות סיבים אלסטיים ברקמות סרטן קיבה pT3N0M0 על formalin-קבוע, פרפין חלקים מוטבעים. לאחר מכן, אנו מתארים שיטה כדי לקבוע אם תאים סרטניים לפלוש מעבר ללבינה אלסטי.

Abstract

לאמינה אלסטי, אשר ממוקם בדרך כלל בשכבת sub-mesothelial, בסמוך צפק mesothelial תאים, הוא אמפיפיפילית על המטאוקסילין ואאוזין (H & E) הצביעת אבל יכול להיות מדמיין דרך כתמים אלסטיים. אחד היתרונות החשובים של כתמים אלסטיים הוא שזה מקל לקבוע אם התאים הסרטניים פלשו מעבר לאמינה אלסטי. זה עוזר לבחון את היקף הפלישה משטח הצפק, ובכך להבחין בשלבים pT3 ו pT4 בסרטן העיכול. במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי סיבים אלסטיים ב-formalin קבוע, פרפין-מוטבע pT3N0M0 רקמות סרטן הקיבה סעיפים. אנו מכינים מקטעים פרפין 5-μm שתוקנו בשקופיות, ולאחר מכן כל השקופיות מdeparaffinated ומהתייבשות במהלך הליך הצביעת. לאחר מכן, כל הסעיפים תחמוצת על ידי אשלגן פרמנגנט, מולבן על ידי חומצה אוקסלית, מוכתם על ידי כתמים אלסטיים, ומוכתם על ידי ואן גיסון של. לבסוף, אנו בודקים את השפעת ההכתמים; לאמינה אלסטי הוא סיבים כחול-שחור וקולגן מוכתם אדום, בעוד תאים סרטניים מוכתמים בגוונים שונים של צהוב. כמו כן, אנו מתארים בפרוטרוט את השיטות המשמשות לקביעת מערכת היחסים המקובעת בין תאים סרטניים לבינה אלסטית. שיטה זו פשוטה, בעלות נמוכה, וישימה באופן נרחב בזיהוי של הפלישה משטח הצפק בסרטן העיכול בגלל הסלקטיביות המדהימה שלה לסיבים אלסטיים ותוצאות אותנטיות.

Introduction

לפי הגידול, צומת, ו גרורות (TNM) מערכת האחסון הזמני של סרטן, הפרוגנוזה של סרטן הקיבה בשלב הפתולוגי pT4 הוא גרוע משמעותית מזה ב pT3 (8th UICC/AJCC)1. עם סרטן קיבה, סיווג של הגידול העיקרי (pT) בדרך כלל תלוי בעומק של הפלישה הגידול2. השלב הפתולוגי pT3 סרטן הקיבה מוגדר כמו הפולשים הסרטן דרך המוסקולאריס קינא לתוך רקמות subserosal, בעוד סרטן הקיבה pT4 מוגדר כמו סרטן חודר אל פני השטח של צפק הקרביים. הימצאות של משטח הצפק הינו המפתח להבחנה בין שני השלבים2. עם זאת, מכיוון ששכבת התא mesothelial הצפק היא רזה מאוד, זה יכול להיות ניזוק במהלך הניתוח, טיפול פוסט-פעיל, וקיבוע3. יתר על כן, הקשורות לגידול שינויים דלקתיים פיברוזיס יכול להזיק אנטומיה נורמלית של צפק, מה שהופך את זה קשה מאוד לשפוט את הפלישה משטח הצפק באמצעות רק H & E צביעת4. שיטות אבחון העזר הנוכחיות, כגון ציטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, הן בעלות אבחון מוגבל של5,6 מכיוון שהן מזויפות, או שיש להן עלויות נמוכות.

קרום serosal כולל את צפק, pleura, ואת קרום הלב, והוא מורכב מmesothelium, קרום המרתף, ו-sub-mesothelial שכבה7. אחת התכונות היסטולוגית נפוצות של קרום serosal היא הנוכחות של לאמנה אלסטי בשכבת sub-mesothelial, בסמוך mesothelial תאים8,9. לאמה אלסטי יש יכולת אנטי מזיק חזק והוא יכול לשמש סמן אלטרנטיבי התחזיות כאשר התאים הmesothelial נהרסים על ידי דלקת חמורה הקשורות לגידול או פיברוזיס3. לאמנה אלסטי בעיקר כוללת אלסטין ומיקרופיבריל10, אשר ניתן לדמיין על ידי כתמים אלסטיים. הסיבה העיקרית מאחורי השימוש של הכתמים האלסטיים היא כי האלסטין יוצר קשר מימן עם הקבוצה פנופילית של ריסיניול בתמיסה אלסטין, גרימת סיבים אלסטיים להיות מוכתם כחול-שחור. לאחר Van gieson (VG) מנוגדים כתמים, סיבי קולגן יכול להיות מוכתם סיבי אדום ושריר ותאי דם אדומים יכול להיות צהוב מוכתם8,11,12,13.

המהדורה השמינית של ההיערכות tnm של סרטן הריאות מגדיר הפלישה הקרביים פלאורלי (T2) כפלישה הגידול מעבר לטרף אלסטי או פלישה על פני השטח של pleura הקרביים2. מחקרים על סרטן המעי הגס הראו כי הפלישה לאמינה אלסטי בסרטן המעי הגס pT3 עשוי להיות הסיבה לתחזיות המסכן. המחלה של 5 שנים ללא שיעור ההישרדות הכוללת של סרטן המעי הגס גם הוכחו להיות כמו pT4a13,14,15. בהתבסס על המחקרים הקודמים שלנו על כתמים אלסטיים, הפלישה לאמנה אלסטי נמצא יש השפעה שלילית משמעותית על הפרוגנוזה של סרטן קיבה pT3 וצריך להיות מטופלים באותו אופן כמו סרטן קיבה pT4a12. מכאן, זו שיטה פשוטה וחסכונית יכול לעזור למנוע חוסר ודאות בתוצאות שהתקבלו באמצעות כתמים H & E, ומגבלות נפוצות אחרות הקשורות לשיטות אחרות לאבחון עזר, כולל ציטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה, בין אחרים. שיטה זו ניתן להשתמש ביעילות כדי לאבחן פלישות הקרקע הצפק של סרטן העיכול, במיוחד במקרים מסוימים רב-משמעיים. זה נוח מאז הכתם H & E וכתמים אחרים בדרך כלל להקשות לזהות פלישות כאלה. שיטה זו גם מבטיחה מהימנות של תוצאות מכיוון שהיא סלקטיבית מאוד, במיוחד לסיבים אלסטיים. כאן, אנו מבצעים כתמים אלסטיים כדי לקבוע אם התאים הסרטניים פלשו לאמינה אלסטי בסרטן קיבה pT3N0M012.

שיטה זו משמשת לזיהוי סיבים אלסטיים ברקמות על מקטעים של formalin-קבוע, פרפין, וניתן להשתמש בהם גם עבור מקטעים קפואים. כאן, אנו בוחרים פרפין-מקטעים מוטבעים עבור התחזוקה הטובה ביותר של מורפולוגיה תאית ורקמות. כל השלבים בפרוטוקול זה מתקיימים בטמפרטורת החדר. ערכת כתמים מסחרית הכוללת הפתרון אשלגן הפרמנגנט, פתרון חומצה אוקסלית, פתרון אלסטין, והפתרון של ואן גיסון משמש במחקר המוצג.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

בין 1994 ו 2005, דגימות החולה נבחרו על ידי שני פתולוגים מנוסים מערכת העיכול בבית החולים לסרטן המזוהה של Xiangya בית הספר לרפואה, מרכז דרום האוניברסיטה, מחולים שסבלו הקיבה של ניקילסקה בבטן, עם אבחון פתולוגי לאחר הניתוח של סרטן קיבה בשלב pT3N0M0 (על פי ההיערכות TNM השביעית). מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת האתיקה.

1. המשך המכירה

  1. מניחים את הבלוק פרפין לתוך מחזיק קבוע של מיקרוטומה מזחלת, אשר יכול לנוע אחורה וקדימה על פני הלהב. התאימו את הזווית המיטבית בין הבלוק לסכין המיקרוטומה.
    הערה: הזווית האופטימלית לא רק תלויה בגיאומטריה של הלהב אלא גם במהירות החיתוך ובטכניקה.
  2. לקצץ את בלוק פרפין לפי הצורך ולחתוך אותו בסעיפים 5-μm-עובי הצלב.
  3. מניחים את הפרפין 5-μm סעיפים באמבט מים בסביבות 40-45 ° c והר זה, לאחר מכן, מן המים על מגלשת הזכוכית, מקטע אחד לכל שקופית.
  4. לחץ על המקטע הנטען בזהירות מול מגבת נייר כדי להסיר את כל המים השיורית ובועות האוויר הפוטנציאליות.
  5. אפשר לחלקים להתייבש באוויר במשך 30 דקות ולאחר מכן אופים אותם בתנור ב-45-50 ° c עבור 2 h.

2. התחדשות ושחות של כל השקופיות

  1. הישאב את השקופיות בתוך קסילן בצנצנת של Coplin במשך 10 דקות.
  2. קח את השקופיות מצנצנת הקסילן הראשונה והישאב אותם לתוך הצנצנת האחרת בעוד כ -10 דקות.
  3. עכשיו, לטבול את השקופיות ב 100% אתנול בצנצנת Coplin עבור 5 דקות.
  4. לטבול את השקופיות ב 100% אתנול בצנצנת אחרת Coplin, גם עבור 5 דקות.
  5. לטבול את השקופיות ב 95% אתנול בצנצנת Coplin עבור 2 דקות.
  6. לטבול את השקופיות ב 70% אתנול בצנצנת Coplin עבור 2 דקות.
    הערה: ודא שהשקופיות שקועים לחלוטין בפתרונות בעת ביצוע השלבים שלעיל.
  7. שטפו את השקופיות בקצרה עם מים מזוקקים בצנצנת חדשה.

3. צביעת מיכל

  1. לפני שתמשיך להכתים, נגב את כל הפתרונות העודפים סביב הרקמה בשקופית עם נייר טישו.
  2. הניחו את השקופיות בטמפרטורת החדר ובתנאי לחות החדר כדי למנוע ייבוש של הרקמה על השקופית לאורך כל תהליך הצביעת.
  3. מחמצן את השקופיות עם כמה טיפות של אשלגן פרמנגנט עבור 5 דקות. ודא שנפח האשלגן פרמנגנט מספיק כדי לכסות את מקטע הרקמה בכל שקופית.
  4. שטפו את השקפים המחמצנים עם מים מזוקקים בצנצנת Coplin עם 2-3 שינויים. שימו לב לצבע הכחול של הרקמה.
  5. עכשיו, להלבין שקופיות אלה על ידי הוספת כמה טיפות של חומצה אוקסלית עבור 5 דקות. ודא שעוצמת החומצה האוקסלית מספיקה כדי לכסות לחלוטין את מקטע הרקמה בכל שקופית.
  6. שטפו את השקופיות על ידי הקצאתם בצנצנת הקופלין המלאה במים מזוקקים. לבצע את השטיפה 2x-3x.
  7. עכשיו, לשטוף את השקופיות האלה בקצרה ב 95% אלכוהול, ולאחר מכן לטבול את השקופיות לתוך תמיסת אלסטין (5 g/L) עבור 8-24 h.
    הערה: הפתרון אלסטין הוא נדיף, והזמן המכתים שלו הוא ארוך יחסית, כך שעדיף לטבול את השקופיות עם כתמים אלסטיים במיכל אטום, כגון בקבוק זכוכית שקוף עם כובע איטום. הקיבולת של המיכל והנפח של פתרון האלסטין תלוי במספר השקופיות השקועים, כל עוד היא מאפשרת טבילה מלאה של כל השקופיות.
  8. לטבול שקופיות אלה ישירות ב 95% אתנול עבור 1-2 דקות כדי להבדיל כל סעיף רקמות היטב.
    הערה: בידול מתייחס לשינוי במטען של מקטע הרקמה, אשר מסיר את עודף הצבע נספג על ידי הרקמה והופך את הצבעים ברורים יותר. לאחר שאלסטין כתמים פתרון, דגימות לא צריך לשטוף עם מים מזוקקים כדי למנוע כל קושי בידול. בדוק את המיקרוסקואני, בהתאם לצורך, לצביעת סיבים אלסטיים בצבע כחול-שחור ורקע אפור. עדיף להבדיל מעט את הרקמה מאז הכתם הנגדי של ואן גיסון בעקבות יכול גם לחלץ במידת מה את הכתם אלסטי.
  9. לשטוף לחלוטין שקופיות אלה עם מים מזוקקים לאחר בידול.
  10. מנגד את השקופיות בתמיסה. של ואן-גיסון במשך 1 דקות
    הערה: הנפח של הפתרון של ואן גיסון צריך להיות מספיק כדי להיות מסוגל לטבול את מקטע הרקמה בכל שקופית לחלוטין.
  11. ירידה מהירה 95% אתנול על פרוסות אלה במשך כמה שניות כדי להבדיל כל סעיף רקמות היטב.
    הערה: אין לשטוף את השקופיות עם מים לאחר כתמים של ואן גיסון, כי זה יכול להחליש או אפילו להפיל את צבע הנגד של ואן גיסון.

4. התייבשות והרכבה

  1. לטבול את השקופיות ב 95% אלכוהול עבור 5 דקות לתת להם ליטול מייבשים במהירות.
  2. המשיכו לחלק את הפרוסות האלה בשני שינויים של 100% אלכוהול, בכל פעם שאתם מוסיפים את השקופיות למשך 5 דקות.
  3. לטבול את השקופיות לתוך 2 שינויים של קסילין, בכל פעם עבור 3 דקות.
  4. הוסף טיפה אחת של מדיום הרכבה מחדש לשקופית ומניחים את הכיסויים בחלק העליון.

5. תצפית מיקרוסקופית על השקופיות

  1. מצא את כיוון serosal ולהתבונן בתוצאות של כתמים אלסטיים: סיבים אלסטיים (lamina) הם כחול שחור ויטראז ', סיבי קולגן מוכתמים אדום, סיבי שריר הם צהוב מוכתם.
  2. לחפש את התאים הסרטניים בשקופית כולה: תאים סרטניים מוכתם12צהוב.
  3. לקבוע את הקשר המקובע בין תאים סרטניים לבינה אלסטית.
    הערה: יהיו כאן שני מצבים. כל עוד יש תא גידול אחד שפלש מעבר ללאטינה אלסטי בשקופית כולה, אז המקרה הזה יכול להיחשב הפלישה לאמנה אלסטי. מצד שני, רק כאשר אין תא הגידול שפלש מעבר ללאטינה אלסטי בשקופית כולה, המקרה הזה יכול להיחשב כמו לאמינה אלסטי הפלישה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

מכתים אלסטי מוצלח בבירור מגלה לאמינה אלסטי תאים סרטניים בסרטן קיבה pT3. איור 1 -כוח נמוך השדה, נבדק באופן מאכל אחר לצביעת התמיסה, לפני כתם הנגד של ואן ג'יוסון לפי הפרוטוקול שהוזכר-מראה את לאמינה אלסטי קרוב לתאים mesothelial serosal והוא מוכתם כחול-שחור ב ועדיין קיים מ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

שיטה זו המוצעת כאן מספקת גישה מדויקת לזיהוי האלסטית הגמישה של subserosal. השיטה יכולה לשמש כדי להעריך אם התאים הסרטניים פלשו לאמה אלסטי בסרטן קיבה pT3N0M012. גומי אלסטי הוא אדמדם בסעיפים H & E-ויטראז ', אשר לא ניתן להבדיל בקלות מסיבי קולגן, ושיטות אחרות אבחון עזר נוסף, כגון ציטולוגיה ו אימ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

המחברים מודים לתמיכה בחלק מן הקרן הלאומית למדע הטבע (NO. 81401902 ו-NO. 81501992) וקרן הונאן למדעי הטבע (NO 2017SK2134, NO. 2018JJ2238). כתב היד נכתב על ידי גואנג ליי. הניסוי כולו מבוצע על ידי גואנג-ליי והיאן יאנג. המחברים מודים לעזרתם של הפתולוגים ושל הבחורים העוקבים אחר נתוני המטופלים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Elastin-Van Gieson staining kitBasoBA4083BUsed for staining of elastic fibers, collagen fibers and myofibers 
Permount TM Mounting MediumMXB BiotechnologiesDAB-0033Used for mounting
EthanolLMAI Bio LM64-17-5 100%
XyleneLMAI Bio LX820585

References

  1. Jiang, C. G., et al. Clinicopathologic characteristics and prognosis of gastric cancer invading the subserosa. Journal of Surgical Oncology. 102 (7), 737-741 (2010).
  2. Amin, M. B., et al. AJCC Cancer Staging Manual. 8th ed. , Springer. New York, NY. (2017).
  3. Kojima, M., et al. Elastic laminal invasion in colon cancer: diagnostic utility and histological features. Frontiers in Oncology. 2, 179(2012).
  4. Ludeman, L., Shepherd, N. A. Serosal involvement7 in gastrointestinal cancer: its assessment and significance. Histopathology. 47 (2), 123-131 (2005).
  5. Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. The prognostic importance of peritoneal involvement in colonic cancer: a prospective evaluation. Gastroenterology. 112 (4), 1096-1102 (1997).
  6. Liang, W. Y. Retrospective evaluation of elastic stain in the assessment of serosal invasion of pT3N0 colorectal cancers. American Journal of Surgical Pathology. 37 (10), 1565-1570 (2013).
  7. Carter, D., True, L., Otis, C. N. Serosal membranes. Histology for Pathologists. 3rd ed. Mills, S. E. , Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia, PA. 547-562 (2007).
  8. Knudsen, P. J. The peritoneal elastic lamina. Journal of Anatomy. 177, 41-46 (1991).
  9. Shepherd, N. A., Baxter, K. J., Love, S. B. Influence of local peritoneal involvement on pelvic recurrence and prognosis in rectal cancer. Journal of Clinical Pathology. 48 (9), 849-855 (1995).
  10. Uitto, J., Li, Q., Urban, Z. The complexity of elastic fibre biogenesis in the skin--a perspective to the clinical heterogeneity of cutis laxa. Experimental Dermatology. 22 (2), 88-92 (2013).
  11. Kazlouskaya, V., et al. The utility of elastic Verhoeff-Van Gieson staining in dermatopathology. Journal of Cutaneous Pathology. 40 (2), 211-225 (2013).
  12. Lei, G., et al. Elastic staining-a rejuvenated method to reassess prognosis and serosal invasion in patients with pT3N0M0 gastric cancer. Human Pathology. 65, 79-84 (2017).
  13. Hernández-Morera, P., Travieso-González, C. M., Castaño-González, I., Mompeó-Corredera, B., Ortega-Santana, F. Segmentation of elastic fibres in images of vessel wall sections stained with Weigert's resorcin-fuchsin. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 142, 43-54 (2017).
  14. Kojima, M., Nakajima, K., Ishii, G., Saito, N., Ochiai, A. Peritoneal elastic laminal invasion of colorectal cancer: the diagnostic utility and clinicopathologic relationship. American Journal of Surgical Pathology. 34 (9), 1351-1360 (2010).
  15. Nakanishi, Y., et al. Reappraisal of Serosal Invasion in Patients With T3 Colorectal Cancer by Elastic Stain. ARCHIVES OF PATHOLOGY & LABORATORY MEDICINE. 140 (1), 81-85 (2016).
  16. Grin, A., et al. Peritoneal elastic lamina invasion: limitations in its use as a prognostic marker in stage II colorectal cancer. Human Pathology. 44 (12), 2696-2705 (2013).
  17. Stewart, C. J., Brennan, B. A., Crook, M. L., Russell, P. Value of elastin staining in the assessment of peritoneal implants associated with ovarian serous borderline tumours. Histopathology. 51 (3), 313-321 (2007).
  18. Kojima, M., et al. Pathological diagnostic criterion of blood and lymphatic vessel invasion in colorectal cancer: a framework for developing an objective pathological diagnostic system using the Delphi method, from the Pathology Working Group of the Japanese Society for Cancer of the Colon and Rectum. Journal of Clinical Pathology. 66 (7), 551-558 (2013).
  19. Elston, C. A., Kazlouskaya, V., Elston, D. M. Elastic staining versus. fluorescent and polarized microscopy in the diagnosis of alopecia. Journal of the American Academy of Dermatology. 69 (2), 288-293 (2013).
  20. Vos, A., et al. Predominance of Nonatherosclerotic Internal Elastic Lamina Calcification in the Intracranial Internal Carotid Artery. Stroke. 47 (1), 221-223 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147pT3N0M0

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved