In Vivo Two-photon Imaging de neurones corticaux en souris néonatales

Résumé

Nous présentons une en vivo biphotonique imagerie protocole d’imagerie du cortex cérébral de souris néonatales. Cette méthode convient pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, les mécanismes moléculaires qui contrôlent la dynamique neuronale et les changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.

Résumé

L’imagerie biphotonique est un outil puissant pour l’analyse in vivo des circuits neuronaux dans le cerveau des mammifères. Cependant, un nombre limité de méthodes d’imagerie in vivo existe pour examiner le tissu cérébral des mammifères nouveau-nés vivants. Dans les présentes, nous résumons un protocole pour l’imagerie des neurones corticaux individuels dans la vie de souris néonatales. Ce protocole comprend les deux méthodes suivantes : (1) le système de Supernova pour l’étiquetage des rares et lumineux des neurones corticaux dans le développement du cerveau et (2) une intervention chirurgicale pour le crâne fragile néonatale. Ce protocole permet l’observation des changements temporels des neurites corticaux différents stades néonatale avec un rapport signal sur bruit élevé. Silençage génique de cellules spécifiques marqué et élimination directe est possible aussi en combinant la Supernova à l’interférence d’ARN et gène CRISPR/Cas9, systèmes de montage. Ce protocole peut, ainsi, être utilisé pour analyser la dynamique du développement des neurones corticaux, mécanismes moléculaires qui régissent la dynamique neuronale et des changements dans la dynamique neuronale dans les modèles de maladies.

Introduction

Le câblage précis des circuits de neurones dans le cortex cérébral est essentiel pour les fonctions cérébrales supérieures y compris la perception, cognition et apprentissage et la mémoire. Des circuits corticaux sont dynamiquement raffinés au développement postnatal. Des études ont étudié le processus d’utilisation de la formation des circuits corticaux histologique et analyses de la culture in vitro . Toutefois, la dynamique de la formation des circuits chez les mammifères vivants est restée pratiquement inexplorée.

Microscopie biphotonique a été largement utilisée pour l’analyse in vivo des circuits neuronaux dans le cerveau de souris adulte^1,2. Toutefois, en raison de difficultés techniques, seulement un nombre limité d’études ont abordé la formation des circuits neuronaux chez des souris nouveau-nées. Par exemple, Carrillo et coll. effectuée l’imagerie Time-lapse de l’escalade des fibres du cervelet dans la deuxième semaine après la naissance³. Portera-Cailliau et coll. ont signalé l’imagerie des axones dans la couche corticale 1 dans la première semaine après la naissance⁴. Dans la présente étude, nous résumons un protocole pour l’observation des neurones corticaux de couche 4 et leurs dendrites chez des souris nouveau-nées. Obtenu par l’application de ce protocole, qui comprend deux méthodes, les résultats sont présentés dans notre récente publication⁵. Tout d’abord, nous utilisons la Supernova vector système^5,6 pour l’étiquetage différents neurones dans le cerveau néonatal. Dans le système de la Supernova, les protéines fluorescentes utilisées pour l’étiquetage neuronale sont échangeables et étiquetées de gène spécifique des cellules et édition/knockout analyses sont également possibles. En second lieu, nous décrivons une procédure chirurgicale pour la préparation de la fenêtre crânienne en souris néonatales fragiles. Ensemble, ces méthodologies permettent l’observation in vivo des différents neurones dans le cerveau néonatal.

Protocole

Des expériences doivent être effectués conformément aux directives prescrites par l’institution de l’expérimentateur bien-être des animaux.

1. préparation des chiots pour l’imagerie

NOTE : Chiots avec des neurones corticaux faiblement marquées peuvent être obtenues par in utero électroporation (IUE) de vecteurs de Supernova^5,6. Le système de la Supernova est constitué des deux vecteurs suivants : TRE-Cre et CAG-loxP-STOP-loxP-Gene X-ires-tTA-WPRE. Dans ce système, clairsemée d’étiquetage s’appuie sur les fuites de TRE. Dans une faible densité de population de neurones transfectées, TRE amène l’expression faible de Cre et tTA. Par la suite, que dans ces cellules, l’expression du gène X est facilitée par une rétroaction positive des cycles tTA-TRE. L’atteint étiquetage clairsemée et lumineux permet la visualisation des détails morphologiques de neurones individuels in vivo. Détails de la procédure de l’IUE ne sont pas décrits dans le présent protocole puisqu’ils ont été décrits ailleurs^7,8,9,10,11.

1. Préparer des souris enceintes chronométré pour IUE.
2. Préparer une solution d’ADN pour IUE. Pour l’étiquetage clairsemée avec DP, utiliser une solution contenant pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) et pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL), ou une solution contenant pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) et pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
   NOTE : Différentes protéines peuvent être exprimées dans les neurones marqués à l’aide de différentes combinaisons de vecteurs. En outre, différents gènes peuvent être démontés ou frappé-out plus précisément dans les cellules marquées^5,6 (par exemple, une série de vecteurs pour le système de Supernova sont disponibles du RIKEN BioResource Research Center et du Addgene).
3. Effectuer régulièrement IUE^7,8,9,10,11 pour étiqueter des neurones corticaux. Pour le marquage des neurones de la couche 4, utilisez embryonnaires J14 embryons.
4. Attendre pour la croissance et de la livraison du chiot.

2. chirurgie

1. Anesthésier postnatal jour 5 (P5) chiot à l’aide de gaz isoflurane (1,0 %). Effectuer un test de queue-pincée pour contrôler le niveau de l’anesthésie. Si le chiot réagit à la pincée, augmenter la concentration de l’isoflurane (jusqu'à 2,0 %) ou attendre jusqu'à ce que disparaisse la réponse. Maintenir la température de corps du chiot pendant une intervention chirurgicale à l’aide d’un coussin chauffant.
2. Injecter par voie sous-cutanée d’analgésique (carprofène, 5 mg/kg).
3. Stériliser la peau du pup couvrant le crâne en l’essuyant avec de l’éthanol 70 % trois fois.
4. Enlever environ 20 mm² de la peau recouvrant le crâne à l’aide de ciseaux stérilisés à l’éthanol à 70 % (Figure 1 a).
5. Enlever le carénage du crâne à l’aide de forceps stérilisé et un coton-tige propre et stérile (Figure 1 a).
6. Appliquez la colle tissu à l’aide de conseils de chargement à la surface de la peau incisée pour arrêter le saignement. Ne pas appliquer de colle tissu vers la zone d’imagerie (Figure 1 b) parce que cela complique l’ouverture du crâne.
7. Placez le chiot sur un coussin chauffant (37 ° C) et lui permettre de récupérer de l’anesthésie. Attendez que la colle tissu a séché et solidifié (environ 30 min).
8. Si nécessaire, appliquez de l’adhésif de tissus plus et attendre qu’il sèche et se solidifier.

3. préparation de fenêtre crânienne

1. Anesthésier le chiot l’isoflurane (de 1,0 à 2,0 %) et vérifier le niveau d’anesthésie par un test de queue-pincement.
2. Ouvrir délicatement le crâne avec une lame de rasoir stérilisée, laissant la dure-mère intacte (1 mm de diamètre) (Figure 1). Utiliser une éponge de gélatine (coupés en petits morceaux, environ 2 mm <³, à l’aide de ciseaux stérilisés et de les appliquer à l’aide de la pince à épiler) trempé dans cortex tampon¹² (125 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L de KCl, 10 mmol/L de glucose, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L ACIC₂ et 2 mmol/L MgSO₄; pH 7,4 ; 300 mOsm/L ; température de la pièce) pour arrêter le saignement. Lors de l’ouverture du crâne, appliquer un tampon de cortex pour garder la surface de cerveau humide.
3. Supprimer n’importe quel tampon et le sang de la surface durale à l’aide d’une éponge de gélatine. Appliquer un conseils de couche mince de 1,0 % faible point de fusion d’agarose (dissoute dans un tampon cortex) à l’aide du jaune. À l’aide d’une machine de bloc de chaleur, maintenir la température de la solution de gel d’agarose à 42° C jusqu'à l’application.
   Remarque : La vidange du tampon et le sang doit être exécutée du côté de la craniotomie tout en prenant soin que l’éponge de gélatine sèche ne vient pas en contact avec la dure-mère. Faute de quoi pourrait endommager la dure-mère.
4. Appliquez une lamelle de verre (n ° 1, 3 mm de diamètre) sur la couche de gel d’agarose. Enlever toutes les bulles entre la lamelle et la couche de gel d’agarose en versant un excès de gel d’agarose entre eux. Retirer le gel excès qui dépassent sous la lamelle à l’aide de la pince à épiler (Figure 1 et 1E).
5. Fixer la lamelle à l’aide de ciment dentaire (Figure 1F).
6. Mélanger la poudre de ciment et le liquide de ciment. Appliquer le mélange à l’aide de pointes jaunes avant il devient solidifié. Ne pas appliquer le ciment dentaire sur la dure-mère, car cela pourrait endommager le cerveau.
7. Attacher un titane stérile bar (faits, environ 30 mg, voir Figure 1) sur l’OS crânien à l’aide de ciment dentaire. Aligner la barre de titane et le couvre-objet (sur la surface de la dure-mère) en parallèle de capturer facilement des images.
8. Couvrir le crâne exposé avec ciment dentaire (Figure 1 H).
9. Récupérer le chiot d’anesthésie. Gardez-le sur un appareil de chauffage (37 ° C) jusqu'à ce que le ciment dentaire se solidifie (1 h).

4. two-photon Imaging

Remarque : Les images in vivo à la Figure 2 ont été acquis à l’aide d’un microscope biphotonique avec un laser titane-saphir (faisceau de diamètre [1/e²]²: 1,2 mm).

1. Définissez la longueur d’onde laser de deux photons. Pour l’excitation de la DP, utilisation de 1 000 nm (450 mW/mm² à 400 µm de profondeur).
   Remarque : La puissance du laser doit être réduite lorsque la position z se déplace vers le haut.
2. Essuyez la surface de la lamelle avec l’éthanol à 70 %.
3. Anesthésier le chiot l’isoflurane (de 1,5 à 2,0 %) et vérifiez le niveau d’anesthésie à l’aide d’un test de queue-pincée.
4. Fixez le chiot à la plaque de titane sur la scène d’imagerie utilisant une barre de titane sur la tête du chiot (Figure 2 a et 2 b). Régler la tête de sorte que la lamelle est parallèle à la lentille de l’objectif à l’aide de l’étape du goniomètre (Figure 2 b). Maintenir la température du corps du chiot à l’aide d’un coussin chauffant (37 ° C).
5. La valeur de la concentration d’isoflurane 0,7 % - 1,0 %.
   Remarque : Une concentration très haute isoflurane peut causer la mort accidentelle du chiot en imagerie.
6. Placer la scène d’imagerie sous la lentille de l’objectif (20 X, NA 1.0) du microscope biphotonique (Figure 2 b et 2C).
7. Appliquer une goutte d’eau sur la lamelle couvre-objet. Épi-fluorescence permet de localiser les neurones marqués au protéine fluorescentes dans la région où la dure-mère a été exposée.
8. Acquisition d’images de z-pile à des intervalles de 1,4 µm. Pour couche 4 neurone d’imagerie, la valeur du z-largeur 150-300 µm d’imager la morphologie dendritique entière (Figure 2D et 2E). Utilisation lente numérisation et une moyenne pour obtenir des images claires montrant la morphologie neuronale (il faut généralement > 20 min d’acquérir l’ensemble morphologie dendritique).
   Remarque : Les paramètres suivants sont recommandés pour l’imagerie. Longueur d’onde excitation : 1 000 nm, scanner : type de galvanomètre, miroir dichroïque : 690 nm, filtre d’émission : 575-620 nm passe-bande, détecteur : GaAsP type, gain réglage > 100, image taille > 512 x 512 µm, champ de vision > 600 x 600 µm, pixel résolution < 1,2 µm.

5. rétablissement et soins infirmiers

1. Détacher le chiot dès le stade d’imagerie.
2. Placez le chiot sur un appareil de chauffage (37 ° C) et laissez-le à récupérer (15 min).
3. Nourrir le chiot lait tiède à l’aide d’une micropipette à intervalles de 2 h et stimuler doucement l’estomac pour permettre l’excrétion. Confirmer que le chiot boit du lait en mesurant sa masse corporelle.

6. Re-imaging

1. Anesthésier le chiot à l’isoflurane (2,0 % - 1,5 %) et vérifiez le niveau d’anesthésie à l’aide d’un test de queue-pincée. Attachez-le à l’étape d’imagerie.
2. Recherchez les neurones déjà imagés et acquérir une image de z-pile. L’identification des neurones est facile en raison de leur étiquetage clairsemée avec Supernova.
3. Répétez les étapes 5.1-6.2 jusqu'à ce que l’imagerie est terminée. Remarque : Le chiot peut être photographié jusqu'à 18 h, sans perdre du poids.
   

Résultats

Personnages 2D - 2F afficher les résultats représentatifs de l’imagerie Time-lapse deux photons de neurones corticaux de couche 4 à l’aide du présent protocole. Aux fins d’analyse, sélectionnez les neurones avec une morphologie dendritique clair pendant les périodes d’imagerie. Nous avons analysé la morphologie dendritique des neurones imagés à l’aide de logiciels d’analyse morphologique. Reconstruction de morphologie dendritique repr...

Discussion

Des étapes cruciales dans le protocole et le dépannage :

L’étape la plus critique du protocole est l’ablation du crâne (étape 3.2 du protocole). Lors de l’insertion, la lame de rasoir adhère souvent à la dure-mère, provoquant des saignements dural et des dommages au cerveau. Cela peut être évité en ajoutant une goutte de tampon de cortex sur le crâne et en supprimant le crâne dans un tampon de cortex.

Hémorragie de la dure-mère et la peau après q...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
pK031. TRE-Cre	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from authors
Isoflurane	Wako	099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)	Univentor	8323101
Vetbond (tissue adhesive)	3M	084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)	Sorenson	13810
Gelfoam (gelatin sponge)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Low melting point
Round-shaped coverslip	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (dental cement)	GC	-
Titanium bar	Authors	-	Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
2-photon microscope	Zeiss	LSM7MP
Titanium-sapphire laser	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Titanium plate	Authors	-	Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M