Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا لعزل نويات الدماغ في الدماغ الفئران حديثي الولادة بالاقتران مع تغذية اللبأ الأولى. يسمح هذا الأسلوب دراسة الإجهاد نقص المغذيات في الدماغ كما عن طريق إشارات enterocyte التضمين.

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول عزل نويات الدماغ الغنية مستقبلات الاوكسيتوسين في الدماغ حديثي الولادة قبل وبعد التغذية اللبأ الأولى. وتم قياس التعبير عن البروتينات المعروفة للاستجابة للإجهاد الأيضي في يعزل نويات الدماغ باستخدام النشاف الغربية. وقد تم ذلك لتقييم ما إذا كان التمثيل الغذائي عدم كفاية المواد الغذائية الناجمة عن الإجهاد في الجسم تسبب الضغوط العصبية. قد أثبتنا سابقا أن نقص المغذيات في حديثي الولادة يتسبب الإجهاد الأيضي في القناة الهضمية. وعلاوة على ذلك، ينظم الاوكسيتوسين اللبأ علامات الإجهاد الخلوي استجابة والتهاب أوتوفاجي في الزوائد القناة الهضمية الفئران حديثي الولادة قبل وبعد تغذية الأولى. إشارات علامات البروتين المرتبطة بالإجهاد هيولى [ER وصي ملزم الغلوبولين المناعي البروتين (المقاضاة)، 2 ألف عامل الشروع في ترجمة حقيقية النواة (eIF2a)، و eIF2a كيناز البروتين كيناز R (ف-PKR)]، فضلا عن اثنين البروتينات [النووية عامل-κB (NF-kB) ومثبطات κB (إيكب)]، وقيست في نويات الدماغ الوليد يشير إلى التهاب [نواة المسالك الانفرادي (NTS)، نواة بارافينتريكولار (التشفيير)، ونواة البصرية أعلاه (الابن)، واللحاء (CX)، المخطط نوى (STR)، و نواة بريوبتيك الآنسي (الخطة الرئيسية للعمليات)] قبل تغذية الأولى (أونبريميد من اللبأ) وبعد بداية التمريض (أعدادا من اللبأ). كانت تعبيراً عن المقاضاة/GRP78 وف-eIF2a أوبريجولاتيد في أونبريميد ودوونريجولاتيد في معبي NTS الأنسجة. أبقى NF-كيلوبايت (عالية) في السيتوبلازم معادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات، بينما NF-كيلو بايت أقل ودون تغيير في NTS، التشفيير وابنه في كل الظروف. الهيئة الجماعية والنتائج eIF2 ف تتسق مع استجابة إجهاد. وكان فوسفوريلاتيد eIf2a دسرنا تعتمد كيناز (ف-PKR) في ابنه ومعادل، والإبلاغ عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات. ومع ذلك، في تي إس (وإلى حد أقل في التشفيير)، كان فوسفوريلاتيد eIf2a بآخر كيناز، كيناز نونديريبريسيبلي--2 الرقابة العامة (GCN2). آليات تحوير الإجهاد لوحظ سابقا في القناة الهضمية الوليد انتيروسيتيس يبدو أن تكون متطابقة في بعض مناطق المخ الغنية OTR. NTS والتشفيير قد تستخدم إليه الفسفرة مختلفة (تحت عوز المغذيات) من مناطق أخرى ويكون مقاوم لتأثير نقص المغذيات. مجتمعة، هذه البيانات تشير إلى أن استجابات الدماغ لنقص المغذيات الإجهاد تقابلها إشارات من انتيروسيتيس معبي اللبأ.

Introduction

وعلى النقيض من فهمنا لتطور الدماغ المبكر التي تحدث على مدى أيام إلى أسابيع بعد الولادة، يعرف سوى القليل نسبيا هو حول عدد كبير التغيرات الدينامية في الساعات الأولى من الحياة في الفئران. وقد يشكل تحديا رئيسيا صغر حجم الدماغ الفئران حديثي الولادة وشرط لأدوات التكنولوجيا العالية لعزل مناطق الدماغ منفصلة أو الخلايا المفردة. وكثيراً ما تقيم الدراسات الجينات النسخ والترجمة لا1،2، التي لا تعطي فهم راسخ للمستويات الوظيفية لتنشيط الجزيئات مما يشير إلى. آخرون دراسة التعبير باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري لمناطق الدماغ المرجعية، التي لا تسمح للتقدير الكمي ل مستويات التعبير3. أي دراسة لتاريخ درست تفعيل إشارات المسارات المرتبطة مع اللبأ أول الفئران آر في مناطق الدماغ منفصلة، الأمر الذي يتطلب العزلة السريع والتضحية وقياس التعبير البروتين والبروتين الفسفرة استخدام الغربية النشاف. بينما يتم تنفيذ ميكروديسيكشن الدماغ على أقدم وأكبر العقول، أننا لم نحدد إشارة أداء لكمه الدماغ غير وحيدة الخلية في دماغ P0. وتعرض هذه الورقة على بروتوكول لعزل المناطق المقيدة في الدماغ حديثي الولادة باستخدام تقنية لكمه منخفضة نسبيا والغربية النشاف الداخلي لقياس التعبير البروتين في عينات صغيرة نسبيا. هذا البروتوكول قد تكون مناسبة للأسئلة البحثية التي تتطلب تقييم التعبير البروتين وتعديلات بوستترانسلاشونال (مثلاً.، الفسفرة) في مناطق محدودة نسبيا من العقول الصغيرة من أي الأنواع، شريطة يمكن تحديد المستخدم بصريا منطقة الدماغ للفائدة مع أطلس ومعالم محددة.

تم تطوير هذه التقنية لفهم التغيرات التي تحدث في الدماغ نتيجة الأولى اللبأ الفئران حديثي الولادة آر، وهي غنية في الاوكسيتوسين (OT). أوراسكوم تليكوم معروفا منذ فترة طويلة لقدرته على حفز انكماش الحليب السماح لأسفل والرحم. ومع ذلك، بعد التمديد يعرف الآن بالقيام بمجموعة واسعة من الأدوار في تنظيم العديد من وظائف الجسم والسلوكيات4. على سبيل المثال، بعد التمديد تعارض الإجهاد والتهاب بالاقتران مع السلوكيات التكيفية أفيلياتيفي5ويؤخر إفراغ المعدة، ويبطئ العبور المعوي. قد حددت بعد التمديد مستقبلات (OTR) في الخلايا العصبية المعوية وظهاره الأمعاء6،،من78. آثار الجهاز الهضمي OT تكتسي أهمية خاصة للرضع خلال فترة ما بعد الولادة المبكرة. على سبيل المثال، الرضاعة الطبيعية يرتبط بتسليم كميات كبيرة من الأراضي المحتلة إلى القناة الهضمية المواليد9،10، وتظهر البيانات أن OTR هو أوفيريكسبريسيد بشدة في الزوائد الإثناعشرية خلال لبن الرضاعة فترة8.

وقد أثبتت تجارب في المختبر باستخدام خط خلية القناة الهضمية على المستوى الخلوي أن الاوكسيتوسين ينظم الجزيئات الهامة في الضغط مما يشير إلى مسار11،12 وتقوم بدور تنظيمي في ترجمة بروتينات 12-تشير هذه الدراسات إلى أن مكونات الحليب، بما في ذلك الاوكسيتوسين خارجية من الأم، ذات أهمية في الاستجابة البروتين تكشفت في حديثي الولادة للحد من الإجهاد الخلوي13.

وقد أظهرت الدراسات في فيفو و السابقين فيفو أن ينظم اللبأ بعد التمديد على علامات الإجهاد الخلوي استجابة والتهاب أوتوفاجي في الزوائد القناة الهضمية الفئران حديثي الولادة. انتيروسيتيس حديثي الولادة يعانون الإجهاد الخلوية كبيرة من جانبهم لومينال عندما يتعرض في نفس الوقت القناة الهضمية الحجمية من الأم في اللبأ14،15 والبروتينات العديدة، بما في ذلك الهرمونات مثل ت9 , 10 , 16.

وقد آثار بعد التمديد على الدماغ درس17. ومع ذلك، لم تدرس آليات إرسال الإشارات OT تظاهروا في الأمعاء خلال فترة ما بعد الولادة المبكرة في الدماغ. في هذه الورقة، استخدمت طريقة لعزل نويات الدماغ منفصلة في الدماغ الفئران حديثي الولادة وتحت المهاد استخدام التفريد تعريف المناطق المعزولة من المخ. والهدف العام لهذا الأسلوب لالتقاط حالة الخلية إشارات في مناطق الدماغ في أقرب وقت ممكن للولادة، قبل وبعد الحليب الأولى هي ترضع، في أنسجة المخ مع أدنى مؤشر الدبقية/العصبية. والأساس المنطقي لتطوير هذا الأسلوب أنه يتيح لعزل مناطق الدماغ مقيد، المجهرية في المواليد الجراء السريع مع مجموعة أكثر تجانساً من الخلايا العصبية السابقين فيفو الدراسات النشاف غربي الآلي باستخدام المنهجية، وتقديم نتائج متسقة عالية في عينات تشريح صغيرة نسبيا. قصور عمل مسبق يشمل المزيد من التشريح الإجمالي (شرائح المخ أو الدماغ كله) وكبار السن الحيوانات18،19. أدمغة الشباب الجراء الديناميكية بشكل لا يصدق، يتميز بموجات تمايز الدبقية بعد الولادة. من أجل دراسة تغيرات الدماغ تتأثر بتغذية الجراء الأولى، دراسة نويات الخلايا العصبية مقيد بتشريح استنساخه ضروري.

عادة يتم تحليل الأعلاف الحليب لأثره التغذوية والمناعية على الصحة أو مورثة تعبير (على سبيل المثال، في انتيروسيتيس،من2021)، بينما نادراً ما يتم دراسة تأثيره على مناطق الدماغ أثناء نمو الدماغ. وقد تم تحليل أثر العابر الحليب في الأمعاء على وظيفة المخ إشارة إلى ترحيل تحفيزه من سيكريتين من القناة الهضمية مستقبلات إلى نوى جذع الدماغ، لكن ليس إلى داخل الخلايا مما يشير إلى مسارات22. هناك مؤلفات واسعة على ضعف الدماغ الوليد إلى سوء تغذية الأمهات أثناء الحمل23، ولكن لم يتم التصدي لإشارات الإجهاد والتهاب. الأهم من ذلك، يأخذ الأسلوب الحالي ميزة ظاهرة في الأطفال حديثي الولادة الفئران يوم الصفر يعزل المحفزات اللبأ ولد الدم من ترحيل تحفيزه للمحفزات الحشوي. هذا هو فترة هيبو-استجابة الإجهاد ما يسمى تتميز بنواة غير ناضجة tractus solitarius (NTS)-دارة طائي فورا بعد الولادة24،25 يقيد NTS، نواة بارافينتريكولار (التشفيير)، و نواة سوبراوبتيك (الابن) إشارات إلى المنبهات ولد الدم.

هذه الطريقة مفيدة لتحليل مسارات إشارات متعددة ومقيد نسبيا للخلايا العصبية، شريطة أن يتم حصاد أنسجة المخ في 0 يوم الولادة في الفئران، بالإضافة إلى ما إذا كان قد طعن فيها الأمهات أو لا بأي نوع من العلاج أثناء فترة الحمل. يمكن تحليل ليتر لآثار اللبأ آر مقابل قبل تغذية الإشارات. عند مقارنة الإشارات بين مناطق الدماغ مع الفقراء مقابل الغلة البروتين الغنية، يتيح هذا الأسلوب في شعري تحديد مجموع البروتين من العصابات ببتيد في الشعيرات الدموية بموازاة كوانتيتيشن المناعية المستضدات البروتين. هذا الأسلوب يتيح المقارنة الكمية، استخدام وحدات التعسفي، من النتائج التي تحققت بالضد نفسه دون منحنيات كمية قياسية وإشارة إلى مجموع البروتين الشعرية. مقارنة النتائج التي تم الحصول عليها من أجسام مختلفة من الممكن فقط استخدام المنحنيات القياسية الكمية.

يسمح هذا الأسلوب لتقييم الإشارات التي تحدث بين الأمعاء والدماغ، والتي يمكن أن يؤثر على وظيفة في كل الأجهزة26ثنائي الاتجاه. الرابطة بين المدخول الاوكسيتوسين والأغذية، التي درست على نطاق واسع في السنوات الأخيرة27، يدعم ارتباط بين مما يشير إلى زيادة الاوكسيتوسين وتوافر المغذيات. هذه الدراسات أيضا دعم مفهوم كونفيرس الطاقة هذا العجز تقترن بتخفيضات في إشارات الاوكسيتوسين طائي.

أظهرت دراسات سابقة من أثر بعد التمديد على نشاط الدماغ أن التهاب الأمعاء المستحث أثارت النسخ الماليين في القشرة طائي التشفيير واللوزة، والكمثرى وصهر لقطع المبهم28. مع ذلك، انخفض الجهازية ضخ OT مع سيكريتين استجابة الدماغ الماليين لاستفزاز رد فعل التهابات في القناة الهضمية28. هذا يشير إلى أن تأثير OT خارجية نفذه طرق خلاف مرحلات تحفيزه، ربما عن طريق جزيئات الإشارات المنقولة عن طريق الدم من خلال6،postrema المنطقة29.

في هذه الدراسة، تم تقييم مسارات الإجهاد الخلوية مما يشير إلى أنه قد لوحظ سابقا في القناة الهضمية في الدماغ. وكان الفرضية القائلة بأن مكونات الحليب قد حماية أو أرجاء تأثير الالتهاب على نفاذية الأمعاء إلى الايضات الميكروبية وغيرها، وفي المقابل، آثار على الدماغ الدالة. الاختلافات واضحة معادية في إيكب مقابل إشارات المقاضاة وجدت في الزوائد، قبل وبعد فتيلة من اللبأ13، اقترح أن العقل المدبر لحديثي الولادة، لا تزال عملية تطوير، قد معنى هذه الإشارات القناة الهضمية الناجمة عن اللبأ.

وقيست علامات البروتين إرسال الإشارات المستخدمة في التجارب السابقة في القناة الهضمية المرتبطة بالإجهاد هيولى. وهي تشمل وصي ER المقاضاة، eIF2a عامل بدء الترجمة (الذي يخدم integrator استجابة إجهاد30)، eIF2a كيناز فروبيه باكستانية، وهما البروتينات مما يشير إلى التهاب (NF-كيلو بايت وما المانع، إيكب).

وقد تم اختيار ست مناطق المخ استناداً إلى قدرتها في البالغين لإفراز أو الاستجابة إلى الأراضي المحتلة. NTS، يقع في لب العلوي، يتم ترحيل أول من المدخلات الحشوي ويستقبل إشارات مباشرة من الخلايا العصبية الحسية تحفيزه في القناة الهضمية31 وربما الدم ولد السيتوكينات والسموم، والهرمونات عبر postrema المنطقة المتاخمة32. التشفيير، نواة بريوبتيك الآنسي (الخطة الرئيسية للعمليات) وقشرة الدماغ (CX)، نواة سوبراوبتيك (الابن) والمخطط نوى (STR) تلقي إشارات من القناة الهضمية عن طريق تي إس.

وأظهرت النتائج أنه استجابة الإجهاد الخلوي خلال فترة ما بعد الولادة مباشرة قبل فتيلة اللبأ، ومباشرة بعد التغذية الأولى يختلف في NTS بالمقارنة مع التشفيير وابنه. إشارات في CX، تقارير عن المعاملات المشبوهة، والخطة الرئيسية للعمليات تختلف عن التشفيير وابنه، كذلك. يرجح أن هي لمست الوظائف الحمائية متميزة للتمديد هو موضح سابقا تعدل خلية الإجهاد والتهاب في القناة الهضمية ببعض المناطق في الدماغ. جماعياً، وتشير البيانات إلى أنه على المستوى الخلوي، خلال الساعات الأولى بعد الولادة، والدماغ يستجيب للإجهاد الأيضية المرتبطة بنقص العناصر الغذائية. وتظهر البيانات أيضا أن مدى واتجاه آثار تحوير اللبأ آر لا تعتمد على المنطقة وأنها مرآة في بعض المناطق، وآثار بعد التمديد هو موضح سابقا في القناة الهضمية.

Protocol

أقر هذه الدراسة برعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجان في جامعة كولومبيا ومعهد الطب النفسي الدولة نيويورك.

1-إعداد الأنسجة

  1. ترتيب توقيت الفئران الحوامل من المورد.
  2. اتبع الفئران الحوامل موقوت بمراقبة على البطن المتزايد في الأسابيع بعد وصولهم وبعد ذلك تبحث عن الجراء على تاريخ التسليم المتوقع بتفتيش القفص كل ح 2 حتى يبدأ التسليم.
  3. إزالة الجراء مع جهة القفاز بذيلها قبل إطعام الأولى الجراء أونبريميد (لا بطن الحليب الأبيض الظاهر عند عرض البطن) أو بعد الموجز الأول للحصول على الجراء معبي (عند هذه النقطة بيضاء في المعدة سوف تكون مرئية على البطن) كما هو موضح في تيميلي ني (S1 الشكل).
    ملاحظة: يسمى تغذية اللبأ أول فتيلة ألجرو؛ وهكذا، جرو أونبريميد حتى الأعلاف الأولى، بعد ذلك فتجهز اللبأ.
  4. بسرعة قطع رأس ألجرو أونانيسثيتيزيد استخدام مقص حاد، والعمليات الجراحية نظيفة.
  5. إزالة الدماغ بقطع الجلد أسفل خط الوسط والسطح العلوي من الجمجمة إلى الآنف. ثم، باستخدام الملقط، لطف نقب بعيداً العظام لكشف الدماغ (الشكل 1A) وترجمة بريجما، وضع علامة عليه بواسطة قلم كما تتم إزالة لوحات العظام (الشكل 1B).
  6. سرعة وضع الدماغ كله في بولي ميثاكريلات الدماغ العفن في درجة حرارة الغرفة كورونال تشريح في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1).
  7. دون تأخير، جعل 500 مم سميكة الشرائح باستخدام شفرة حلاقة جديدة. وضع الشرائح روسترال إلى والذيلية في طبق بتري للحفاظ على التوجه لأقسام (الشكل 2).
  8. إضافة السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام؛ 1.0 مم خ2ص4، 26 مم NaHCO3مم 118.6 كلوريد الصوديوم، 3.0 ملم بوكل، مم 203.3 مجكل2-6 ح2س) دون الجلوكوز بسرعة واحتضان الشرائح لمدة 60 دقيقة في 28-30 درجة مئوية، مع التحريك باستمرار على شاكر مداري أيضي وخلطات الطعن في أونبريميد مقابل معبي اللبأ الأنسجة.
  9. تحديد نويات الدماغ المطلوبة للكمه استخدام أطلس الدماغ33 والمعالم التشريحية على قسم الأنسجة. ضع هذه الشريحة مع الأنوية للفائدة في طبق بتري ونقله إلى مجهر تشريح.
  10. مجرد تصور، بسرعة لكمه من أصل 4 من 6 أنوية مختلفة باستخدام أداة المستخدمة، وتحديد حجم أفضل لكمه النواة في السؤال ودائما بين العينات (الشكل 2).
    ملاحظة: سيكون شريحة الدماغ المتبقية الآن إلى ثقب حيث تمت إزالة أنسجة المخ. في هذه الدراسة، ونحن اقتطعت الأنوية التالية استخدام دون الإحداثيات. جميع الأمامي/الخلفي (A/P) تكون الإحداثيات من بريجما (باستثناء NTS، والإشارة إلى سكريبتوريوس القصب الهندي). جميع الإحداثيات (D/V) الظهرية/البطني من سطح القشرة (باستثناء NTS، الذي من على سطح الأرض للب). تتضمن الإحداثيات التالية A/ف والانسي/الجانبي (M/L) د/V في مم: 1) نواة المسالك الانفرادي (NTS، A/P، 0.4 إلى 0.8؛ L، ± 0.2؛ D/V، 0.3 (من على سطح الأرض للب)، 2) نواة بارافينتريكولار (التشفيير،-0.8؛ ± 0.2؛ 0)، 3) نواة البصرية أعلاه (الابن،-1.1؛ ± 1.4؛ 4.3)، 4) اللحاء (CX، منطقة اللحاء الجزئية 1،-2.8; ± 1.5؛ 0.6)، 5) نويات المخطط (STR,-0.0; ± 1.6؛ 1.8)، و 6) بريوبتيك الآنسي نواة (الخطة الرئيسية للعمليات،-0.6؛ ± 0.2؛ 4.2).
  11. سرعة تزج الأنوية لكمات في 0.06 مل من البروتين المثلج، استخراج العازلة التي تحتوي على مثبطات البروتياز ومثبطات الفوسفاتيز لمدة 60 دقيقة (راجع الخطوة 2، 3).

2. استخراج البروتين

  1. إعداد الحل استخراج البروتين باستخدام طقم تحلل البروتين (جدول المواد) في اليوم قبل الولادة المتوقعة ألجرو.
  2. ذوبان الجليد (على الجليد) حل مثبطات البروتياز والفوسفاتيز مجموعة المخزن المؤقت تحلل مائي المجمدة (-20 درجة مئوية) ووضع المخزن المؤقت لتحلل وحل [دمس] من مثبطات البروتياز/فوسفاتاسيس على الجليد.
  3. إضافة مل 1.85 من المخزن المؤقت لتحلل في أنبوب نظيف والمثلج 15 مل. ثم إضافة 0.1 مل من محلول مائي من مثبطات و 0.05 مل من مثبطات حله [دمس]. وأخيراً، كاب ودوامه الأنبوب بإيجاز وإبقائه في-20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. قم بتسمية أنابيب ميكروسينتريفوجي نظيفة 24 (0.5 مل في كل) للإجراء تحلل. أنابيب 12 المعين في الدماغ للفريق أونبريميد اللبأ (U) [اليسار 6 (L) و 6 أنوية المخ (ص) الحق]، والتسمية وفقا لاختصار النوى، الجانب، وشرط (على سبيل المثال. تي إس-L يو، تي إس-آر يو، إلخ). قم بتسمية المجموعة الثانية من أنابيب 12 للعينات التي تجهز اللبأ.
  5. قم بتسمية مجموعتين إضافيتين من الأنابيب كما فعلت في الخطوة 2، 4 لمستخلصات البروتين المخزون (باستخدام أنابيب 1.5 مل ايبندورف الطراز) والمجموعة الأولى من إعداد نموذج (باستخدام أنابيب 0.5 مل). تبقى هذه الأنابيب في اثنين مربعات تجميد منفصلة، والمسمى (كل منها مصمم لأنابيب 100). سيتم استخدام مربع واحد للعينات أونبريميد والآخر لعينات معبي.
  6. ذوبان الجليد الحل تحلل على الجليد في اليوم الذي يتم تسليم الجراء، وحين تفرخ شرائح المخ في قام، الكوة مل 0.06 تحلل الحل في إجراء تحلل أنابيب (من الخطوة 2، 4) وإضافة نويات اللكمات واحتضانها في الجليد لمدة 60 دقيقة.
  7. الطرد المركزي نواة ليسيد المحتضنة لمدة 30 دقيقة في أجهزة الطرد مركزي المصغر تبريد عند 14000 دورة بالدقيقة (10,000 س ز) وعناية نضح مل 0.055 من المادة طافية مع ماصة تعيين بشكل صحيح. نقل المادة طافية في أنابيب يبرد قبل 1.5 مل الأسهم (من الخطوة 2، 5) ووضعها على الجليد. قبل التجميد (في-20 درجة مئوية) أنابيب مخزون البروتين ونقل 0.012 مل من المادة طافية في أنابيب يبرد قبل 0.5 مل لإعداد نموذج أولى (من الخطوة 2، 5) وتركها على الجليد.

3-نموذج إعداد لقياس البروتين في شعري

  1. استخدام أدوات وإعداد الكواشف لفصل وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إضافة 0.003 مل كاشف مزيج الرئيسي لكل من العينات 12 مل 0.5 المسمى أنابيب (من الخطوة 2، 5) على الجليد التي تحتوي على مل 0.012 من مستخلصات البروتين.
  2. قم بتشغيل كتلة التدفئة إلى 95 درجة مئوية وإضافة 0.004 مل الكاشف إعدادها في الخطوة 3، 1 إلى سلم بيوتينيلاتيد وزن جزيئي (ميغاواط) في أنبوب مع مل 0.016 من المياه. أن تؤذي بسلم وعينات ووضع الأنبوب سلم والعينات 12 من مستخلصات البروتين أونبريميد في كتلة الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  3. كرر الخطوات 2.0 إلى 3.2، من استخراج البروتين لإعداد عينة، الأنوية لكمات من الفئران معبي اللبأ.

4-التفريد إعداد

  1. ذوبان الجليد البيوتين وسم كاشف (المخزنة في التجميد العميق في-80 سج) على مقاعد البدلاء وإعداد أدوات الكشف عن البروتين على الجليد في 4 درجات مئوية اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
  2. مزيج 0.15 مل لومينول مع 0.15 مل بيروكسيد وتحميل مل 0.01 إلى 25 بئرا (صف ه، الآبار 1-25) من لوحة للإله الغربية الآلي. تحميل مل 0.008 من ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية من عدة آبار D1 إلى D25
  3. تحميل 0.01 مل الحل مادة جسم في الآبار C1 إلى ج 25 و B1.
  4. تدور 24 بروتين العينات وسلم أنابيب بإيجاز (2-3 ثوان) في مينيسينتريفوجي إلى تجمع أسفل المياه المتبخرة من قبعات الأنبوبة.
  5. تحميل مل 0.003 من عينات أونبريميد 12 بئرا A2 A13 ومل 0.003 من عينات 12 معبي اللبأ في آبار A14 إلى A25 ومل 0.005 في سلم بيوتينيلاتيد إلى A1 جيدا.
  6. اترك صف و فارغة وتحميل مل 0.45 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في كل من المقصورات 5 في كل من 3 صفوف أسفل الصف واو غطاء اللوحة مع لها غطاء بلاستيكي لتجنب التبخر أثناء الإجراءات المتبقية.
  7. باختصار دوامة البيوتين المذابة وسم الكاشف وإضافة 0.15 مل الكاشف أنبوب المعينة؛ ثم إضافة إلى ذلك 0.15 مل عامل إعادة تشكيل البروتين الكلي ومزجها بالتجانس.
  8. إزالة الغطاء من اللوحة وتحميل مل 0.01 من وكلاء 1 و 2 في الآبار B2 إلى B25. تغطية اللوحة والطرد المركزي أنه لمدة 10 دقيقة في 1,000 ز x لإزالة أي فقاعات الهواء من الحلول المختلفة. استخدام صفيحة فارغة في أجهزة الطرد المركزي للتوازن.

5-التفريد

  1. بينما هو الغزل اللوحة، فتح ملف تشغيل في الكمبيوتر المرفقة بالجهاز الآلي الغربية بالإشارة في صفحة قائمة منسدلة من "ملف" لتشغيل مقايسة بروتين الكلي والنقر فوق بقعة منها.
  2. إضافة تعليق توضيحي العينات بشكل جيد في الكمبيوتر. ثم إزالة اللوحة من أجهزة الطرد المركزي إزالة الغطاء وتقشر بعناية الغطاء الألومنيوم من المقصورات الحل الانفصال.
  3. ضع اللوحة في الصك الغربية الآلي وتقشر الغطاء من مربع خرطوشة الشعرية وإدراج الخرطوشة في مكانها المعين وإغلاق الباب.
  4. انقر فوق الزر "تشغيل"، وعند مطالبتك بذلك بنوع من التحليل ("مجموع البروتين")، اكتب اسم العينات (على سبيل المثال، "أونبريميد 2-13 وتجهز اللبأ 14-25"). انقر فوق "موافق"، وعند مطالبتك بواسطة تاريخ تشغيل المنشط ورقم معرف لتشغيل الملف، قم بتدوين الوقت عندما ينتهي التشغيل.
  5. في نهاية التشغيل (170 دقيقة بعد البدء)، فتح الباب الصك وإزالة خرطوشة الشعرية وتخلص منه إلى التخلص من الأدوات الحادة. تجاهل اللوحة في التصرف في هذه المسألة البيولوجية.
  6. انقر فوق رمز الانفصال المنحنيات في صفحة تحليل ملف التشغيل، والتحقق من أن جميع العينات قد تعمل بشكل صحيح، ويتم عرض متعددة البروتين المنحنيات في جميع الشعيرات الدموية.

6-تحليل الإشارات البروتينات

  1. في أنبوب مسمى 1.5 مل، أضف 0.003 مل لأرنب المضادة للأجسام المضادة والرمات-eIF2a (ف-eIF2a) وتعليق في 0.3 مل (تخفيف 1: 100) في جسم مادة من أدوات الكشف المناسبة. ثم إبقائه على الجليد.
  2. تسمية أنبوب لومينول وإضافة 0.15 مل من لومينول و 0.15 مل من بيروكسيد من هذه المجموعة الوحدة النمطية لكشف والاستغناء عن 0.01 مل إلى الآبار E1 إلى E25 صفيحة الغربية طازجة وتلقائية.
  3. الاستغناء عن 0.01 مل الثانوي المضادة لجسم الأرنب في آبار D2 إلى D25، وإضافة 0.01 مل من ستريبتافيدين-برنامج الصحة الإنجابية من الطقم إلى D1 جيدا.
  4. الاستغناء عن 0.01 مل جسم الأولية (من الخطوة 6، 1) في آبار C2 إلى ج 25، وإضافة 0.01 مل من محلول 2 مادة جسم إلى الآبار C1 و B1 إلى B25.
  5. ترك الآبار و صف فارغ وتعبئة مل 0.45 من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي في المقصورات 5 من 3 صفوف أسفل الصف و.
  6. باختصار تدور العينات مبردة 3 s، وإضافة مل 0.003 من كل عينة إلى صف أ بنفس الترتيب الذي تم إضافتهم مقايسة البروتين الكلي، بدءاً من A2 إلى A25. إضافة مل 0.005 في سلم ميغاواط بيوتينيلاتيد جيدا A1 وتغطية اللوحة.
  7. الطرد المركزي في اللوحة كما فعلت في الخطوة 4، 8. بينما هو الغزل اللوحة، فتح ملف تشغيل جديد (في البرامج المرتبطة بالغربية الآلية والكمبيوتر) وتشير في صفحة قائمة منسدلة من "ملف" لتشغيل مقايسة حجم جزيئي بواسطة النقر فوق بقعة منها.
  8. في الصفحة المقايسة، اكتب أسماء العينة في كل شعري، ثم اكتب اسم جسم الأولية في المكان المخصص وجسم الأرنب المضادة الثانوي أقل من ذلك.
  9. في نهاية للطرد المركزي، كرر الخطوات 5، 3 – 5.5، إلا ينبغي أن يكون الاسم المعطى لتشغيل الملف هذه المرة "ف-eIF2a أونبريميد 2 – 13 وتجهز اللبأ 14 – 25".
  10. بعد فصل التفريد، التدقيق في ملف التشغيل لقمم مفاعليه المناعية المستضدات في أحجام كاتشين 40 – 43. حيث ميغاواط قمم هذه المساحة مفقودة، انقر بالزر الأيمن أسفل المنحنى وتشير إلى داخل القائمة المنسدلة إضافة ميغاواط إلى الذروة، مما يضمن أن يتم تسجيل حجم وكمية التعسفي أسفل المنحنى.

7-معالجة النتائج

  1. تشغيل ملف فتح تشغيل ملف جدول بيانات للبروتين الكلي في الغربية الآلي وتوفير رقم معرف.
  2. فتح ملف التشغيل مقايسة البروتين الكلي في صفحة التحليل في وضع منحنى ووضع علامة على كل قمم في الشعيرات الدموية الفردية. ثم نسخها ولصقها في جدول البيانات ومجموع المناطق الواقعة تحت المنحنى من جميع الذروة المسجلة في شعري كامل.
  3. في عمود منفصل، ترتيب المبلغ الإجمالي للبروتين لكل عمود مع الأرقام الشعرية، أسماء نوى الدماغ كل منهما، وأرقام معرف من ملفات التشغيل.
  4. فتح جدول بيانات مستضد eIF2a ف، وفي عمود مفرد، وسجل المنطقة تحت المنحنى من كل الشعرية جنبا بجنب مع كل منها عدد الشعيرات الدموية، اسم نواة المخ، ورقم معرف ملف التشغيل.
  5. نسخ العمود مجموع البروتين (الموازية لكميات منحنى ف-eIF2a) في جدول ثالث وحساب فنسب البروتين eIF2a:total في عمود ثالث.
  6. تجميع النتائج من الخطوات من 4 إلى 6 لكل نواة الدماغ وترتيبها في مجموعات من النوى، وإنشاء رسم بياني شريطي.

النتائج

عصابات إيمونوريكتيفيتي بالنسبة إلى مجموع البروتين الممثل تظهر أن هناك نويات الدماغ مع البروتين المقطوع منخفضة جداً. وهذا يتطلب استخدام هذا الأسلوب الآلي لطخة غربية، وحساسة للغاية مقارنة بوصمة عار الغربية المتعارف عليه. يمكن تشغيل هذا النهج مع فورتيفولد البروتين أقل لل...

Discussion

تقنية ميكروديسيكشن من المنفصلة، الغنية OTR نويات الدماغ في الدماغ الفئران حديثي الولادة هو المعروضة في هذه الورقة. من المعروف جيدا أن الخلايا العصبية هي درجة عالية من التخصص، حتى داخل نواة تتسم جيدا في الدماغ. ويمكن هذا النهج استنساخه بدرجة عالية لعزل محددة الغنية OTR نوى اختبار الفرضية قوي?...

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون الحارس مانون وشولتز ألكسندرا لمساعدتها في إعداد هذا البروتوكول.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bradford solutionBio Rad
Protein lysis kitProtein simpleCBS403Bicine/CHAPS
WES kitsProtein simpleWES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugateProtein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2aCell Signaling technologySER51, 9721
mouse mAb anti-PKRCell Signaling technology2103
Rabbit anti-phospho-PKRMilliporeThr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKRCell Signaling technology12297
rabbit mAb anti-GAPDHCell Signaling technology2118
mouse mAb anti-phospho-IKBCell Signaling technology9246
mouse mAb anti-IKBCell Signaling technology4814
rabbit anti-BiPCell Signaling technology3183
Rabbit anti GCN2Cell Signaling technology3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2BIORBYTT899
pregnant Sprague-Dawley ratsCharles River Laboratories
Punch deviceWellTech Rapid Core or Harris Uni-Core0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

References

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?. Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141 tractus solitarius NTS 2 GCN2 NF 2 eIF2a

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved