JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم في فيفو اثنين-فوتون التصوير البروتوكول للتصوير قشرة الدماغ الفئران حديثي الولادة. هذا الأسلوب مناسبة لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.

Abstract

تصوير اثنين-فوتون أداة قوية للتحليل في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الثدييات. ومع ذلك، توجد عدد محدود من أساليب التصوير في فيفو لفحص أنسجة المخ من الثدييات حديثي الولادة الحية. وهنا يمكننا تلخيص بروتوكول لتصوير الخلايا العصبية القشرية فردية في الفئران حديثي الولادة الحية. يتضمن هذا البروتوكول المنهجيتين التالية: (1) نظام سوبر نوفا لوسم متفرق ومشرق للخلايا العصبية القشرية في الدماغ، و (2) إجراء العمليات جراحية للجمجمة الولدان الهشة. ويسمح هذا البروتوكول مراقبة التغيرات الزمنية لفرادى نيوريتيس القشرية خلال مراحل الأطفال حديثي الولادة مع ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء. كما يمكن عن طريق الجمع بين الفائق مع تدخل الجيش الملكي النيبالي والجينات كريسبر/Cas9 تحرير نظم إسكات الجينات الخاصة بخلية مسماة وخروج المغلوب. هذا البروتوكول، وبالتالي، يمكن لتحليل الديناميات التنموية من الخلايا العصبية القشرية، الآليات الجزيئية التي تتحكم في ديناميات الخلايا العصبية، والتغيرات في ديناميات الخلايا العصبية في نماذج المرض.

Introduction

الأسلاك الدقيقة من الدوائر العصبية في قشرة الدماغ ضروري لوظائف الدماغ العليا بما في ذلك التصور، والإدراك، والتعلم والذاكرة. الدوائر القشرية المكررة بشكل حيوي أثناء التطوير بعد الولادة. الدراسات وحققت عملية استخدام تشكيل الدائرة القشرية غذائها و في المختبر تحليلات الثقافة. ومع ذلك، ظلت ديناميات تشكيل الدائرة في الثدييات الحية غير مستكشفة في معظمها.

اثنين-فوتون الفحص المجهري تستخدم على نطاق واسع للتحليلات في فيفو الدوائر العصبية في الدماغ الماوس الكبار1،2. ومع ذلك، نظراً للتحديات التقنية، سوى عدد محدود من الدراسات تناولت تشكيل الدوائر العصبية في الفئران حديثي الولادة. على سبيل المثال، يقوم كاريو et al. تصوير مرور الزمن تسلق الألياف في المخيخ في الأسبوع بعد الولادة الثانية3. كيليو بورترا et al. عن تصوير محاور عصبية في الطبقة القشرية 1 في أول أسبوع بعد الولادة4. في الدراسة الحالية، ويمكننا تلخيص بروتوكول لمراقبة طبقة 4 القشرية الخلايا العصبية وعلى dendrites في الفئران حديثي الولادة. وترد النتائج التي تم الحصول عليها بتطبيق هذا البروتوكول، التي تتضمن منهجيات اثنين، في لدينا منشور الأخيرة5. أولاً، نحن نستخدم5،نظام ناقل سوبر نوفا6 لوضع العلامات الفردية من الخلايا العصبية في الدماغ الولدان. في نظام سوبر نوفا، البروتينات الفلورية تستخدم لتسمية الخلايا العصبية الجينات الخاصة بخلية قابلة للصرف والمسمى ضربة قاضية وتحليلات التحرير/خروج المغلوب أيضا ممكنة. ثانيا، نحن تصف إجراء العمليات جراحية لإعداد إطار الجمجمة في الفئران حديثي الولادة الهشة. معا، تسمح هذه المنهجيات في فيفو الملاحظة الفردية الخلايا العصبية في أدمغة الأطفال حديثي الولادة.

Protocol

وينبغي إجراء تجارب وفقا للمبادئ التوجيهية المنصوص عليها في مؤسسة المجرب الرفق بالحيوان.

1. إعداد الجراء للتصوير

ملاحظة: الجراء مع الخلايا العصبية القشرية المسماة قليلة ويمكن الحصول في الرحم انهانسر (IUE) الفائق ناقلات5،6. يتكون نظام مستعر أعظم من موجهات اثنين التالية: ترى-لجنة المساواة العرقية وكاج-لوكسب-توقف-لوكسب-س جين-آيريس--نقل واكتساب التكنولوجيا-وبر. وسم متفرق في هذا النظام، تعتمد على التسرب ترى. في عدد سكان متفرق transfected الخلايا العصبية، محركات ترى التعبير ضعيفة من لجنة المساواة العرقية ونقل واكتساب التكنولوجيا. وفي وقت لاحق، فقط في هذه الخلايا، يسر التعبير عن الجين X ردود فعل إيجابية من دورات ترى نقل واكتساب التكنولوجيا. حقق متفرق ومشرق العلامات يسمح تصور التفاصيل المورفولوجية للخلايا العصبية الفردية في فيفو. لم ترد تفاصيل الإجراء IUE في وصف هذا البروتوكول نظراً لأنها كانت في مكان آخر7،،من89،،من1011.

  1. إعداد الفئران الحوامل في الوقت المناسب ل IUE.
  2. تعد حلاً الحمض النووي ل IUE. لوسم متفرق مع طلب تقديم العروض، استخدام محلول يحتوي على pK031:TRE-لجنة المساواة العرقية (5 نانوغرام/ميليلتر) ومن pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 ميكروغرام/ميليلتر) أو محلول يحتوي على pK031:TRE-لجنة المساواة العرقية (5 نانوغرام/ميليلتر) و pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 ميكروغرام/ميليلتر).
    ملاحظة: يمكن التعبير عن مختلف البروتينات في الخلايا العصبية المسماة باستخدام تركيبات مختلفة من العوامل الناقلة للمرض. أيضا، مختلف الجينات يمكن طرقت إلى أسفل أو طرقت السحب على وجه التحديد في الخلايا المسماة5،6 (مثلاً، سلسلة من النواقل لنظام سوبر نوفا متوفرة من مركز الأبحاث بتبريد بيوريسورسي ومن أدجيني).
  3. أداء العادية IUE7،،من89،10،11 إلى تسمية الخلايا العصبية القشرية. لتسمية الخلايا العصبية طبقة 4، استخدام الجنينية يوم 14 الأجنة.
  4. الانتظار للتسليم ألجرو والنمو.

2-جراحة

  1. تخدير الولادة ألجرو (P5) يوم-5 استخدام غاز إيسوفلوراني (1.0%). إجراء اختبار الذيل-قرصه للتحقق من مستوى التخدير. إذا كان ألجرو يستجيب إلى رشة، زيادة تركيز isoflurane (يصل إلى 2.0 في المائة) أو انتظر حتى يختفي الاستجابة. الحفاظ على درجة حرارة الجسم ألجرو أثناء الجراحة باستخدام وسادة تدفئة.
  2. حقن تحت الجلد مسكن (والايبوبروفين، 5 مغ/كغ).
  3. تعقيم الجلد ألجرو تغطي الجمجمة بالمسح عليه مع الإيثانول 70% ثلاث مرات.
  4. قم بإزالة حوالي 20 مم2 من الجلد تغطي الجمجمة باستخدام مقص التعقيم مع الإيثانول 70% (الشكل 1A).
  5. إزالة اللفافة الجمجمة باستخدام الملقط المعقم ومسحه القطن نظيفة ومعقمة (الشكل 1A).
  6. تطبيق لاصق الأنسجة باستخدام تلميحات التحميل إلى سطح الجلد قطعي لوقف النزيف. لا تنطبق لاصق الأنسجة إلى منطقة التصوير (الشكل 1B) لأن هذا يزيد من صعوبة فتح الجمجمة.
  7. ضع ألجرو على وسادة تدفئة (37 درجة مئوية) والسماح للتعافي من التخدير. انتظر حتى لاصق الأنسجة قد جفت ووطدت (حوالي 30 دقيقة).
  8. إذا لزم الأمر، تطبيق أكثر الأنسجة لاصقة وانتظر حتى تجف وترسيخ.

3-إعداد الإطار الجمجمة

  1. تخدير ألجرو باستخدام إيسوفلوراني (1.0%-2.0%)، والتحقق من مستوى التخدير باختبار قرصه الذيل.
  2. فتح الجمجمة بعناية مع شفرة حلاقة معقم يترك دوراً سليمة (قطرها 1 ملم) (الشكل 1). استخدام اسفنجة جيلاتين (مقطعة إلى قطع صغيرة، تقريبا < 2 مم3، باستخدام مقص معقم، وتطبيقها باستخدام الملقط) غارقة في القشرة العازلة12 (125 mmol/لتر كلوريد الصوديوم، 5 ملمول/لتر بوكل، الجلوكوز 10 ملمول/لتر، 10 ملمول/لتر هيبيس، 2 ملمول/لتر كاكل2 ، و 2 ملمول/لتر مجسو4؛ الرقم الهيدروجيني 7.4؛ موسم 300/لتر؛ درجة حرارة الغرفة) وقف النزيف. عند فتح الجمجمة، تنطبق قشرة عازلة للحفاظ على رطوبة سطح الدماغ.
  3. قم بإزالة أي المخزن المؤقت والدم من السطح دورال باستخدام اسفنجة جيلاتين. تطبيق نصائح طبقة رقيقة من 1.0% [اغروس] نقطة انصهار منخفضة (حله في المخزن المؤقت اللحاء) استخدام أصفر. استخدام جهاز كتلة حرارة، الحفاظ على درجة الحرارة من أن الحل [اغروس] في 42 درجة مئوية حتى التطبيق.
    ملاحظة: تجفيف المخزن المؤقت والدم يجب إجراء من جانب اوديما مع الحرص أن الأسفنج الجيلاتين الجاف لا تأتي على اتصال بلده دوراً. عدم القيام بذلك قد تضر بلده دوراً.
  4. تطبيق زجاج جولة ساترة (رقم 1، 3 مم في القطر) على الطبقة [اغروس] هلام. إزالة كافة الفقاعات بين ساترة والطبقة [اغروس] هلام بصب فائض [اغروس] هلام بينهما. إزالة الجل الزائد بارزة من تحت ساترة استخدام الملقط (الشكل 1 و 1E).
  5. تأمين ساترة استخدام الأسمنت الأسنان (الشكل 1F).
  6. مزيج مسحوق الأسمنت والأسمنت السائل. تطبيق هذا الخليط باستخدام النصائح الصفراء قبل أن يصبح وطدت. لا تنطبق الأسنان من الأسمنت على دوراً، لأن هذا قد تلف الدماغ.
  7. إرفاق تيتانيوم عقيمة شريط (العرف، حوالي 30 ملغ، انظر الشكل 1) في عظم الجمجمة باستخدام الأسمنت الأسنان. قم بمحاذاة شريط التيتانيوم وساترة (على السطح لدورا) بالتوازي التقاط الصور بسهولة.
  8. تغطي الجمجمة المكشوفة مع الأسمنت الأسنان (الشكل 1 ح).
  9. استرداد ألجرو من التخدير. يبقيه على سخان (37 درجة مئوية) حتى الأسمنت الأسنان وقد وطدت (ح 1).

4-اثنين-فوتون التصوير

ملاحظة: الصور في فيفو في الشكل 2 تم الحصول عليها باستخدام مجهر اثنين-فوتون مع ليزر ياقوت التيتانيوم (شعاع قطرها [1/ه2]2: 1.2 مم).

  1. تعيين الطول الموجي الليزر اثنين-فوتون. لطلب تقديم العروض الإثارة، استخدام 1,000 نانومتر (450 ميجاوات/مم2 في 400 ميكرون من العمق).
    ملاحظة: ينبغي خفض قوة الليزر كما z-الموقف الذي يتحرك صعودا.
  2. مسح سطح ساترة مع الإيثانول 70%.
  3. تخدير ألجرو باستخدام إيسوفلوراني (2.0%-1.5%)، والتحقق من مستوى التخدير باستخدام اختبار قرصه الذيل.
  4. إرفاق ألجرو للوحة التيتانيوم في مرحلة التصوير باستخدام شريط تيتانيوم على الرأس ألجرو (الشكل 2 ألف و 2 باء). ضبط الرئيس مثل ساترة مواز للعدسة الهدف باستخدام مرحلة جونيوميتير (الشكل 2). الحفاظ على درجة حرارة الجسم ألجرو استخدام لوحة تدفئة (37 درجة مئوية).
  5. تعيين تركيز isoflurane إلى 0.7%-1.0 في المائة.
    ملاحظة: قد يؤدي إلى تركيز عال جداً isoflurane الموت العرضي ألجرو أثناء التصوير.
  6. ضع مرحلة التصوير تحت عدسة الهدف (20 س، غ 1.0) المجهر اثنين-فوتون (الشكل 2 و 2 ج).
  7. تطبيق قطره واحدة من الماء على ساترة. استخدم برنامج التحصين الموسع-الأسفار لتحديد موقع الخلايا العصبية المسماة البروتينات الفلورية في المنطقة حيث تعرضت في بلده دوراً.
  8. الحصول على الصور z-المكدس في فترات 1.4 ميكرومتر. لطبقة تعيين العصبية 4 التصوير، z-العرض إلى 150-300 ميكرون صورة مورفولوجية الجذعية كاملة (الشكل 2D و 2E). استخدام بطيئة والمسح الضوئي والمتوسط للحصول على صور واضحة تبين مورفولوجيا الخلايا العصبية (عادة ما يستغرق > 20 دقيقة اكتساب مورفولوجية الجذعية كاملة).
    ملاحظة: ينصح المعلمات التالية للتصوير. الطول الموجي الإثارة: 1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط، والماسح الضوئي: نوع جلفانومتر، مرآة مزدوج اللون: 690 نانومتر، وتصفية الانبعاثات: 575-620 نانومتر ممر الموجه، وكاشف: نوع جاسب، الحصول على الإعداد > 100، صورة حجم > 512 × 512 ميكرومتر، مجال الرؤية > 600 × 600 ميكرون، بكسل القرار < 1.2 ميكرومتر.

5-التأهيل والتمريض

  1. فصل ألجرو من مرحلة التصوير.
  2. ضع ألجرو على سخان (37 درجة مئوية) ويسمح لها باستعادة (15 دقيقة).
  3. تغذية ألجرو الحليب الدافئ باستخدام ميكروبيبيتي على فترات 2-ح ولطف يحفز المعدة للسماح بإفراز. وتؤكد أن ألجرو هو شرب اللبن بقياس وزن الجسم.

6-إعادة التصوير

  1. تخدير ألجرو مع إيسوفلوراني (1.5-2.0%)، والتحقق من مستوى التخدير باستخدام اختبار قرصه الذيل. نعلق عليه إلى مرحلة التصوير.
  2. تحديد الخلايا العصبية المصورة مسبقاً والحصول على صورة z-مكدس. من السهل تحديد الخلايا العصبية نتيجة لتلك العلامات متفرق مع سوبر نوفا.
  3. كرر الخطوات من 5، 1-6، 2 حتى يتم الانتهاء من التصوير. ملاحظة: يمكن تصويرها ألجرو ما يصل إلى 18 ساعة دون فقدان الوزن.

النتائج

الأرقام في 2D - 2F إظهار نتائج الممثل من تصوير يومين-فوتون الوقت الفاصل بين الخلايا العصبية القشرية طبقة 4 باستخدام هذا البروتوكول. غرض التحليل، حدد الخلايا العصبية مع مورفولوجيا الجذعية واضحة طوال فترات التصوير. قمنا بتحليل مورفولوجية الجذعية من الخلاي?...

Discussion

خطوات حاسمة في البروتوكول واستكشاف الأخطاء وإصلاحها:

أن الخطوة الأكثر أهمية للبروتوكول هو إزالة الجمجمة (الخطوة 3، 2 من البروتوكول). عند الإدراج، تلتزم شفرة حلاقة غالباً دوراً، مما تسبب في نزيف دورال وتلف الدماغ. ويمكن تجنب هذا بإضافة قطره من المخزن المؤقت اللحاء في الجمجمة و?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون ساتو ت. وم. كانباياشي كوياما س. للمساعدة التقنية. JSPS كاكينهي منحة أرقام JP15K14322 و JP16H06143، ومؤسسة العلوم وتاكيدا، مؤسسة النصب التذكاري أوهارا، والتعاونية البحوث المشروع من جامعة نيغاتا الدماغ بحوث المعهد عام 2017-2923 (صاحب الجلالة) وتم تأييد هذا العمل JP16K14559 كاكينهي، JP15H01454، و JP15H04263، ومنحة في البحث العلمي في مجالات الابتكار "التنظيم الديناميكي وظيفة المخ بالخردة وبناء نظام" (JP16H06459) من يأمرون (منظمة الشفافية الدولية).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
pK031. TRE-CreAuthors-Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPREAuthors-Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPREAuthors-Available from authors
IsofluraneWako099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)Univentor8323101
Vetbond (tissue adhesive)3M084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)Sorenson13810
Gelfoam (gelatin sponge)Pfizer09-0353-01
AgaroseSigmaA9793Low melting point
Round-shaped coverslipMatsunami-Custom made
Unifast 2 (dental cement)GC-
Titanium barAuthors-Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)Zoetis-Injectable
2-photon microscopeZeissLSM7MP
Titanium-sapphire laserSpertra-PhysicsMai-Tai eHPDS
Titanium plateAuthors-Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementProBITPLANE
Goniometer stageThorlabsGN2/M

References

  1. Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo. Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).
  2. Grutzendler, J., Kasthuri, N., Gan, W. B. Long-term dendritic spine stability in the adult cortex. Nature. 420 (6917), 812-816 (2002).
  3. Carrillo, J., Nishiyama, N., Nishiyama, H. Dendritic translocation establishes the winner in cerebellar climbing fiber synapse elimination. The Journal of Neuroscience. 33 (18), 7641-7653 (2013).
  4. Portera-Cailliau, C., Weimer, R. M., De Paola, V., Caroni, P., Svoboda, K. Diverse modes of axon elaboration in the developing neocortex. PLoS Biology. , e272 (2005).
  5. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  6. Luo, W., et al. Supernova: A Versatile Vector System for Single-Cell Labeling and Gene Function Studies in vivo. Scientific Reports. 6, 35747 (2016).
  7. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Evidence for activity-dependent cortical wiring: formation of interhemispheric connections in neonatal mouse visual cortex requires projection neuron activity. The Journal of Neuroscience. 27 (25), 6760-6770 (2007).
  8. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Mizuno, H., Hirano, T., Tagawa, Y. Pre-synaptic and post-synaptic neuronal activity supports the axon development of callosal projection neurons during different post-natal periods in the mouse cerebral cortex. European Journal of Neuroscience. 31 (3), 410-424 (2010).
  11. Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  14. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  15. Mizuno, H., et al. Patchwork-Type Spontaneous Activity in Neonatal Barrel Cortex Layer 4 Transmitted via Thalamocortical Projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  16. Zong, H., Espinosa, J. S., Su, H. H., Muzumdar, M. D., Luo, L. Mosaic analysis with double markers in mice. Cell. 121 (3), 479-492 (2005).
  17. Young, P., et al. Single-neuron labeling with inducible Cre-mediated knockout in transgenic mice. Nature Neuroscience. 11 (6), 721-728 (2008).
  18. Liu, J., et al. Neonatal Repeated Exposure to Isoflurane not Sevoflurane in Mice Reversibly Impaired Spatial Cognition at Juvenile-Age. Neurochemical Research. 42 (2), 595-605 (2017).
  19. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. eLIFE. 6, e26839 (2017).
  20. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

140

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved