Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, ilk kolostrum beslenme ile birlikte yenidoğan sıçan beyin beyin çekirdekleri yalıtmak için bir iletişim kuralı mevcut. Bu teknik Enterocytes sinyal tarafından modüle gibi besin yetersizliği stres beyin çalışma sağlar.

Özet

Bu iletişim kuralı oksitosin reseptör zengin beyin çekirdekleri yenidoğan beyinde önce ve sonra ilk kolostrum besleme yalıtmak için hedeftir. Ifade için metabolik stres yanıt vermek için bilinen proteinlerin beyin çekirdekleri yalıtır Western blot kullanarak ölçülmüştür. Bu vücuttaki metabolik stres kaynaklı besin yetersizliği tetiklenen nöronal stres değerlendirmek için yapılmıştır. Biz daha önce ventilasyon besin yetersizliği gut metabolik stres aydınlığa çıkartıyor gösterdi. Ayrıca, kolostrum oksitosin hücresel stres tepki, inflamasyon ve autophagy işaretleyicilerini yeni doğmuş fare gut villus öncesinde ve ilk yem sonra gelen. Endoplazmik retikulum stres ile ilişkili protein işaretleri sinyal [ER refakatçi bağlayıcı immünglobulin protein (BiP), ökaryotik çeviri başlatma faktör 2A (eIF2a) ve eIF2a kinaz protein kinaz R (p-PKR)], iki yanı sıra iltihap sinyalli proteinler [nükleer faktör-κB (NF-kB) ve inhibitörü κB (IKB)], yeni doğan beyin çekirdekleri içinde ölçülen [yalnız yolu (NTS), paraventricular çekirdeği (PVN), supra-optik çekirdeği (oğlu), korteks (CX), striatum çekirdeği (STR), çekirdek ve medial preoptic çekirdeği (MPO)] (kolostrum tarafından unprimed) ilk besleme önce ve (kolostrum tarafından astarlanmalıdır) hemşirelik başladıktan sonra. Sesli uyarı/GRP78 ve p-eIF2a ifadesi astarlanmalıdır NTS dokuda upregulated içinde unprimed ve downregulated vardı. Oysa NF-kB alt ve koşulların her ikisi de NTS, PVN ve oğlu değişmeden NF-kB (yüksek) CX, STR ve MPO sitoplazmada muhafaza edildi. Toplu BiP ve p-eIF2 bulgular bir stres tepkisi ile tutarlıdır. eIf2a tarafından dsRNA bağımlı kinaz (p-PKR) oğlu, CX, STR ve MPO fosforile. Ancak, NTS (ve daha az bir ölçüde de PVN), eIf2a başka bir kinaz, genel kontrol nonderepressible-2 kinaz (GCN2) tarafından fosforile. Daha önce yeni doğan gut enterositler gözlenen stres oransal mekanizmaları bazı OTR zengini beyin bölgelerde yansıtılması için görünür. NTS ve PVN diğer bölgelerden farklı fosforilasyon mekanizması (altında besin eksikliği) kullanmak ve besin yetersizliği etkisini ateşe dayanıklı olabilir. Toplu olarak, bu veri besin yetersizliği stres beyin yanıt kolostrum astarlanmalıdır enterositler sinyal tarafından mahsup edilir öneriyor.

Giriş

Gün-için-hafta Doğum sonrası boyunca meydana gelen erken beyin gelişimi anlayışımızı aksine nispeten az dinamik değişiklikleri sıçanlarda yaşamın ilk saatlerinde meydana gelen sayısız hakkında bilinir. Önemli bir sorun küçük boyutu yenidoğan sıçan beyin ve ayrık beyin bölgeleri veya tek hücre yalıtmak yüksek teknoloji ürünü araçlar için bir gereklilik olmuştur. Çalışmalar kez aktif sinyal moleküllerinin işlev düzeylerini sağlam bir anlayış vermez gen transkripsiyon ve translasyon değil1,2, değerlendirmek. Diğerleri ifade ifade düzeyleri3miktar için izin vermeyen immünhistokimya başvuru beyin bölgelerine kullanarak inceleyin. Bugüne kadar hiçbir çalışma gerektiren hızlı yalıtım ve fedakarlık ve protein ifade ve protein fosforilasyon Western kullanarak ölçüm ayrı beyin bölgelerinde yem rats ilk kolostrum ile ilişkili yollar sinyal aktif inceledi kurutma. Beyin mikrodiseksiyon büyük ve daha büyük beyin üzerinde gerçekleştirilir iken, bir tek hücre beyin yumruk P0 beyinde gerçekleştirme başvuru belirlenememiştir. Bu kağıt kısıtlı protein ifade nispeten küçük örneklerinde ölçmek için nispeten düşük teknoloji yumruk tekniği ve bir Western blot yordamı kullanarak yenidoğan beyin bölgelerinde izole için bir protokol sunar. Bu iletişim kuralı translasyonel modifikasyonlar ve protein ifade değerlendirme gerektiren araştırma soruları için uygun olabilir (Örn., fosforilasyon) herhangi bir tür küçük beyni nispeten sınırlı bölgelerde aşağıdaki koşullarda Kullanıcı bir atlas ve tanımlanabilir yerler ile görsel olarak beyin bölgesi ilgi belirlemek için.

Bu teknik yenidoğan rats ilk kolostrum besleme, oksitosin (OT) zengin olduğu sonucu beyinde meydana gelen değişiklikleri anlamak için geliştirilmiştir. OT uzun süt hayal kırıklığı ve rahim kasılması uyarmak onun yetenek için bilinmektedir. Ancak, OT şimdi birçok vücut fonksiyonları ve davranışları4Yönetmelikte çok çeşitli roller oynamak için bilinir. Örneğin, OT stres ve inflamasyon adaptif affiliative davranışlar5ile birlikte karşı çıkıyor, mide boşalma gecikmeler ve bağırsak transit yavaşlatır. OT reseptörleri (OTR) enterik sinir hücreleri ve bağırsak epitel6,7,8' tespit edilmiştir. OT, gastrointestinal etkilerini erken postnatal dönemde bebek için özellikle önemlidir. Örneğin, emzirme OT önemli miktarda teslim yenidoğan gut9,10ile ilişkilidir ve veri OTR ağır dönem8emdikleri süt sırasında duodenal villus overexpressed göster.

Vitro deneyler bir gut hücre satırı kullanarak hücresel düzeyde bu oksitosin yolu11,12 sinyal stres önemli molekülleri modüle ve proteinler Çeviride bir düzenleyici rol oynar göstermiştir 12. bu çalışmalar bileşenleri süt anneden eksojen oksitosin de dahil olmak üzere, hücresel stres13azaltmak için ventilasyon gelişeceğini protein yanıtta önemli olduğunu göstermektedir.

Vivo ve ex vivo çalışmalar kolostrum OT yeni doğmuş fare gut villus hücresel stres tepki, inflamasyon ve autophagy işaretleyicilerini modüle göstermiştir. Gut microbiota için kolostrum14,15 ve OT9 gibi hormonlar dahil çok sayıda protein anneden aynı anda maruz kaldığında yenidoğan enterositler önemli hücresel stres luminal yan acı , 10 , 16.

OT etkileri beyin eğitimi17olmuştur. Ancak, gut erken postnatal dönemde gösterdi OT sinyal mekanizmaları beyinde incelenmiştir değil. Bu yazıda, ayrık beyin çekirdekleri yenidoğan sıçan beyin sapı ve Elektroforez kullanarak hipotalamus izole bir yöntem izole beyin bölgeleri profil için kullanılır. Bu yöntem genel hücre beyin alanlarda Doğum, önce ve sonra en düşük fiyat gliyal/nöronal dizini olan beyin dokusunda emdikleri ilk süt mümkün olduğunca yakın sinyal durumunu yakalamak için hedeftir. Bu tekniğin geliştirilmesi için gerekçe bu nöronların otomatik bir Western blot kullanarak ex vivo çalışmalar için daha homojen bir koleksiyon ile sınırlı, mikroskopik beyin bölgeleri yenidoğan pups yalıtım hızlı için sağlanmıştır metodoloji, nispeten küçük disseke örnekleri üzerinde son derece tutarlı sonuçlar sunuyor. Ön çalışma bir eksiklik daha fazla brüt diseksiyon (beyin dilimler veya tüm beyin) ve büyük hayvanlar18,19içerir. Dalgalar doğumdan sonra gliyal farklılaşma featuring son derece dinamik ve Genç yavrularını beyinlerdir. Belgili tanımlık pups ilk besleyerek etkisinde beyin değişiklikleri incelemek için tekrarlanabilir diseksiyon ile sınırlı nöronal hücre çekirdeği eğitim gereklidir.

Beyin gelişimi sırasında beyin bölgeleri üzerindeki etkisi nadiren okudu, ancak süt yem genellikle sağlık veya gen ifadesinde (örneğin, enterositler20,21), üzerindeki immünolojik ve beslenme etkisi için analiz edilir. Süt transit gut etkisi beyin fonksiyonu referans olarak gut cholecystokinin reseptörleri vagus geçiş beyin sapı çekirdeği, ancak hücre içi sinyal yolları22analiz edildi. Orada geniş bir edebiyat gelişmekte olan yenidoğan beyin güvenlik açığı için yetersiz annelerin beslenme sırasında gebelik23, ama stres ve inflamasyon sinyalleri değil ele alınmaktadır. Önemlisi, geçerli yöntem visseral uyaranların vagus röle üzerinden kan tarihi kolostrum uyaranlara izole bir fenomen gün sıfır sıçan yenidoğanlarda yararlanır. Bu olgunlaşmamış çekirdeği tractus solitarius (NTS) tarafından karakterize sözde stres Hipo-yanıt dönemdir-hipotalamik devre NTS, paraventricular çekirdeği (PVN), sınırlayan hemen Doğum24,25 sonra ve supraoptic çekirdeği (oğlu) kan tarihi uyaranlara sinyalleri.

Bu yöntem birden çok sinyal yolları analiz için yararlıdır ve beyin dokusu içinde rats, anneler meydan var ek olarak ya da değil her türlü tedavi Doğum sonrası gün-0 hasat olması koşuluyla nöronal hücre için nispeten sınırlı Hamilelik sırasında. Çöp sinyal ön besleme karşı yem kolostrum etkileri için analiz edilebilir. Zavallı zengin protein verim karşı ile beyin bölgeleri arasında sinyal karşılaştırırken, bu yöntem bağışıklık-Nefelometri protein antijenleri için paralel kılcal polipeptid bantlarında toplam protein tayini kılcal sağlar. Bu yöntem, rasgele birimleri, standart nicel eğrileri olmadan aynı antikor ve kılcal başına toplam protein referansı tarafından elde edilen sonuçlar kullanarak sayısal karşılaştırma sağlar. Farklı antikor tarafından elde edilen sonuçlar karşılaştırma yalnızca nicel standart eğrileri kullanılarak mümkündür.

Çift yönlü gut ve beyin ve bu arasında meydana gelen her iki organ26işlevinde etkisi olabilir sinyal değerlendirmesi için bu yönteme izin. Kapsamlı son yıllarda27' eğitimi aldı, oksitosin ve gıda alımı arasındaki ilişkiyi artan oksitosin sinyalizasyon ve besin kullanılabilirlik arasındaki bağlantıyı destekler. Bu çalışmalar da açıkları hipotalamik oksitosin sinyal içinde indirimleri ile birleştiğinde bu enerjiyi converse kavramı destekler.

OT etkisi beyin aktivitesi üzerinde daha önceki çalışmalar indüklenen bağırsak iltihabı olan vagotomy28için ateşe dayanıklı hipotalamik PVN, amigdala ve piriform kortekste cFos transkripsiyon elde edildi gösterdi. Ancak, sistemik OT infüzyonu ile secretin gut28provoke inflamatuar reaksiyon beyin cFos yanıtı azalmıştır. Bu eksojen OT etkisini vagus Röleler, muhtemelen kan yoluyla sinyal molekülleri alan postrema6,29taşınan üzerinden başka yolları tarafından gerçekleştirildiği ileri sürdü.

Bu çalışmada, daha önce gut gözlemledim hücresel stres sinyal yolları beyinde değerlendirildi. Hipotez süt bileşenleri korumak veya inflamasyon etkisi bağırsak geçirgenliği mikrobiyal ve diğer metabolitler için erteleme ve sırayla, beyin üzerindeki etkileri işlev yapıldı. Önce ve sonra tarafından kolostrum13, astar villus içinde bulunan BiP sinyali karşı IKB açık uzlaşmaz farklılıklar hala süreci geliştirmek, yenidoğan bebeklerin, beyinlerinin bu gut kolostrum kaynaklı sinyaller hissediyorum önerdi.

Endoplazmik retikulum stres ile ilişkili olan önceki gut deneylerde kullanılan sinyal protein işaretleri ölçüldü. ER refakatçi BIP, (Bu bir stres yanıt ıntegrator30hizmet vermektedir) çeviri başlatma faktörü eIF2a, eIF2a kinaz p dahil-PKR ve iki iltihap sinyalli proteinler (NF-kB ve onun inhibitörü, IKB).

Yeteneklerini salgılar ya OT için cevap erişkinlerde temel altı beyin bölgeleri seçilmiştir. Üst medulla bulunan NTS, visseral giriş ilk geçiş ve gut31 ve muhtemelen kan tarihi sitokinler, toksinler ve hormonlar aracılığıyla bitişik alan-postrema32vagus duyusal nöronlarda üzerinden doğrudan sinyal alır. PVN, supraoptic çekirdeği (oğlu), striatum nükleuslar (STR), serebral korteks (CX) ve medial preoptic çekirdeği (MPO) almak gut NTS üzerinden gelen sinyal.

Sonuçları bu hemen postnatal dönem kolostrum priming önce ve sonra hemen ilk besleme PVN ve oğlu ile karşılaştırıldığında NTS farklıdır hücresel stres tepki gösterdi. CX içinde sinyal, STR ve MPO PVN ve oğlu, bundan de farklıydı. Daha önce hücre stres ve bağırsak iltihabı modüle gösterilen OT ayrı koruyucu işlevlerinin büyük olasılıkla beyin bazı alanlara göre hissettim. Toplu olarak, verilerin hücresel düzeyde, Doğum sonra ilk saatlerde beyin besin yetersizliği ile ilişkili metabolik stres yanıt verdiğini gösterir. Verileri ölçüde ve yem kolostrum modülasyonlu etkileri yönünü bölge bağımlı olduğunu ve bazı bölgelerde, onlar daha önce gösterilen gut OT etkileri ayna de gösterilir.

Protokol

Bu çalışmada kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komiteler Columbia Üniversitesi ve New York Eyalet psikiyatrik Enstitüsü tarafından kabul edildi.

1. doku hazırlık

  1. Zamanlanmış gebe rats satıcıdan sipariş.
  2. İletim başlar kadar zamanlanmış gebe rats onların geldikten sonra hafta içinde onların büyüyen abdomens gözlemleyerek ve daha sonra yavrular için kafes inceleyerek üzerinde beklenen teslim tarihini bakarak her 2 h izleyin.
  3. Timeli içinde açıklandığı gibi onların ilk beslemek unprimed yavruları (hiçbir beyaz süt göbek karın görüntülerken açıkça görülür) veya ilk beslemek için astarlanmalıdır pups (Bu noktada beyaz mide onların karın üzerinde görünür olacaktır) önce onların kuyruk tarafından pups eldivenli bir el ile kaldırma ne (Şekil S1).
    Not: İlk kolostrum besleme yavru fok astar olarak adlandırılır; Böylece, bir yavru, sonra onlar kolostrum astarlanmalıdır ilk yem kadar unprimed.
  4. Hızlı bir şekilde keskin, temiz cerrahi makas kullanarak unanesthetized yavru başını kesmek.
  5. Beyin için burun deri orta hat ve kafatasının üst yüzeyi aşağı kesim tarafından kaldırın. O zaman, forseps kullanarak, yavaşça uzakta beyin (Şekil 1A) ortaya çıkarmak ve bregma, (Şekil 1B) kemik plakaları kaldırılmış olarak bir kalemle işaretleme yerelleştirmek için kemik Gözetlemek.
  6. Hızla tüm beyin polimetil metakrilat beyin kalıp oda sıcaklığında (Şekil 1 c) Dilimleme koronal için oda sıcaklığında yerleştirin.
  7. Gecikme, 500 mm kalınlığında dilimler taze jilet kullanarak yapmak. Dilimleri için bölümler (Şekil 2) yönünü korumak için bir petri kaudal rostral yatıyordu.
  8. Hızlı bir şekilde yapay serebrospinal sıvı (ACSF; 1.0 mM KH2PO4, 26 mM NaHCO3, 118.6 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 203,3 mM MgCl2-6 H2O) glikoz olmadan ekleyin ve sürekli karıştırarak üzerinde 28-30 ° C'de 60 dk için dilimleri kuluçkaya bir orbital çalkalayıcı metabolik olarak ve differentially kolostrum astarlanmalıdır dokulara karşı unprimed meydan okumak için.
  9. Bir beyin atlas33 ve anatomik yapılar doku bölümüne kullanarak yumruk için gerekli beyin çekirdekleri tanımlayın. Petri kabına ilgi çekirdekleri ile bu dilim yerleştirin ve diseksiyon mikroskop hareket.
  10. Bir kez görüntülendi, 4 en iyi söz konusu çekirdeği yumruk boyutu seçerek bir ambara aracıyla 6 farklı çekirdekleri ve tutarlı bir şekilde örnek (Şekil 2) arasında hızlı bir şekilde yumruk at.
    Not: Kalan beyin dilim şimdi nerede beyin dokusu çıkarılmış bir delik gerekir. Bu çalışmada, biz kullanarak aşağıdaki çekirdek eksize aşağıda koordinatları. Tüm ön/arka (A / P) Koordinatlar (hariç NTS, Hint kamışı Scriptorius referansla olan) Bregma üzerinden. Tüm sırt/ventral (D/V) koordinatları (NTS, medulla yüzeyinden olan dışında) korteks yüzeyine gelmektedir. A aşağıdaki koordinatları içerir / P, medial/lateral (M/M) ve D/V mm: 1) Yalnız sistem çekirdeği (NTS, A / P, 0.4-0.8; L, ± 0.2; D/V, 0,3 (medulla yüzeyinden), 2) paraventricular çekirdeği (PVN,-0.8; ± 0.2; 0), 3) supra-optik çekirdeği (oğlu,-1.1; ± 1.4; 4,3), 4) korteks (CX, kısmi korteks alanı 1,-2.8; ± 1.5; 0,6), 5) striatum çekirdeği (STR,-0.0; ± 1,6; 1,8) ve 6) medial preoptic çekirdek (MPO,-0.6; ± 0.2; 4.2).
  11. Hızla proteaz inhibitörleri ve fosfataz inhibitörleri 60 dakika (bkz. Adım 2.3) içeren buz gibi protein ayıklama arabellek 0,06 ml delikli çekirdeklerin bırakın.

2. protein çıkarma

  1. Bir gün önce beklenen yavru teslim protein lizis kiti (Malzemeler tablo) kullanarak protein ekstraksiyon solüsyonu hazırlayın.
  2. (Buz) dondurulmuş (-20 ° C) sulu çözüm lizis arabellek kitinin fosfataz ve proteaz inhibitörleri, çözülme ve lizis tampon ve proteaz/fosfatazlar inhibitörleri DMSO çözeltisi buza koyun.
  3. 1.85 mL lizis arabellek temiz, buz gibi 15 mL tüp içine ekleyin. Daha sonra sulu çözüm inhibitörleri ve DMSO çözünmüş inhibitörleri 0.05 mL 0.1 mL ekleyin. Son olarak, kap ve kısaca girdap tüp ve kadar kullanmak-20 ° C'de saklayın.
  4. 24 temiz microcentrifuge tüpler (0.5 mL her) lizis yordam için etiket. Beyin kolostrum unprimed grubunun (U) [6 kişi (L) ve 6 doğru (R) beyin çekirdekleri] ve etiket çekirdeği kısaltma göre ücret belirlenmesi 12 tüpler yan ve durumu (Örn., NTS-L-U, NTS-R-U, vb). 12 tüpler kolostrum astarlanmalıdır örnekleri için ikinci grup etiket.
  5. Tüpler iki ek kümesi adım 2.4 (1,5 mL Eppendorf tarzı borular kullanarak) hisse senedi proteini özleri ve numune hazırlama (0.5 mL tüpler kullanarak) ilk kümesi için yapılan gibi etiketleyin. Bu tüpler iki ayrı, etiketli dondurucu kutularını (her biri 100 tüpler için tasarlanmış) unutmayın. Bir kutu unprimed örnekleri ve diğer astarlanmalıdır örnekleri için kullanılacaktır.
  6. Belgili tanımlık pups teslim gün ve beyin dilimler halinde ACSF, aliquot 0,06 mL lizis çözüm lizis yordamı tüpler (Kimden adım 2.4) içine kuluçka sırasında lizis çözüm buz çözme ve çekirdekleri yumruklar ekleyin ve buz 60 dk için kuluçkaya.
  7. İnkübe lysed çekirdeği 30 dk içinde soğutmalı mini santrifüj 14000 rpm (10.000 x g) için santrifüj kapasitesi ve dikkatle 0,055 mL süpernatant düzgün ayarlanmış bir pipet ile Aspire edin. Süpernatant önceden soğutulmuş 1,5 mL stok tüpler içine (adımından 2.5) aktarmak ve onları buza koy. (-20 ° C'de) protein hisse senedi tüpler dondurma önce süpernatant 0.012 mL (adımından 2.5) ilk numune hazırlama için 0.5 mL önceden soğutulmuş tüpler içine transfer ve buz üzerinde bırakın.

3. numune hazırlama-kapiller Protein ölçümü için

  1. Bir kit kullanın ve reaktifleri üreticinin talimatına göre ayrılması için hazır olun. Master-mix reaktif 0,003 mL 0.5 mL (Kimden adım 2.5) tüpler buzda 0.012 mL proteini özleri içeren etiketli 12 örneklerinde her ekleyin.
  2. Isıtma blok 95 ° c açın ve biotinylated molekül ağırlıklı (MW) merdiven bir tüp 0,016 mL deiyonize su ile 3.1. adımda hazırlanan reaktif 0,004 mL ekleyin. Merdiven ve örnekleri tabiatını, merdiven tüp ve unprimed proteini özleri 12 örnekleri 5 min için 95 ° C ısı bloğunda yerleştirin ve kadar kullanmak 4 ° C'de depolamak için.
  3. Adım protein ayıklama için numune hazırlama, 2.0 3.2, kolostrum astarlanmalıdır sıçanlarından emir yumruk çekirdekler için yineleyin.

4. Elektroforez hazırlık

  1. (-80 oC derin dondurucuda depolanan) reaktif tezgah üzerinde etiketleme biotin çözülme ve üreticinin yönergeleri takip 4 ° C'de buzda protein algılama çantası hazırla.
  2. Luminol 0.15 mL peroksit 0.15 mL ile mix ve 0,01 mL plaka otomatik Batı makine için 25 wells (satır E, kuyu 1 / 25) yükleyin. Streptavidin-HRP 0,008 mL Seti'nden kuyu D1 D25 için yük
  3. 0,01 mL antikor Dilüent çözeltisi wells C1 C25 ve B1 içine yükleyin.
  4. 24 protein örnekleri ve merdiven tüpler kısa bir süre (2-3 saniye) bir minicentrifuge tüp kapağıyla buharlaştırılmış su havuzu için spin.
  5. 12 unprimed örnekleri 0,003 mL wells A2 A13, 0,003 mL 12 kolostrum astarlanmalıdır örnekleri içine kuyu A14 A25 için ve iyi A1 içine biotinylated merdivenin 0.005 mL yüklemek.
  6. Satır F boş bırakın ve her biri 5 bölmeleri altındaki satırı F. kalan yordamları sırasında buharlaşma önlemek için kapak plastik kapağı ile plaka 3 satırlarının her birindeki yıkama arabelleği 0,45 mL yüklemek.
  7. Kısaca girdap çözdürülen biotin 0.15 mL reaktif için belirlenen onun tüp; ekleyin ve reaktif etiketleme o zaman için toplam protein sulandırma Ajan 0.15 mL ve homojenliği için karıştırın.
  8. Plaka kapağını çıkarın ve kuyu B2 B25 için 1 ve 2 ajanların 0,01 mL yüklemek. Plaka kapak ve herhangi bir hava kabarcıkları çeşitli çözümlerinden kaldırmak için 1000 x g, 10 dk santrifüj kapasitesi. Boş bir levha santrifüj dengesi için kullanın.

5. Elektroforez

  1. Plaka dönüyor iken çalışan bir dosyası otomatik Batı bilgisayar makine bağlı toplam protein tahlil çalıştırmak için "dosya" açılan sayfadan gösteren ve ilgili nokta tıklatarak açın.
  2. Bilgisayar kuyuda tarafından örnekleri açıklama ekleyin. Plaka santrifüj kaldır kapağını kaldır ve dikkatle ayrılık çözüm bölmeleri alüminyum kapağından akasındaki.
  3. Plaka otomatik Batı enstrüman yerleştirin, kapiller kartuş kutusu kapağından akasındaki, belirlenen yerinde kartuşu takın ve kapıyı kapat.
  4. "Çalıştır" düğmesini tıklatın ve tahlil ("Toplam protein") türü ile istendiğinde adına örnekleri yazın (örneğin, "unprimed 2-13 ve kolostrum astarlanmalıdır 14-25"). Tıkırtı "OK" ve aktif çalışma tarih ve çalışma dosyasının kimliği numarası tarafından istendiğinde Çalıştır bittiğinde zaman not alın.
  5. Çalıştır (başladıktan sonra 170 dk) sonunda, enstrüman kapıyı aç, kapiller kartuşunu çıkarın ve "Sharps" bertaraf atmak. Biyolojik madde elden plaka atmak.
  6. Çalışma dosyasının analiz sayfasını ayırma Eğriler simgesini tıklatın ve tüm örneklerini düzgün çalışması ve birden fazla protein eğriler tüm kılcal gösterilen kontrol edin.

6. proteinler Sinyal Analizi

  1. Etiketli 1,5 mL Tüp, tavşan Fosfo-eIF2a (p-eIF2a) antikor anti 0,003 mL ekleyin ve antikor uygun algılama Seti'nden Dilüent 0.3 mL (1: 100 seyreltme) askıya. Daha sonra buz üzerinde tutmak.
  2. Luminol tüp etiket ve bu algılama modülü Seti'nden 0.15 mL luminol ve peroksit 0.15 mL ekleyin ve içine kuyu E1 E25 taze, otomatik Batı plaka için 0,01 mL dağıtmak.
  3. Tavşan antikor wells D2 D25 için içine anti ikincil 0,01 mL dağıtmak ve streptavidin-HRP 0,01 mL teçhizat--dan iyi D1 için ekleyin.
  4. Birincil antikor (Kimden adım 6.1) içine kuyu C2 C25 için 0,01 mL dağıtmak ve kuyu C1 ve B1 B25 için 0,01 mL antikor Dilüent 2 çözeltisi ekleyin.
  5. Satır F wells boş bırakın ve yıkama arabelleği 0,45 mL 5 bölmeleri F satırının altında 3 satır içine doldurun.
  6. Kısa bir süre buzdolabında örnekleri 3 için spin s ve her örnek 0,003 mL satıra A onlar olduklarını da sözlerine ekledi için A25 A2 başlayan toplam protein tahlil için aynı sırada ekleyin. A1 iyi ve plaka kapak için biotinylated MW merdiven 0.005 mL ekleyin.
  7. Plaka santrifüj kapasitesi 4,8 adımda yapılır. Plaka dönüyor, (otomatik Western ilişkili yazılım ve bilgisayar) yeni bir çalışma dosyası açın ve açılan sayfada "dosyasından ilgili nokta tıklatarak bir moleküler boyutu tahlil çalıştırmak için" gösterir.
  8. Tahlil sayfa örnek adları her kılcal yazın, sonra da ayrılmış nokta ve ikincil Anti-tavşan antikor altındaki birincil antikor adını yazın.
  9. Bu sefer çalışma dosyasına verilen ad-meli var olmak "unprimed 2-13 ve kolostrum astarlanmalıdır 14-25 p-eIF2a" dışında Santrifüjü sonunda adımları 5.3-5,5, tekrarlayın.
  10. Elektroforez boşanmadan sonra 40-43 kDa boyutlarında antijenleri doruklarına bağışıklık-reaktivite için çalışma dosyasını denetleyin. MW zirvesinin bu boyutu olduğu eksik, eğrisi sağ tıklatın ve boyut ve eğri aşağıda rasgele miktar kaydedilir sağlar zirvesine MW eklemek için aşağı açılan liste içinde gösterir.

7. sonuçlar işleniyor

  1. Toplam protein için bir elektronik tablo dosyasını çalıştırın otomatik Western açık dosyasını çalıştırın ve bir kimlik numarası sağlar.
  2. Toplam protein tahlil Analiz sayfasında eğrisi modunda çalışma dosyasını açın ve bireysel kılcal Peaks'e işaretleyin. Sonra kopyalayın ve bunları elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz ve tüm kılcal kaydedilen tüm tepeler eğri altındaki alanları toplamı.
  3. Ayrı bir sütunda protein toplam miktarı her sütun için Yerleştir kapiller numaraları, ilgili beyin çekirdekleri ve kimlik numaraları çalışma dosyalarının adları ile.
  4. P-eIF2a antijen için ve tek bir sütunda bir elektronik tablo açın, her taraftan kılcal yan-tarafından-eğri altındaki alan kayıt onun ilgili kapiller numarası, beyin çekirdeği ve kimlik numarası çalışma dosyasının adı.
  5. Toplam protein sütun (paralel p-eIF2a eğrisi miktarları için) üçüncü bir elektronik tabloya kopyalayın ve p hesaplamak-eIF2a:total protein oranlarının üçüncü bir sütun.
  6. Her beyin çekirdeği için 4-6 arası adımları sonuçları toplamak, çekirdeği gruplar halinde onları düzenlemek ve bir çubuk grafik oluşturmak.

Sonuçlar

İmmunoreactivity göre toplam protein temsilcisi bantları beyin çekirdekleri çok düşük hasat protein ile olduğunu göstermektedir. Bu kanonik Western blot karşılaştırıldığında son derece hassas otomatik Western blot tekniğin kullanımı gerektirir. Bu yaklaşım lane Batı lekesi içinde başına göre kılcal başına fortyfold daha az protein ile çalıştırabilirsiniz.

Kolostrum astar farklı etkileri beyin çe...

Tartışmalar

Mikrodiseksiyon ayrı olan bir tekniği, OTR zengini beyin çekirdekleri yenidoğan sıçan beyin bu yazıda sunulur. Bu nöronlar yüksek, beyindeki iyi karakterize hücre çekirdeği içinde bile uzmanlaşmış olan bu de tanınır. Sağlam hipotez testleri belirli OTR zengini çekirdeği yalıtmak için son derece tekrarlanabilir bu yaklaşım sağlar. Otomatik Western blot kullanarak, tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sonuçları daha da düzeldi. Bu tekniğin bir sınırlama mütevazı beyin yumruk değişkenlik ka...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Manon Ranger ve Alexandra Schulz bu protokolü hazırlarken kendi yardım için teşekkür ederiz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Bradford solutionBio Rad
Protein lysis kitProtein simpleCBS403Bicine/CHAPS
WES kitsProtein simpleWES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugateProtein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2aCell Signaling technologySER51, 9721
mouse mAb anti-PKRCell Signaling technology2103
Rabbit anti-phospho-PKRMilliporeThr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKRCell Signaling technology12297
rabbit mAb anti-GAPDHCell Signaling technology2118
mouse mAb anti-phospho-IKBCell Signaling technology9246
mouse mAb anti-IKBCell Signaling technology4814
rabbit anti-BiPCell Signaling technology3183
Rabbit anti GCN2Cell Signaling technology3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2BIORBYTT899
pregnant Sprague-Dawley ratsCharles River Laboratories
Punch deviceWellTech Rapid Core or Harris Uni-Core0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50

Referanslar

  1. Hietaniemi, M., et al. Gene expression profiles in fetal and neonatal rat offspring of energy-restricted dams. Journal of Nutrigenetics and Nutrigenomics. 2 (4-5), 173-183 (2009).
  2. Okabe, A., et al. Homogenous glycine receptor expression in cortical plate neurons and Cajal-Retzius cells of neonatal rat cerebral cortex. Neuroscience. 123 (3), 715-724 (2004).
  3. Mailleux, P., Takazawa, K., Erneux, C., Vanderhaeghen, J. J. Distribution of the neurons containing inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase and its messenger RNA in the developing rat brain. Journal of Comparative Neurology. 327 (4), 618-629 (1993).
  4. Carter, C. S. Oxytocin and Human Evolution. Current Topics in Behavioral Neuroscience. , (2017).
  5. Sippel, L. M., et al. Oxytocin and Stress-related Disorders: Neurobiological Mechanisms and Treatment Opportunities. Chronic Stress (Thousand Oaks). 1, (2017).
  6. Agnati, L. F., et al. Aspects on the integrative actions of the brain from neural networks to "brain-body medicine". Journal of Receptors and Signal Transduction Research. 32 (4), 163-180 (2012).
  7. Welch, M. G., Margolis, K. G., Li, Z., Gershon, M. D. Oxytocin regulates gastrointestinal motility, inflammation, macromolecular permeability, and mucosal maintenance in mice. American Journal Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 307 (8), G848-G862 (2014).
  8. Welch, M. G., et al. Expression and developmental regulation of oxytocin (OT) and oxytocin receptors (OTR) in the enteric nervous system (ENS) and intestinal epithelium. Journal of Comparative Neurology. 512 (2), 256-270 (2009).
  9. Prakash, B. S., Paul, V., Kliem, H., Kulozik, U., Meyer, H. H. Determination of oxytocin in milk of cows administered oxytocin. Analytica Chimica Acta. 636 (1), 111-115 (2009).
  10. Solangi, A. R., Memon, S. Q., Mallah, A., Khuhawar, M. Y., Bhanger, M. I. Quantitative separation of oxytocin, norfloxacin and diclofenac sodium in milk samples using capillary electrophoresis. Biomedical Chromatography. 23 (9), 1007-1013 (2009).
  11. Klein, B. Y., et al. Oxytocin modulates markers of the unfolded protein response in Caco2BB gut cells. Cell Stress and Chaperones. 19 (4), 465-477 (2014).
  12. Klein, B. Y., Tamir, H., Hirschberg, D. L., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Oxytocin modulates mTORC1 pathway in the gut. Biochemical and Biophysical Research Communications. 432 (3), 466-471 (2013).
  13. Klein, B. Y., Tamir, H., Ludwig, R. J., Glickstein, S. B., Welch, M. G. Colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi. Biochemical an Biophysical Research Communications. 487 (1), 47-53 (2017).
  14. Donnet-Hughes, A., et al. Potential role of the intestinal microbiota of the mother in neonatal immune education. Proceedings of the Nutritional Society. 69 (3), 407-415 (2010).
  15. Perez, P. F., et al. Bacterial imprinting of the neonatal immune system: lessons from maternal cells?. Pediatrics. 119 (3), e724-e732 (2007).
  16. Takeda, S., Kuwabara, Y., Mizuno, M. Concentrations and origin of oxytocin in breast milk. Endocrinolcia Japonica. 33 (6), 821-826 (1986).
  17. Quintana, D. S., Outhred, T., Westlye, L. T., Malhi, G. S., Andreassen, O. A. The impact of oxytocin administration on brain activity: a systematic review and meta-analysis protocol. Systematic Reviews. 5 (1), 205 (2016).
  18. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), 79-83 (1979).
  19. Orr, M. E., Garbarino, V. R., Salinas, A., Buffenstein, R. Extended Postnatal Brain Development in the Longest-Lived Rodent: Prolonged Maintenance of Neotenous Traits in the Naked Mole-Rat Brain. Frontiers in Neuroscience. 10, 504 (2016).
  20. Hansson, J., et al. Time-resolved quantitative proteome analysis of in vivo intestinal development. Molecular and Cellular Proteomics. 10 (3), (2011).
  21. Mochizuki, K., Yorita, S., Goda, T. Gene expression changes in the jejunum of rats during the transient suckling-weaning period. Journal of Nutritional Science and Vitaminology (Tokyo). 55 (2), 139-148 (2009).
  22. Rinaman, L., Banihashemi, L., Koehnle, T. J. Early life experience shapes the functional organization of stress-responsive visceral circuits. Physiology and Behavior. 104 (4), 632-640 (2011).
  23. Johannes, G., Sarnow, P. Cap-independent polysomal association of natural mRNAs encoding c-myc, BiP, and eIF4G conferred by internal ribosome entry sites. RNA. 4 (12), 1500-1513 (1998).
  24. Rinaman, L. Hindbrain noradrenergic A2 neurons: diverse roles in autonomic, endocrine, cognitive, and behavioral functions. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 300 (2), R222-R235 (2011).
  25. Walker, C. D., Toufexis, D. J., Burlet, A. Hypothalamic and limbic expression of CRF and vasopressin during lactation: implications for the control of ACTH secretion and stress hyporesponsiveness. Progress in Brain Research. 133, 99-110 (2001).
  26. Montiel-Castro, A. J., Gonzalez-Cervantes, R. M., Bravo-Ruiseco, G., Pacheco-Lopez, G. The microbiota-gut-brain axis: neurobehavioral correlates, health and sociality. Frontiers in Integrative Neuroscience. 7, 70 (2013).
  27. Blevins, J. E., Ho, J. M. Role of oxytocin signaling in the regulation of body weight. Reviews in Endocrine and Metabolic Disorders. 14 (4), 311-329 (2013).
  28. Welch, M. G., et al. Combined administration of secretin and oxytocin inhibits chronic colitis and associated activation of forebrain neurons. Neurogastroenterology Motility. 22 (6), 654 (2010).
  29. Berthoud, H. R., Neuhuber, W. L. Functional and chemical anatomy of the afferent vagal system. Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 85 (1-3), 1-17 (2000).
  30. Taniuchi, S., Miyake, M., Tsugawa, K., Oyadomari, M., Oyadomari, S. Integrated stress response of vertebrates is regulated by four eIF2alpha kinases. Scientific Reports. 6, 32886 (2016).
  31. Altschuler, S. M., Bao, X. M., Bieger, D., Hopkins, D. A., Miselis, R. R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. Journal of Comparative Neurology. 283 (2), 248-268 (1989).
  32. Shapiro, R. E., Miselis, R. R. The central neural connections of the area postrema of the rat. Journal of Comparative Neurology. 234 (3), 344-364 (1985).
  33. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).
  34. Nayak, R., Pintel, D. J. Adeno-associated viruses can induce phosphorylation of eIF2alpha via PKR activation, which can be overcome by helper adenovirus type 5 virus-associated RNA. Journal of Virology. 81 (21), 11908-11916 (2007).
  35. Zaborske, J. M., et al. Genome-wide analysis of tRNA charging and activation of the eIF2 kinase Gcn2p. Journal of Biological Chemistry. 284 (37), 25254-25267 (2009).
  36. Hollis, J. H., Lightman, S. L., Lowry, C. A. Integration of systemic and visceral sensory information by medullary catecholaminergic systems during peripheral inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 1018, 71-75 (2004).
  37. Klein, B. Y., et al. Oxytocin opposes effects of bacterial endotoxin on ER-stress signaling in Caco2BB gut cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1860 (2), 402-411 (2016).
  38. Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. NF-kappaB in the nervous system. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (3), a001271 (2009).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 141besin yetersizli iekirde i tractus solitarius NTSstres yan tgenel denetim nonderepressible 2 GCN2n kleer fakt r kB NF kBkaryotik eviri ba latma fakt r 2A eIF2a

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır