体内新生小鼠皮层神经元的双光子成像

摘要

我们提出了一种用于成像新生小鼠大脑皮层的活体双光子成像协议。该方法适用于分析皮层神经元的发育动态、控制神经元动力学的分子机制以及疾病模型神经元动力学的变化。

摘要

双光子成像是一种强大的工具, 用于体内分析哺乳动物大脑中的神经元电路。然而, 存在着有限数量的活体成像方法来检查活的新生哺乳动物的脑组织。本文综述了一种用于活体新生小鼠单个皮层神经元成像的协议。本议定书包括以下两种方法: (1) 在发育中脑皮层神经元稀疏和明亮标记的超新星系统, 以及 (2) 易碎新生儿颅骨的外科手术。该协议允许在高信噪比的新生儿阶段观察单个皮质突起的时间变化。通过将超新星与 RNA 干扰和 CRISPR/Cas9 基因编辑系统相结合, 也可以实现标记细胞特异基因的沉默和挖空。因此, 该协议可用于分析皮层神经元的发展动态、控制神经元动力学的分子机制, 以及疾病模型中神经元动力学的变化。

引言

脑皮层神经元电路的精确布线对于更高的大脑功能 (包括知觉、认知、学习和记忆) 至关重要。皮质电路在产后发育过程中动态地被提炼。通过组织学和体外培养分析, 研究了皮层电路的形成过程。然而, 活哺乳动物中的电路形成的动力学仍然主要是未知的。

双光子显微术已广泛应用于成人小鼠脑^1、2神经元回路的体内分析。然而, 由于技术上的挑战, 只有有限数量的研究解决了新生小鼠神经元回路的形成。例如, Carrillo et 等执行了在第二个产后周³的小脑中攀爬纤维的延时成像。Portera-他等报道了第一个产后周⁴皮层层1的轴突成像。在本研究中, 我们总结了一个协议, 观察4层皮层神经元及其在新生小鼠的树突。在我们最近发表的⁵号出版物中报告了应用本议定书所获得的结果, 其中包括两种方法。首先, 我们使用超新星矢量系统^5,6用于标记新生儿大脑中的单个神经元。在超新星系统中, 用于神经元标记的荧光蛋白是可交换的, 标记细胞特异基因敲除和编辑/挖空分析也是可能的。其次, 我们描述了在脆弱的新生小鼠颅窗准备的外科手术。这些方法结合在一起, 允许在体内观察新生儿大脑中的单个神经元。

研究方案

实验应按照实验机构规定的动物福利准则进行。

1. 制备用于成像的幼崽

注意: 有稀疏标记的皮层神经元的幼崽可通过超新星载体^5,6的子宫电穿孔 (井植敏) 获得。超新星系统由以下两个载体组成: TRE-转基因-转基因-ires-WPRE。在该系统中, 稀疏标记依赖于 TRE 泄漏。在转染神经元的稀疏种群中, TRE 驱动了 Cre 和 tTA 的弱表达。随后, 只有在这些细胞中, 基因 X 的表达通过 tTA-TRE 循环的正反馈来促进。所实现的稀疏和明亮的标签允许在体内的个体神经元的形态学细节的可视化。井植敏程序的详细信息未在本协议中描述, 因为它们已在别处描述过^{7、8、9、10、11}。

1. 为井植敏准备定时怀孕的小鼠。
2. 为井植敏准备 DNA 溶液。对于带有 RFP 的稀疏标签, 请使用包含 pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) 和 pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) 的解决方案或包含 pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) 和 pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) 的解决方案。
   注: 各种蛋白质可以用不同的载体组合在标记神经元中表达。此外, 各种基因可以被击倒或被敲出专门在标记的细胞^5,6 (例如, 一系列的超新星系统的矢量可从理研生物资源研究中心和从 Addgene)。
3. 执行常规井植敏^7,8,9,10,11标签皮层神经元。对于4层神经元的标记, 使用胚胎 day-14 胚胎。
4. 等待幼崽的分娩和成长。

2. 手术

1. 使用异氟醚气体 (1.0%) 麻醉产后 day-5 (P5) 幼崽。执行尾部捏试验检查麻醉水平。如果幼崽响应捏, 增加异氟醚浓度 (高达 2.0%) 或等待, 直到反应消失。使用加热垫在手术过程中保持幼崽的体温。
2. 皮下注射镇痛药 (卡洛芬, 5 毫克/千克)。
3. 用70% 乙醇擦拭三次, 对小狗的皮肤进行消毒。
4. 使用70% 乙醇灭菌的剪刀去除大约20毫米²的皮肤覆盖头骨 (图 1A)。
5. 使用灭菌钳和干净、无菌棉签 (图 1A) 去除颅骨筋膜。
6. 应用组织粘合剂使用加载提示到锐裂的皮肤表面停止出血。不要将组织粘合剂应用于成像区域 (图 1B), 因为这使得颅骨的开口更加困难。
7. 将小狗放在加热垫上 (37 摄氏度), 并允许它从麻醉中恢复。等待, 直到组织粘合剂干燥和凝固 (约30分钟)。
8. 如有必要, 应用更多的纸巾, 等待它干燥和凝固。

3. 颅骨窗准备

1. 使用异氟醚 (1.0%-2.0%) 麻醉小狗, 并通过尾部捏试验检查麻醉水平。
2. 小心地打开头骨与消毒剃刀刀片留下硬脑膜完好 (直径1毫米) (图 1C)。使用明胶海绵 (切成小块, 约 < 2 毫米³, 使用灭菌剪刀, 并用镊子) 浸泡在皮质缓冲液¹² (125 毫摩尔/l 氯化钠, 5 毫摩尔/l 氯化钾, 10 毫摩尔/升葡萄糖, 10 毫摩尔/升 HEPES, 2 毫摩尔/升 CaCl₂和2毫摩尔 MgSO₄;pH 值 7.4;300 mOsm/升;室温) 止血。当打开头骨时, 应用皮质缓冲液保持大脑表面湿润。
3. 使用明胶海绵去除硬脑膜表面的任何缓冲液和血液。使用黄色提示应用薄层1.0% 低熔点琼脂糖 (溶于皮质缓冲液)。使用热块机, 保持琼脂糖溶液在42°C 的温度, 直到应用。
   注意: 缓冲液和血液的排泄必须从开颅手术的一侧进行, 同时注意干性明胶海绵不会接触硬脑膜。否则可能会损坏硬脑膜。
4. 将圆形玻璃盖玻片 (直径为1、3 mm) 涂在琼脂糖凝胶层上。在盖玻片和琼脂糖凝胶层之间倒入过量的琼脂糖凝胶, 去除所有气泡。用镊子从盖玻片下凸出多余的凝胶 (图 1D和1E)。
5. 使用牙科水泥固定盖玻片 (图 1F)。
6. 混合水泥粉和水泥液。在凝固前使用黄色尖端涂抹混合物。不要在硬脑膜上应用牙科水泥, 因为这可能会损害大脑。
7. 使用牙科水泥将无菌钛棒 (定制, 约30毫克, 见图 1G) 在颅骨骨上附着。平行对齐钛条和盖玻片 (硬脑膜表面), 轻松捕捉图像。
8. 用牙科水泥覆盖裸露的头骨 (图 1H)。
9. 从麻醉中恢复幼崽。保持在加热器 (37 摄氏度), 直到牙科水泥凝固 (1 小时)。

4. 双光子成像

注:图 2 中的体内图像是使用带有钛蓝宝石激光器的双光子显微镜 (光束直径 [1/e²]²: 1.2 mm) 获得的。

1. 设置双光子激光波长。对于 RFP 激励, 使用 1000 nm (450 mW/毫米²在400µm 深度)。
   注意: 当 z 位置向上移动时, 激光功率应减小。
2. 用70% 乙醇擦拭盖玻片表面。
3. 使用异氟醚 (1.5%-2.0%) 麻醉小狗, 用尾部捏试验检查麻醉水平。
4. 使用小狗头上的钛条 (图 2A和2B) 将幼崽连接到成像台上的钛板上。调整头部, 使盖玻片与物镜平行, 使用测角器阶段 (图 2B)。使用加热垫 (37 摄氏度) 保持幼崽的体温。
5. 将异氟醚浓度设置为 0.7%-1.0%。
   注意: 极高的异氟醚浓度可能导致小狗在成像过程中意外死亡。
6. 将成像阶段置于双光子显微镜 (图 2B和2C) 的物镜透镜 (20X, NA 1.0) 下。
7. 将一滴水涂在盖玻片上。使用 epi 荧光在硬脑膜暴露的区域找到荧光蛋白标记的神经元。
8. 以1.4 µm 的间隔获取 z 堆栈图像。对于4层神经元成像, 将 z 宽度设置为 150-300 µm, 以图像整个树突状形态学 (图 2D和2E)。使用慢速扫描和平均值获取清晰的图像, 显示神经元形态学 (通常需要 > 20 分钟才能获得整个树突形态)。
   注意: 建议使用以下参数进行成像。激发波长: 1000 nm, 扫描仪: 振镜类型, 分色镜: 690 nm, 排放滤波器: 575-620 nm 带通, 探测器: GaAsP 类型, 增益设置 > 100, 图像大小 > 512 x 512 µm, 视场 > 600 x 600 µm, 像素分辨率 < 1.2 µm。

5. 康复和护理

1. 从成像阶段分离幼崽。
2. 将小狗放在加热器上 (37 摄氏度), 让它恢复 (15 分钟)。
3. 用2小时间隔的微量吸管喂幼崽温热的牛奶, 轻轻刺激胃, 使其排泄。确认幼崽通过测量其体重来饮用牛奶。

6. 重新成像

1. 麻醉的小狗与异氟醚 (1.5%-2.0%), 并检查麻醉水平使用尾部捏试验。将其附加到成像阶段。
2. 找到先前成像的神经元并获取 z 堆栈图像。由于其稀疏的超新星标记, 神经元的识别很容易。
3. 重复步骤 5.1-6.2, 直到映像完成。注意: 小狗可以成像高达18小时, 而不会失去重量。
   

结果

图 2D - 2F显示了使用本协议的4层皮层神经元双光子时移成像的代表性结果。为了分析, 在整个成像周期中选择具有清晰树突状形态学的神经元。利用形态学分析软件对成像神经元的树突形态学进行了分析。代表性的树突形态学重建如图 2F所示。显示断开连接的树突的神经元 (图 2G) 应排除在分析之外, 因?...

讨论

协议和故障排除中的关键步骤:

该协议最关键的步骤是删除头骨 (协议步骤 3.2)。插入时, 刀片通常附着硬脑膜, 导致硬脑膜出血和大脑损伤。这可以避免通过添加一滴皮质缓冲液在头骨和删除头骨在皮质缓冲区。

颅窗准备后, 硬脑膜和皮肤出血导致窗口闭塞。为了避免这种, 在继续下一步之前, 应允许使用组织粘合剂和牙科水泥完全干燥。由于很难完全避免出...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
pK031. TRE-Cre	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from authors
Isoflurane	Wako	099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)	Univentor	8323101
Vetbond (tissue adhesive)	3M	084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)	Sorenson	13810
Gelfoam (gelatin sponge)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Low melting point
Round-shaped coverslip	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (dental cement)	GC	-
Titanium bar	Authors	-	Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
2-photon microscope	Zeiss	LSM7MP
Titanium-sapphire laser	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Titanium plate	Authors	-	Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M