In Vivo Zwei-Photon Imaging der kortikalen Neuronen bei Neugeborenen Mäusen

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine in Vivo zwei-Photon imaging-Protokoll für die Belichtung der Hirnrinde des Neugeborenen Mäusen. Diese Methode ist geeignet für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und die Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen steuern.

Zusammenfassung

Zwei-Photon Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die in-Vivo -Analyse der neuronalen Schaltkreise im Gehirn von Säugetieren. Jedoch gibt es eine begrenzte Anzahl von in Vivo bildgebende Verfahren für die Prüfung des Hirngewebes live Neugeborenen Säugetiere. Hier fassen wir ein Protokoll zur Aufnahme einzelner kortikaler Neuronen in lebenden Neugeborenen Mäusen. Dieses Protokoll enthält die folgenden beiden Methoden: (1) der Supernova-System zur spärlich und helle Beschriftung der kortikalen Neuronen in das sich entwickelnde Gehirn und (2) ein chirurgischer Eingriff für die fragile neonatale Schädel. Dieses Protokoll ermöglicht die Beobachtung des zeitlichen Veränderungen der einzelnen kortikalen Neuriten in neonatale Phase mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Beschriftete Zelle-spezifischen gen-silencing und Knockout können auch erreicht werden, indem die Supernova mit RNA-Interferenz und CRISPR/Cas9 gen Schnittsysteme. Dieses Protokoll kann so verwendet werden, für die Analyse der Entwicklungs Dynamik der kortikalen Neuronen, die molekularen Mechanismen, die die neuronale Dynamik und Veränderungen in der neuronalen Dynamik in Krankheitsmodellen zu kontrollieren.

Einleitung

Die genaue Verdrahtung von neuronalen Schaltkreisen in der Großhirnrinde ist unerlässlich für die höheren Hirnfunktionen wie Wahrnehmung, Kognition, und lernen und Gedächtnis. Kortikale Schaltungen werden während der postnatalen Entwicklung dynamisch verfeinert. Studien haben den Prozess der kortikalen Schaltung Bildung mit histologischen und in-vitro- Kultur-Analysen untersucht. Allerdings hat die Dynamik der Schaltung Bildung in lebenden Säugetieren meist unerforscht.

Zwei-Photonen-Mikroskopie hat für die in Vivo -Analyse der neuronalen Schaltkreise im Gehirn Erwachsener Mäuse^1,2verbreitet worden. Aufgrund technischen Herausforderungen, haben jedoch nur eine begrenzte Anzahl von Studien neuronale Schaltkreis Bildung bei Neugeborenen Mäusen angesprochen. Carrillo Et Al. durchgeführt zum Beispiel die Zeitraffer-Bildgebung des Kletterns Fasern im Kleinhirn im zweiten postnatalen Woche³. Tür-Cailliau Et Al. berichteten die Bildgebung der Axone in kortikalen Schicht 1 in der ersten postnatalen Woche⁴. In der vorliegenden Studie fassen wir ein Protokoll für die Beobachtung der Schicht 4 kortikalen Neuronen und ihre Dendriten bei Neugeborenen Mäusen. Ergebnisse, die durch die Anwendung dieses Protokolls, die zwei Methoden umfasst, werden in unseren jüngsten Veröffentlichung⁵gemeldet. Erstens verwenden wir die Supernova Vektor System^5,6 zur Kennzeichnung einzelner Neuronen im neonatalen Gehirn. Im Supernova System fluoreszierende Proteine verwendet für die neuronale Kennzeichnung sind austauschbar und beschriftete Zelle-spezifischen gen-Knockdown und Bearbeitung/ko Analysen sind ebenfalls möglich. Zweitens, beschreiben wir einen chirurgischen Eingriff für die Vorbereitung der kranialen Fenster in fragilen Neugeborenen Mäusen. Zusammen ermöglichen diese Methoden die in Vivo -Beobachtung von einzelnen Neuronen im neonatalen Gehirn.

Protokoll

Experimente sollten gemäß den Tierschutz-Richtlinien vorgeschrieben durch den Experimentator Institution durchgeführt werden.

1. Vorbereitung der Welpen für die Bildgebung

Anmerkung: Welpen mit spärlich beschrifteten kortikale Neuronen in Utero Elektroporation (IUE) Supernova Vektoren^5,6erhalten Sie durch. Das Supernova-System besteht aus den folgenden beiden Vektoren: TRE-Cre und CAG-LoxP-STOP-LoxP-Gene X-Ires-tTA-WPRE. In diesem System setzt die spärlich Kennzeichnung auf TRE Leckage. In einem dünn besiedelten transfizierten Neuronen treibt TRE den schwachen Ausdruck von Cre und tTA. Anschließend wird nur in diesen Zellen die Expression des Gens X durch ein positives Feedback der tTA-TRE Zyklen erleichtert. Die erzielten spärlich und hellen Kennzeichnung ermöglicht die Visualisierung der morphologischen Details von einzelnen Neuronen in Vivo. Einzelheiten des Verfahrens IUE nicht beschrieben werden an anderer Stelle beschrieben dieses Protokoll, da diese wurden^7,8,9,10,11.

1. IUE timed-schwangeren Mäusen vorbereiten.
2. Bereiten Sie eine DNA-Lösung für IUE. Für die spärliche Beschriftung mit RFP, verwenden Sie eine Lösung mit pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) und pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL) oder einer Lösung, die pK031:TRE-Cre (5 ng/µL) und pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µg/µL).
   Hinweis: Verschiedene Proteine können in den beschrifteten Neuronen mit unterschiedlichen Kombinationen von Vektoren ausgedrückt werden. Auch verschiedene Gene können angeliefert oder herausgetrennten speziell in beschrifteten Zellen^5,6 (z. B.eine Reihe von Vektoren für die Supernova-System sind aus RIKEN BioResource Research Center und Addgene).
3. Führen Sie regelmäßige IUE^7,8,9,10,11 um kortikale Neuronen zu beschriften. Verwenden Sie für die Kennzeichnung der Schicht 4 Neuronen, embryonale 14. Tag Embryonen.
4. Warten Sie auf Welpen Lieferung und Wachstum.

2. Operation

1. Die postnatalen Tag 5 (P5) Welpen mit Isofluran Gas (1,0 %) zu betäuben. Durchführen Sie einen Tail-Prise Test überprüfen Sie die Höhe der Anästhesie. Wenn der Welpe auf die Prise reagiert, die Isofluran Konzentration erhöhen (bis zu 2,0 %) oder warten, bis die Antwort verschwindet. Pflegen Sie die Pup Körpertemperatur während der Operation mit einem Heizkissen.
2. Analgetikum (Carprofen, 5 mg/kg) subkutan zu injizieren.
3. Der Welpe Haut des Schädels durch Abwischen mit 70 % igem Ethanol dreimal zu sterilisieren.
4. Entfernen Sie etwa 20 mm² der Haut über den Schädel mit einer Schere mit 70 % igem Ethanol (Abbildung 1A) sterilisiert.
5. Entfernen Sie die Faszie des Schädels mit sterilisierte Pinzette und ein sauberes, steriles Wattestäbchen (Abbildung 1A).
6. Gewebe-Adhäsiv mit Beladung Tipps zur eingeschnittenen Hautoberfläche, um die Blutung zu stoppen. Gelten Sie Gewebe-Klebeband nicht für die imaging-Bereich (Abbildung 1 b), weil dies die Öffnung des Schädels erschwert.
7. Der Welpe auf ein Heizkissen (37 ° C) und lassen Sie es aus der Narkose zu erholen. Warten Sie, bis die Gewebe-Klebeband ist getrocknet und verfestigt (ca. 30 min).
8. Falls erforderlich, tragen Sie mehr Gewebe Klebstoff auf und warten Sie, bis es zu trocknen und zu festigen.

(3) kranialen Fenster Vorbereitung

1. Betäuben Sie der Welpe mit Isofluran (1,0-2,0 %) zu und kontrollieren Sie die Narkose-Ebene Schweif kneiftest.
2. Öffnen Sie vorsichtig den Schädel mit einer sterilisierten Rasierklinge verlassen die Dura intakt (1 mm Durchmesser) (Abbildung 1). Verwenden Sie einen Schwamm Gelatine (in kleine Stücke schneiden, etwa 2 mm <³, mit einer sterilisierten Schere, und wenden Sie sie mit einer Pinzette) getränkt in Kortex Puffer¹² (125 Mmol/L NaCl, 5 Mmol/L KCl, 10 Mmol/L Glucose, 10 Mmol/L HEPES, 2 Mmol/L CaCl₂ , und 2 Mmol/L MgSO₄; pH 7.4; 300 mOsm/L; Raumtemperatur) um die Blutung zu stoppen. Wenn Sie den Schädel öffnen, gelten Sie einen Cortex-Puffer, um das Gehirn Oberfläche feucht zu halten.
3. Entfernen Sie Puffer und Blut aus der duralen Oberfläche mit einem Gelatine-Schwamm. Gelten Sie eine dünne Schicht von 1,0 % niedriger Schmelzpunkt Agarose (aufgelöst im Kortex Puffer) mit gelben Tipps. Behalten Sie die Temperatur der Agarose-Lösung bei 42° C mit einer Wärme-Block-Maschine, bis Anwendung.
   Hinweis: Die Trockenlegung des Puffers und Blut muss seitens des Kraniotomie während die Pflege durchgeführt werden, das trockene Gelatine Schwamm nicht in Kontakt mit der Dura kommt. Andernfalls kann die Dura beschädigt werden.
4. Eine Runde Glas-Deckglas (Nr. 1, 3 mm im Durchmesser) auf die Agarose-Gel-Schicht auftragen. Entfernen Sie alle Luftblasen zwischen dem Deckglas und der Agarose-Gel-Schicht durch ein Übermaß an Agarosegel dazwischen Gießen. Entfernen Sie das überschüssige Gel hervorstehende unter dem Deckglas mit einer Pinzette (Abbildung 1 und 1E).
5. Sichern Sie das Deckglas mit dental Zement (Abb. 1F).
6. Mischen Sie das Zementpulver und Flüssigkeit Zement. Übernehmen Sie die Mischung mit gelben Spitzen, bevor es verfestigt wird. Gelten Sie dental Zement auf der Dura, nicht, da dies das Gehirn schädigen kann.
7. Legen Sie eine sterile Titan bar (Sonderanfertigung, ca. 30 mg, siehe Abbildung 1) auf die Schädelknochen mit dental Zement. Richten Sie die Titan-Bar und das Deckglas (auf der Oberfläche der Dura) parallel, Bilder zu erfassen.
8. Decken Sie den freigelegten Schädel mit dental Zement (Abbildung 1 H).
9. Der Welpe aus der Narkose zu erholen. Halten Sie es auf eine Heizung (37 ° C), bis der dental Zement (1 h) erstarrt ist.

4. zwei-Photon Imaging

Hinweis: Die in-Vivo -Bilder in Abbildung 2 erworben wurden mit einem zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Titan-Saphir-Laser (beam Durchmesser [1/e²]²: 1,2 mm).

1. Legen Sie die zwei-Photonen-Laser-Wellenlänge. RFP Erregung, Nutzung 1.000 nm (450 mW/mm² 400 µm Tiefe).
   Hinweis: Die Laserleistung sollte reduziert werden, als die Z-Position sich bewegt.
2. Wischen Sie die Oberfläche des Deckglases mit 70 % Ethanol.
3. Der Welpe mit Isofluran (1,5-2,0 %) zu betäuben und Anästhesie mit einem Heck-Pinch-Test überprüfen.
4. Befestigen Sie die Welpen die Titanplatte am der bildgebenden Bühne mit einer Titan-Bar auf der Welpe Kopf (Abb. 2A und 2 b). Passen Sie den Kopf, so dass das Deckglas ist parallel zu der Objektivlinse mit Goniometer Stage (Abb. 2 b). Pflegen Sie die Körpertemperatur des Welpen mit einem Heizkissen (37 ° C).
5. Legen Sie die Isofluran-Konzentration auf 0,7 % - 1,0 %.
   Hinweis: Eine sehr hohe Isofluran-Konzentration kann Unfalltod des Welpen während der Bildgebung führen.
6. Legen Sie die bildgebende Bühne unter das Objektiv (20 X, NA 1.0) die zwei-Photonen-Mikroskop (Abb. 2 b und 2 C).
7. Beantragen Sie einen Tropfen Wasser auf das Deckglas. Verwenden Sie Epi-Fluoreszenz, um die fluoreszierenden Protein-Label Neuronen im Bereich zu finden, die Dura in Berührung kommt.
8. Z-Stapel Bilder 1,4 µm Abständen zu erwerben. Schicht stellen 4 Neuron imaging, die Z-Breite von 150-300 µm, die gesamte dendritische Morphologie (Abb. 2D und 2E) Bild. Verwendung langsamer Scannen und im Durchschnitt um klare Bilder zeigen die neuronale Morphologie zu erhalten (Dies dauert in der Regel > 20 min, die gesamte dendritische Morphologie zu erwerben).
   Hinweis: Die folgenden Parameter sind für die Bildgebung empfohlen. Erregung Wellenlänge: 1.000 nm, Scanner: Galvanometer Typ, dichroitischen Spiegel: 690 nm, Emission Filter: 575-620 nm Bandpass, Detektor: GaAsP Typ Einstellung > 100 gewinnen, Bild-Größe > 512 x 512 µm, Sichtfeld > 600 x 600 µm, Pixel Auflösung < 1,2 µm.

(5) Erholung und Pflege

1. Der Welpe von der bildgebenden Bühne zu lösen.
2. Platzieren Sie den Welpen auf eine Heizung (37 ° C) und lassen Sie es zu erholen (15 min).
3. Feed der Welpe warmen Milch mit einer Mikropipette in 2-h-Intervallen und sanft stimulieren den Magen um Ausscheidung zu ermöglichen. Bestätigen Sie, dass der Welpe Milch trinkt durch die Messung seines Körpergewichts.

(6) Re-imaging

1. Der Welpe mit Isofluran (1,5-2,0 %), zu betäuben und Anästhesie mit einem Heck-Pinch-Test überprüfen. Die bildgebenden Stufe zuordnen.
2. Suchen Sie die zuvor abgebildeten Neuronen und erwerben Sie eine Z-Stapel-Bild zu. Die Identifizierung von Neuronen ist einfach aufgrund ihrer spärlichen Etikettierung mit Supernova.
3. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-6.2 bis Bildbearbeitung abgeschlossen ist. Hinweis: Der Welpe kann bis zu 18 h abgebildet werden, ohne Gewicht zu verlieren.
   

Ergebnisse

Figuren-2D - 2F zeigen repräsentative Ergebnisse der zwei-Photonen Zeitraffer Bildgebung der Schicht 4 kortikale Neuronen unter Verwendung dieses Protokolls. Wählen Sie zum Zwecke der Analyse Neuronen mit klaren dendritischen Morphologie in der bildgebenden Epochen. Wir analysieren die dendritische Morphologie des abgebildeten Neuronen mit morphologischen Analysesoftware. Repräsentative dendritischen Morphologie Rekonstruktion zeigt

Diskussion

Wichtige Schritte im Protokoll und Fehlerbehebung:

Der wichtigste Schritt des Protokolls ist die Entfernung des Schädels (Protokoll Schritt 3.2). Beim einsetzen hält sich die Rasierklinge häufig an der Dura, durale Blutungen und Schädigung des Gehirns verursacht. Dies kann vermieden werden, durch Hinzufügen von einen Tropfen des Kortex Puffer auf den Schädel und Entfernen des Schädels im Kortex Puffer.

Blutungen aus der Dura und der Haut nach der kranialen Fenst...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
pK031. TRE-Cre	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from authors
Isoflurane	Wako	099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)	Univentor	8323101
Vetbond (tissue adhesive)	3M	084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)	Sorenson	13810
Gelfoam (gelatin sponge)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Low melting point
Round-shaped coverslip	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (dental cement)	GC	-
Titanium bar	Authors	-	Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
2-photon microscope	Zeiss	LSM7MP
Titanium-sapphire laser	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Titanium plate	Authors	-	Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M