Vivo에서 신생아 쥐에 있는 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 영상

요약

우리는 현재 vivo에서 2 광자 영상 이미징 신생아 쥐의 대뇌 피 질에 대 한 프로토콜. 이 메서드는 대뇌 피 질의 뉴런, 신경 역학 및 질병 모델에서 신경 역학에 변화를 제어 하는 분자 메커니즘의 발달 역학 분석에 적합 합니다.

초록

두 광자 영상 포유류 두뇌에 있는 신경 회로의 비보에 분석을 위한 강력한 도구입니다. 그러나, vivo에서 화상 진 찰 방법의 제한 된 수 라이브 신생아 포유류의 뇌 조직 검사에 대 한 존재 합니다. 여기 우리 생활 신생아 쥐에 있는 개별 대뇌 피 질의 신경 세포 이미징에 대 한 프로토콜을 요약 합니다. 이 프로토콜 다음 두 가지 방법론을 포함 한다: (1) 초신성 시스템 스파스 하 고 밝은 개발 두뇌에 연약한 신생아 두개골에 대 한 수술 (2)는 대뇌 피 질의 뉴런의 라벨에 대 한. 이 프로토콜에는 높은 신호 대 잡음 비율 신생아 단계 개별 외피 neurites의 시간적 변화 관찰 수 있습니다. 레이블이 지정 된 셀 특정 유전자 침묵 및 녹아웃 RNA 간섭 및 편집 시스템 CRISPR/Cas9 유전자는 초신성을 결합 하 여 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜 수 있습니다, 따라서, 대뇌 피 질의 뉴런, 신경 역학 및 질병 모델에서 신경 역학에 변화를 제어 하는 분자 메커니즘의 개발 역학을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

대뇌 피 질에 있는 신경 회로의 정확한 배선 지 각, 인식, 그리고 학습 및 메모리를 포함 하 여 더 높은 두뇌 기능을 위해 필수적 이다. 대뇌 피 질의 회로 출생 후 개발 하는 동안 동적으로 정제 된 있다입니다. 조직학 대뇌 피 질의 회로 형성을 사용 하 여 프로세스와 문화 분석 생체 외에서 연구 조사 했습니다. 그러나, 생활 포유류에 회로 형성의 역학 미개척 주로 남아 있다.

두 광자 현미경은 성인 마우스 뇌^1,2에 있는 신경 회로의 분석 vivo에서 널리 사용 되었습니다. 그러나, 때문에 기술 과제, 연구의 제한 된 수만 언급 신생아 쥐에 있는 신경 회로 형성. 예를 들어 Carrillo 외. 두 번째 출생 후 주³에서 소 뇌에 섬유를 등반의 시간 경과 영상 수행. Portera-리아우 외. 첫 번째 출생 후 주⁴에서 대뇌 피 질의 레이어 1에에서 축 삭의 영상 보고. 현재 연구에서 우리는 계층 4 대뇌 피 질의 뉴런을 신생아 쥐에 있는 그들의 dendrites의 관찰에 대 한 프로토콜 요약. 두 가지 방법론을 포함,이 프로토콜을 적용 하 여 얻은 결과 우리의 최근 게시⁵에 보고 됩니다. 첫째, 초신성 벡터 시스템^5,6 사용 하 여 개별 신경 신생아 두뇌의 라벨에 대 한. 초신성 시스템에서 신경 라벨에 사용 되는 형광 단백질 교환 및 레이블이 셀 특정 유전자 최저 이며 편집/녹아웃 분석은 또한 가능. 둘째, 우리는 연약한 신생아 쥐에 있는 두개골 창 준비에 대 한 수술을 설명합니다. 함께, 이러한 방법론 신생아 두뇌에 개별 뉴런의 vivo에서 관찰 하실 수 있습니다.

프로토콜

실험은 실험의 기관에 의해 규정 된 동물 복지 지침에 따라 수행 되어야 한다.

1입니다. 영상에 대 한 강아지의 준비

참고: 새끼 띄엄띄엄 레이블이 대뇌 피 질의 뉴런으로 얻어질 수 있다 electroporation (IUE) utero에 의해 초신성 벡터^5,6. 다음 두 벡터의 초신성 시스템 구성: 트 레-Cre, CAG-loxP-정지-loxP-유전자 X-ires-온-WPRE. 이 시스템에 스파스 라벨 트 레 누설에 의존합니다. Transfected 뉴런의 스파스 인구, 트 레 Cre 및 tTA의 약한 식 드라이브. 그 후,이 세포에만 유전자 X 식 온 트 레 사이클의 긍정적인 피드백에 의해 촉진 된다. 달성 스파스 하 고 밝은 라벨 개별 뉴런 비보의 형태학 내용의 시각화 수 있습니다. IUE 절차의 세부 사항에서 설명 하지 않습니다 그들은 때문에이 프로토콜 설명 다른^7,,89,,1011.

1. 타임-임신 쥐 IUE 준비.
2. DNA 솔루션 IUE 준비. RFP와 스파스 라벨에 대 한 pK031:TRE를 포함 하는 솔루션을 사용-Cre (5 ng / µ L) 및 pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ L) 또는 pK031:TRE를 포함 하는 솔루션-Cre (5 ng / µ L) 및 pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ L).
   참고: 벡터의 다른 조합을 사용 하 여 레이블이 지정 된 뉴런에는 다양 한 단백질을 표현할 수 있습니다. 또한, 다양 한 유전자 수 수 노크 다운 또는 노크 아웃 레이블이 셀^5,6 에 구체적으로 (예를 들어, 일련의 벡터 초신성 시스템에 대 한 사용할 수 있습니다 RIKEN 유관 연구소와 Addgene에서).
3. 일반 IUE^7,,89,10,11 대뇌 피 질의 뉴런을 수행 합니다. 레이어 4 뉴런의 라벨에 대 한 배아 하루 14 배아를 사용 합니다.
4. 강아지 배달 및 성장에 대 한 기다립니다.

2입니다. 수술

1. 출생 후 하루-5 (P5) 강아지 isoflurane 가스 (1.0%)를 사용 하 여 anesthetize 마 취의 수준을 확인 꼬리 핀치 테스트를 수행 합니다. 강아지는 핀치에 응답, isoflurane 농도 증가 (최대 2.0%까지) 또는 응답 사라집니다 때까지 기다립니다. 가 열 패드를 사용 하 여 수술 하는 동안 강아지의 체온을 유지 한다.
2. 피하 주사 진통제 (carprofen, 5 mg/kg).
3. 세 번 70% 에탄올으로 그것을 닦아 하 여 두개골을 취재 하는 강아지의 피부를 소독.
4. 약 20 m m² 의 70% 에탄올 (그림 1A)와 소독가 위를 사용 하 여 두개골을 취재 하는 피부를 제거 합니다.
5. 소독된 집게와 깨끗 하 고 멸 균 면봉 (그림 1A)를 사용 하 여 두개골의 근 막을 제거 합니다.
6. 베인된 피부 표면에 로드 팁을 사용 하 여 출혈을 멈추게 하는 조직 접착제를 적용 합니다. 이것은 두개골의 개통 더 어렵게 하기 때문에 이미징 영역 (그림 1B)에 조직 접착제를 적용 되지 않습니다.
7. 생리대 (37 ° C)에 강아지를 놓고 마 취에서 회복 하기 위해 그것을 허용 합니다. 조직 접착제는 건조 및 경화 (약 30 분) 때까지 기다립니다.
8. 필요한 경우 더 많은 조직 접착제를 적용 하 고 건조 하 고 공고히 기다립니다.

3. 두개골 창 준비

1. Isoflurane (1.0%-2.0%)를 사용 하 여 강아지를 anesthetize 하 고 꼬리 핀치 테스트에 의해 마 취 수준을 확인 합니다.
2. 조심 스럽게 경질 그대로 (직경에서 1 m m)를 떠나 소독된 면도날으로 두개골을 열고 (그림 1C). 젤라틴 스폰지를 사용 하 여 (약 < 2 m m³, 소독된가 위를 사용 하 여 작은 조각으로 자르고 적용할 핀셋을 사용 하 여) 피 질 버퍼¹² (125 mmol/L NaCl, 5 mmol/L KCl, 10 mmol/L 포도 당, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl_{2에에서 배어} , 그리고 2 mmol/L MgSO₄; pH 7.4; 300 mOsm/L; 객실 온도) 출혈을 막으려고입니다. 두개골을 열 때 피 버퍼 뇌 표면 축축한 유지에 적용 됩니다.
3. 젤라틴 스폰지를 사용 하 여 경 막 표면에서 어떤 버퍼와 혈액을 제거 합니다. 노란색의 1.0% (피 질 버퍼에 녹아 있는) 낮은 녹는 점 agarose를 사용 하 여 얇은 레이어 팁을 적용 합니다. 열 블록 기계를 사용 하 여 응용 프로그램까지 42 ° C에서 agarose 용액의 온도 유지 합니다.
   참고: 버퍼와 혈액의 배수 건조 젤라틴 스폰지 경질 접촉 하지 않습니다 돌보는 동안 craniotomy의 측면에서 수행 해야 합니다. 이렇게 하지 않으면 두 라를 손상 될 수 있습니다.
4. 라운드 유리 coverslip (제 1 호, 직경에서 3 mm) agarose 젤 레이어에 적용 됩니다. 그들 사이 agarose 젤의 과잉 쏟아 지는 coverslip agarose 젤 레이어 사이의 모든 거품을 제거 합니다. 핀셋 (그림 1D , 1E)를 사용 하 여 하는 coverslip 아래 튀어나온 초과 젤을 제거 합니다.
5. Coverslip 치과 시멘트 (그림 1 층)을 사용 하 여 보호 합니다.
6. 혼합 시멘트 가루와 시멘트 액체. 고형화 된다 전에 노란색 팁을 사용 하 여 혼합물을 적용 합니다. 이 뇌를 손상 시킬 수 있기 때문에 치과 시멘트는 경질에 적용 되지 않습니다.
7. 살 균 티타늄 연결 (사용자 정의 만든, 약 30 mg, 그림 1G참조) 치과 시멘트를 사용 하 여 두개골 뼈에 바. 쉽게 이미지를 캡처하는 동시에 티타늄 바과 (경질 표면)에 coverslip를 맞추십시오.
8. 치과 용 시멘트 (그림 1 H)로 노출 된 두개골을 커버.
9. 마 취에서 강아지를 복구 합니다. 치과 시멘트 (1 시간) 응고가 될 때까지 히터 (37 ° C)에 그것을 유지.

4. 2-광자 이미징

참고: vivo에서 이미지 그림 2 에 티타늄 사파이어 레이저 2 광자 현미경을 사용 하 여 인수 했다 (빔 직경 [1/e²]²: 1.2 m m).

1. 두 광자 레이저 파장을 설정 합니다. RFP 여기, 사용 1000 nm (450 mW/m m² 에서 깊이의 400 µ m).
   참고: z-위치 이동으로 레이저 전원 감소 되어야 한다.
2. 70% 에탄올 coverslip의 표면을 닦으십시오.
3. Isoflurane (1.5-2.0%)를 사용 하 여 강아지를 anesthetize 하 고 꼬리 핀치 테스트를 사용 하 여 마 취 수준을 확인 합니다.
4. (그림 2A 와 2B) 강아지의 머리에 티타늄 막대를 사용 하 여 이미징 단계에 티타늄 플레이트에 강아지를 연결 합니다. coverslip 각도 단계 (그림 2B)를 사용 하 여 대물 렌즈에 평행 하 게 되도록 머리를 조정 합니다. (37 ° C)가 열 패드를 사용 하 여 강아지의 체온을 유지 한다.
5. 0.7%-1.0 %isoflurane 농도를 설정 합니다.
   참고: 매우 높은 isoflurane 농도 이미징 동안 강아지의 우발적인 죽음을 발생할 수 있습니다.
6. (그림 2B 와 2c) 2 광자 현미경의 대물 렌즈 (20 X, 나 1.0)에서 이미징 단계를 놓습니다.
7. coverslip에 물 한 방울을 적용 합니다. 피-형광을 사용 하 여 두 라 노출 되었습니다 영역에서 형광 단백질 분류 뉴런을 찾은.
8. 1.4 µ m 간격 z 스택 이미지를 취득 합니다. 계층에 대 한 이미징, 4 신경 전체 수지상 형태 (그림 2D 와 2E) 이미지를 150-300 µ m z-폭을 설정 합니다. 사용 하 여 느린 스캔 하 고 신경 형태를 보여주는 명확한 이미지를 얻을 평균 (그것은 일반적으로 전체 모 수석 형태를 얻으려고 > 20 분 소요).
   참고: 다음 매개 변수는 이미지에 대 한 것이 좋습니다. 여기 파장: 1000 nm, 스캐너: 검 류 계 유형, dichroic 거울: 690 nm, 방출 필터: 575-620 nm 대역, 검출기: GaAsP 유형 설정 > 100 이득, 이미지 크기 > 512 x 512 µ m, 보기의 필드 > 600 x 600 µ m, 픽셀 해상도 < 1.2 µ m.

5. 복구 및 간호

1. 이미징 단계에서 강아지를 분리 합니다.
2. 강아지를 히터 (37 ° C)에 놓고 (15 분)를 복구할 수 있도록 합니다.
3. 먹이 강아지는 micropipette 2 h 간격 사용 하 여 따뜻한 우유 하 고 부드럽게 배설 수 있도록 복 부를 자극. 강아지의 몸 무게를 측정 하 여 우유 마시고 확인 합니다.

6. 다시 이미징

1. Anesthetize와 isoflurane (1.5-2.0%), 강아지 고 꼬리 핀치 테스트를 사용 하 여 마 취 수준을 확인 합니다. 이미징 단계에 연결 합니다.
2. 이전 이미지 신경 찾아서 z 스택 이미지를 취득 합니다. 뉴런의 식별 초신성으로 라벨링 하는 그들의 부족 때문에 쉽습니다.
3. 이미지 완료 단계 5.1-6.2를 반복 합니다. 참고: 강아지 수 수 몇 군데 18 h까지 무게를 잃지 않고.
   

결과

그림 2D - 2 층 현재 프로토콜을 사용 하 여 레이어 4 대뇌 피 질의 뉴런의 두 광자 시간 경과 화상의 대표적인 결과. 분석을 위해 신경 세포 이미징 기간 내내 분명 수지상 형태와 선택 합니다. 우리는 형태소 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 신경 세포의 수지상 형태 분석. 대표 수지상 형태 재구성 그림 2 층에 표시 됩니?...

토론

프로토콜의 중요 한 단계 문제 해결:

프로토콜의 가장 중요 한 단계는 두개골 (프로토콜 단계 3.2)의 제거 이다. 삽입 시 면도날 종종 경 막 출혈과 뇌 손상을 일으키는 경질을 준수 합니다. 이 두개골에 피 질 버퍼의 한 방울을 추가 하 고 피 질 버퍼에 두개골을 제거 하 여 방지할 수 있습니다.

윈도우의 폐색 이끌어 낸다 두개골 창 준비 후 경질, 피부에서 출?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
pK031. TRE-Cre	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from authors
Isoflurane	Wako	099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)	Univentor	8323101
Vetbond (tissue adhesive)	3M	084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)	Sorenson	13810
Gelfoam (gelatin sponge)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Low melting point
Round-shaped coverslip	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (dental cement)	GC	-
Titanium bar	Authors	-	Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
2-photon microscope	Zeiss	LSM7MP
Titanium-sapphire laser	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Titanium plate	Authors	-	Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M