In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Riepilogo

Presentiamo un in vivo imaging protocol per la corteccia cerebrale di topi neonatali di imaging due fotoni. Questo metodo è adatto per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, i meccanismi molecolari che controllano le dinamiche neuronali e i cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.

Abstract

Imaging del due-fotone è un potente strumento per l'analisi in vivo di circuiti neuronali nel cervello dei mammiferi. Tuttavia, un numero limitato di metodi di imaging in vivo esiste per l'esame del tessuto di cervello di mammiferi neonati dal vivo. Qui riassumiamo un protocollo per l'imaging di singoli neuroni corticali in topi neonatali vivente. Questo protocollo comprende le seguenti due metodologie: (1) il sistema di Supernova per radi e luminosi etichettatura dei neuroni corticali nel cervello in via di sviluppo e (2) una procedura chirurgica per il fragile cranio neonatale. Questo protocollo permette l'osservazione dei cambiamenti temporali dei singoli neurites corticali durante fasi neonatale con un elevato rapporto segnale-rumore. Con etichetta cellula-specifico del silenziamento genico e knockout può essere ottenute anche combinando la Supernova con gene CRISPR/Cas9 sistemi di editing e di interferenza del RNA. Questo protocollo può, quindi, essere utilizzato per analizzare la dinamica dello sviluppo dei neuroni corticali, meccanismi molecolari che controllano la dinamica neuronale e cambiamenti nella dinamica neuronale in modelli di malattia.

Introduzione

Il cablaggio preciso di circuiti neuronali nella corteccia cerebrale è essenziale per le funzioni cerebrali superiori tra cui percezione, cognizione e apprendimento e memoria. Circuiti corticali sono dinamicamente raffinati durante lo sviluppo postnatale. Studi hanno studiato il processo di utilizzo di circuito corticale formazione istologica e analisi di coltura in vitro . Tuttavia, le dinamiche di formazione del circuito in mammiferi viventi sono rimasta per lo più inesplorata.

Microscopia del due-fotone è stato ampiamente utilizzata per le analisi in vivo di circuiti neuronali al cervello di topo adulto^1,2. Tuttavia, a causa di problemi tecnici, solo un limitato numero di studi hanno affrontato la formazione di circuiti neuronali in topi neonati. Ad esempio, Carrillo et al. eseguita l'imaging time-lapse di arrampicata fibre nel cervelletto in seconda settimana postnatale³. Portera-Cailliau et al ha segnalato l'imaging degli assoni in strato corticale 1 nel primo postnatale settimana⁴. Nello studio presente, riassumiamo un protocollo per l'osservazione dei neuroni corticali di livello 4 e loro dendriti in topi neonati. Risultati ottenuti dall'applicazione del presente protocollo, che comprende due metodologie, sono riportati nella nostra recente pubblicazione⁵. In primo luogo, utilizziamo la Supernova vettore sistema^5,6 per le etichette dei singoli neuroni nel cervello neonatale. Nel sistema Supernova, le proteine fluorescenti utilizzate per l'etichettatura di un neurone sono atterramento intercambiabili e con etichetta gene cellula-specifico e analisi di modifica/eliminazione diretta sono anche possibili. In secondo luogo, descriviamo una procedura chirurgica per la preparazione di finestra cranica in topi neonatali fragili. Insieme, queste metodologie consentono l'osservazione in vivo di singoli neuroni nel cervello neonatale.

Protocollo

Gli esperimenti devono essere eseguiti in conformità delle direttive sul benessere degli animali prescritte dall'istituzione dello sperimentatore.

1. preparazione dei cuccioli per l'Imaging

Nota: Cuccioli con scarsamente etichettati neuroni corticali ottenibili mediante elettroporazione in utero (IUE) di Supernova vettori^5,6. Il sistema di Supernova consiste di seguenti due vettori: TRE-Cre e CAG-loxP-STOP-loxP-Gene X-ires-tTA-WPRE. In questo sistema, etichettatura sparse si basa sulla perdita TRE. In una scarsa densità di popolazione di neuroni trasfettati, TRE unità l'espressione debole della Cre e tTA. Successivamente, solo in queste cellule, l'espressione del gene X è facilitata da un feedback positivo dei cicli tTA-TRE. Il raggiunto etichettatura radi e luminoso permette la visualizzazione dei dettagli morfologici di singoli neuroni in vivo. Dettagli della procedura IUE non descritti nel presente protocollo in quanto sono stati descritti altrove^7,8,9,10,11.

1. Prepararsi a tempo-incinta topi IUE.
2. Preparare una soluzione di DNA per IUE. Per l'etichettatura di tipo sparse con RFP, utilizzare una soluzione contenente pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK029:CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l) o una soluzione contenente pK031:TRE-Cre (5 ng / µ l) e pK273:CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE (1 µ g / µ l).
   Nota: Varie proteine possono essere espresso nei neuroni con etichettati utilizzando diverse combinazioni di vettori. Inoltre, vari geni possono essere abbattuto o eliminato specificamente in cellule con etichetta^5,6 (ad esempio, una serie di vettori per il sistema di Supernova sono disponibili da RIKEN BioResource Research Center e da Addgene).
3. Eseguire regolari IUE^7,8,9,10,11 per etichettare i neuroni corticali. Per l'etichettatura dei neuroni di strato 4, utilizzare embrionali giorno-14 embrioni.
4. Attesa per la consegna del cucciolo e crescita.

2. chirurgia

1. Anestetizzare il postnatale giorno-5 (P5) pup utilizzando gas isoflurano (1,0%). Eseguire un test di coda-pizzico per controllare il livello dell'anestesia. Se il cucciolo risponde per il pizzico, aumentare la concentrazione di isoflurane (fino a 2,0%) o attendere la risposta scomparirà. Mantenere la temperatura corporea del cucciolo durante la chirurgia usando un termoforo.
2. Iniettare per via sottocutanea un analgesico (carprofen, 5 mg/kg).
3. Sterilizzare la pelle di pup che copre il cranio strofinando con etanolo al 70% tre volte.
4. Rimuovere circa 20 mm² di pelle che copre il cranio con le forbici sterilizzate con etanolo al 70% (Figura 1A).
5. Togliere la mascherina del cranio usando pinze sterili e un batuffolo di cotone pulito e sterile (Figura 1A).
6. Applicare l'adesivo del tessuto utilizzando punte di carico alla superficie della pelle incisi per fermare l'emorragia. Non applicare adesivo del tessuto per l'area di imaging (Figura 1B) perché questo rende più difficile l'apertura del cranio.
7. Collocare il cucciolo su un rilievo di riscaldamento (37 ° C) e consentirle di recuperare dall'anestesia. Attendere fino a quando l'adesivo del tessuto ha asciugato e solidificato (circa 30 min).
8. Se necessario, applicare più tessuto adesivo e attendere che si asciughi e solidificare.

3. cranica finestra preparazione

1. Anestetizzare il pup utilizzando isoflurano (1.0-2.0%) e controllare il livello di anestesia di un test di coda-pizzico.
2. Aprire con cautela il cranio con una lama di rasoio sterilizzata, lasciando intatta il dura (1 mm di diametro) (Figura 1). Utilizzare una spugna di gelatina (tagliato in piccoli pezzi, circa 2 mm di <³, utilizzando forbici sterilizzate e applicarle con una pinzetta) imbevuto di corteccia tampone¹² (125 mmol/L NaCl, KCl di 5 mmol/L, glucosio di 10 mmol/L, 10 mmol/L HEPES, 2 mmol/L CaCl₂ e 2 mmol/L MgSO₄; pH 7.4; 300 mOsm/L; temperatura ambiente) per fermare l'emorragia. Quando si apre il cranio, applicare un buffer di corteccia per mantenere umida la superficie del cervello.
3. Rimuovere qualsiasi buffer e sangue dalla superficie dural utilizzando una spugna di gelatina. Applicare un suggerimenti di strato sottile di 1,0% dell'agarosi di basso-punto di fusione (disciolto nel buffer di corteccia) utilizzando giallo. Utilizzando una macchina del blocco di calore, mantenere la temperatura della soluzione di agarosio a 42° C fino al applicazione.
   Nota: Il drenaggio del buffer e del sangue deve essere eseguito dal lato del craniotomy pur avendo cura che la spugna di gelatina secca non venga a contatto con la dura madre. In caso contrario si potrebbe danneggiare la dura madre.
4. Applicare un coprioggetto in vetro rotondo (n. 1, 3 mm di diametro) lo strato di gel di agarosio. Rimuovere tutte le bolle tra il vetrino coprioggetto e lo strato di gel di agarosio versando un eccesso di gel di agarosio tra di loro. Rimuovere il gel in eccesso che fuoriesce da sotto il vetrino coprioggetto usando la pinzetta (Figura 1 e 1E).
5. Fissare il vetrino coprioggetto utilizzando cemento dentale (Figura 1F).
6. Miscelare la polvere e il liquido di cemento. Applicare la miscela utilizzando punte gialle prima di esso diventa solidificato. Non applicare il cemento dentale sulla dura, perché questo può danneggiare il cervello.
7. Allegare una sterile titanio barra (su misura, circa 30 mg, Vedi Figura 1) l'osso cranico utilizzando cemento dentale. Allineare la barra di titanio e il vetrino coprioggetti (sulla superficie del dura) in parallelo per catturare facilmente le immagini.
8. Coprire il cranio esposto con cemento dentale (Figura 1 H).
9. Recuperare il cucciolo dall'anestesia. Tenerlo su un termosifone (37 ° C) fino a quando il cemento dentale ha solidificato (1 h).

4. due-fotone di Imaging

Nota: Le immagini in vivo nella Figura 2 sono stati acquisiti utilizzando un microscopio a due fotoni con un laser di titanio-zaffiro (fascio di diametro [1/e²]²: 1,2 mm).

1. Impostare la lunghezza d'onda laser del due-fotone. Per l'eccitazione del RFP, uso 1.000 nm (450 mW/mm² a 400 µm di profondità).
   Nota: La potenza del laser deve essere ridotti poiché la posizione z sposta verso l'alto.
2. Pulire la superficie del coprivetrino con etanolo al 70%.
3. Anestetizzare il pup utilizzando isoflurano (1.5-2.0%) e verificare il livello di anestesia utilizzando un test di coda-pizzico.
4. Fissare il cucciolo alla piastra di titanio sul palco imaging utilizzando una barra di titanio sulla testa di pup (Figura 2A e 2B). Regolare la testa in modo che il vetrino coprioggetto è parallelo alla lente dell'obiettivo utilizzando il palcoscenico di Goniometro (Figura 2B). Mantenere la temperatura corporea del cucciolo utilizzando un termoforo (37 ° C).
5. Impostare la concentrazione di isoflurane 0,7% - 1.0%.
   Nota: Una concentrazione molto alta isoflurano può causare la morte accidentale del cucciolo durante la formazione immagine.
6. Posto la tappa imaging sotto la lente dell'obiettivo (20 X, NA 1.0) del due-fotone microscopio (fig. 2B e 2C).
7. Applicare una goccia di acqua sul vetrino coprioggetti. Utilizzare epi-fluorescenza per individuare i neuroni con etichetta proteina fluorescenti nella zona dove è stata esposta la dura madre.
8. Acquisire immagini dello stack z a intervalli 1.4-µm. Per strato 4 neurone imaging, impostata la z-larghezza 150-300 µm a immagine intera morfologia dendritica (Figura 2D e 2E). L'uso rallentare la scansione e in media per ottenere immagini nitide, mostrando la morfologia neuronale (prende solitamente > 20 min per acquisire l'intera morfologia dentritica).
   Nota: I seguenti parametri sono raccomandati per l'imaging. Lunghezza d'onda di eccitazione: 1.000 nm, scanner: tipo di galvanometro, specchio dicroico: 690 nm, filtro di emissione: 575-620 nm passa-banda, rivelatore: tipo GaAsP, ottenere l'impostazione > 100, immagine dimensione > 512 x 512 µm, campo di vista > 600 x 600 µm, pixel risoluzione < 1.2 µm.

5. recupero e professione d'infermiera

1. Staccare il cucciolo dalla fase di formazione immagine.
2. Collocare il cucciolo su un termosifone (37 ° C) e consentirle di recuperare (15 min).
3. Nutrire il cucciolo latte caldo utilizzando una micropipetta a intervalli di 2 h e delicatamente stimolare lo stomaco per consentire l'escrezione. Confermare che il cucciolo sta bevendo latte misurando il peso corporeo.

6. re-imaging

1. Anestetizzare il pup con isoflurano (1.5-2.0%) e verificare il livello di anestesia utilizzando un test di coda-pizzico. Allegare alla fase di formazione immagine.
2. Individuare i neuroni in precedenza imaged e acquisire un'immagine dello stack z. L'identificazione dei neuroni è facile a causa della loro scarsa etichettatura con Supernova.
3. Ripetere i passaggi 5.1-6.2 imaging è completato. Nota: Il cucciolo può essere imaged fino a 18 ore senza perdere peso.
   

Risultati

Figure 2D - 2F Visualizza risultati rappresentativi di due fotoni time-lapse imaging dei neuroni corticali strato 4 utilizzando il presente protocollo. Ai fini dell'analisi, selezionare i neuroni con morfologia chiaro dendritica durante i periodi di formazione immagini. Abbiamo analizzato la morfologia dendritica dei neuroni imaged utilizzando software di analisi morfologica. Ricostruzione di morfologia dentritica rappresentativo è mostrato nella

Discussione

Fasi critiche nel protocollo e risoluzione dei problemi:

La fase più critica del protocollo è la rimozione del cranio (passo 3.2 del protocollo). Al momento dell'inserimento, la lama di rasoio spesso aderisce al dura, provocando sanguinamenti dural e danni al cervello. Questo può essere evitato aggiungendo una goccia di tampone di corteccia sul cranio e rimuovendo il cranio nel buffer di corteccia.

Sanguinamento da dura e la pelle dopo preparazione cranica finestra ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
pK031. TRE-Cre	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from RIKEN BRC and Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Authors	-	Available from authors
Isoflurane	Wako	099-06571
410 Anaesthesia Unit (isoflurane gas machine)	Univentor	8323101
Vetbond (tissue adhesive)	3M	084-1469SB
MµltiFlex Round (loading tip)	Sorenson	13810
Gelfoam (gelatin sponge)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Low melting point
Round-shaped coverslip	Matsunami	-	Custom made
Unifast 2 (dental cement)	GC	-
Titanium bar	Authors	-	Custom made (see Figure 1G)
Rimadyl (carprofen)	Zoetis	-	Injectable
2-photon microscope	Zeiss	LSM7MP
Titanium-sapphire laser	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Titanium plate	Authors	-	Custom made (see Figure 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M