Bewertung von zellulären Stresses und Entzündung im diskreten Oxytocin-sezernierenden Gehirn Kerne bei Neugeborenen Ratten vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Gehirn Kerne im neonatalen Rattengehirn in Verbindung mit der ersten Fütterung Kolostrum zu isolieren. Diese Technik erlaubt die Studie von Nährstoff-Insuffizienz Stress im Gehirn wie von Enterozyten Signal moduliert.

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist, Oxytocin-Rezeptoren reichen Gehirn Kerne im neonatalen Gehirn vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum zu isolieren. Die Expression von Proteinen reagieren auf metabolischer Stress bekannt wurde im Gehirn-Kerne Isolate mit Western blotting gemessen. Dies wurde getan, um festzustellen, ob metabolischen Stress-induzierte Nährstoff Mangel im Körper neuronalen Stress ausgelöst. Wir haben bereits gezeigt, dass Nährstoff Insuffizienz bei Neugeborenen metabolischer Stress im Darm entlockt. Darüber hinaus moduliert Kolostrum Oxytocin zellulären Stress Response, Entzündung und Autophagie Marker in Neugeborene Ratte Darmzotten vor und nach ersten Feed. Signalisierung von Protein-Marker, die mit dem endoplasmatischen Retikulum Stress [ER Chaperon Immunglobulin Bindeprotein (BiP), eukaryotic Übersetzung Einleitung Faktor 2A (eIF2a), und eIF2a-Kinase Proteinkinase R (p-PKR)], sowie zwei Entzündung-Signalisierung Proteine [nuklearer Faktor κB (NF-kB) und Inhibitor κB (IkB)], wurden in Neugeborenen Gehirn Kerne gemessen [Kern des einsamen Trakt (NTS), paraventrikulären Nukleus (PVN), supra-Optik Kern (Sohn), Kortex (CX), Striatum Kerne (STR), und mediale präoptischen Kern (MPO)] vor der ersten Feed (entschärften von Kolostrum) und nach dem Start der Krankenpflege (grundiert von Kolostrum). Ausdruck des BiP/GRP78 und p-eIF2a wurden hochreguliert in ungestrichenen und herunterreguliert in grundiert NTS Gewebe. NF-κB wurde (hoch) in das Zytoplasma CX, STR und MPO beibehalten, während NF-κB niedriger und im NTS, PVN und Sohn unter beiden Bedingungen unverändert war. Die kollektiven BiP und p-eIF2 Erkenntnisse stehen im Einklang mit einer Stress-Reaktion. eIf2a war der Sohn, CX, STR und MPO durch DsRNA abhängige Kinase (p-PKR) phosphoryliert. Allerdings wurde in der NTS (und in geringerem Maße in PVN), eIf2a von einem anderen Kinase, allgemeine Kontrolle-Nonderepressible-2-Kinase (GCN2) phosphoryliert. Die Stress-modulierende Mechanismen zuvor beobachtet in Neugeborenen Darm Enterozyten erscheinen in einigen OTR-reiche Gehirnregionen gespiegelt werden. Die NTS und PVN kann einen unterschiedlichen Phosphorylierung-Mechanismus (unter Nährstoffmangel) aus anderen Regionen zu nutzen und refraktär gegenüber den Auswirkungen der Nährstoff-Insuffizienz. Diese Daten zufolge Kollektiv Gehirn Reaktionen auf Nährstoff-Insuffizienz Stress durch Signalisierung von Kolostrum grundiert Enterozyten ausgeglichen sind.

Einleitung

Im Gegensatz zu unserem Verständnis der frühen Entwicklung des Gehirns im Laufe von Tagen bis Wochen nach der Geburt auftreten, ist relativ wenig über die Vielzahl von dynamischen Veränderungen in den ersten Stunden des Lebens in Ratten bekannt. Eine zentrale Herausforderung wurde die geringe Größe des Gehirns neonatalen Ratte und eine Voraussetzung für High-Tech-Werkzeuge, diskrete Hirnregionen oder einzelne Zellen zu isolieren. Studien beurteilen oft gen Transkription und keine Übersetzung^1,2, die kein festes Verständnis der funktionalen Ebenen der aktivierten Signalmoleküle geben. Andere untersuchen Ausdruck verwenden Immunohistochemistry, Referenz Hirnregionen, die für die Quantifizierung der Ausdruck Level³nicht zulässt. Keine Studie bis heute hat die Aktivierung der Signalwege verbunden mit Ratten erste Colostrum ernähren sich in diskreten Hirnregionen, die erfordert schnelle Isolierung und Opfer und Messung der Proteinexpression und Protein-Phosphorylierung mit westlichen untersucht beflecken. Während auf älteren und größeren Gehirn Gehirn Mikrodissektion durchgeführt wird, haben wir keinen Verweis durchführen einen Single-Cell Gehirn Schlag in einem P0 Gehirn identifiziert. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Isolierung von eingeschränkter Hirnregionen Neugeborenen mit einer relativ Low-Tech-Punch-Technik und ein Western-Blot-Verfahren zur Proteinexpression in relativ kleinen Proben zu messen. Dieses Protokoll möglicherweise geeignet für Forschungsfragen, die die Beurteilung der Proteinexpression und post-translationalen Modifikationen erfordern (z. B.., Phosphorylierung) in relativ begrenzten Regionen kleine Gehirne aller Arten, sofern die Benutzer kann die Hirnregion des Interesses mit Atlas und identifizierbaren Wahrzeichen optisch identifizieren.

Diese Technik wurde entwickelt, um Veränderungen im Gehirn durch die Neugeborenen Ratten erste Kolostrum zu füttern, die ist reich an Oxytocin (OT) zu verstehen. OT ist seit langem bekannt für seine Fähigkeit, Milch Milchspendereflex und uterine Kontraktion zu stimulieren. OT ist jedoch jetzt bekannt, um eine Vielzahl von Rollen spielen bei der Regulation vieler Körperfunktionen und Verhaltensweisen⁴. Z. B. OT wendet sich gegen Stress und Entzündungen in Verbindung mit adaptive affiliative Verhaltensweisen⁵, verzögert die Magenentleerung und verlangsamt die Darmpassage. OT-Rezeptoren (OTR) wurden im enterischen Neuronen und Darmepithel^6,7,8nachgewiesen. Die Magen-Darm-Wirkungen der OT sind besonders wichtig für das Kind während der frühen postnatalen Periode. Zum Beispiel stillen ist verbunden mit der Lieferung von erheblichen Mengen von OT zu den Neugeborenen Darm^9,10, und Daten zeigen, dass die OTR während die Milch, die Periode⁸Spanferkel im Zwölffingerdarm Zotten stark überexprimiert ist.

In-vitro- Experimente mit einer Darm-Zelllinie haben auf zellulärer Ebene unter Beweis gestellt, dass Oxytocin moduliert wichtiger Moleküle in den Stress Weg^11,12 -Signalisierung und spielt eine regulierende Rolle in der Übersetzung von Proteinen ¹². diese Studien deuten darauf hin, dass Bestandteile der Milch, einschließlich exogener Oxytocin von der Mutter in unfolded Protein Response beim Neugeborenen zu zellulären Stresses¹³wichtig sind.

In Vivo und ex Vivo -Studien haben gezeigt, dass Kolostrum OT die zellulären Stress Response, Entzündung und Autophagie Marker in Neugeborene Ratte Darmzotten moduliert. Neugeborenen Enterozyten erleiden erhebliche zellulären Stresses auf ihrer luminalen Seite wenn Darm Microbiota gleichzeitig von der Mutter in Kolostrum^14,15 und zahlreichen Proteinen, einschließlich der Hormone wie OT⁹ ausgesetzt ist ^{, 10 , 16}.

Die Auswirkungen der OT auf das Gehirn wurden studierte¹⁷. Die OT Signalisierung Mechanismen im Darm während der frühen postnatalen Periode nachgewiesen wurden jedoch nicht im Gehirn untersucht. In diesem Papier wird eine Methode zur Isolierung von diskreten Gehirn Kerne in der neonatalen Ratte Hirnstamm und Hypothalamus mit Elektrophorese verwendet, isolierte Hirnregionen zu profilieren. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, den Zustand der Zelle signalisieren in Hirnareale so nah wie möglich an Geburt, vor und nach der ersten Milch saugen, im Hirngewebe mit dem niedrigsten Glia/neuronale Index zu erfassen. Die Gründe für die Entwicklung dieser Technik ist, dass es für die schnelle Lokalisierung der eingeschränkt, mikroskopische Gehirnregionen bei neugeborenen Welpen mit einer homogeneren Sammlung von Neuronen für ex-Vivo -Studien mit einer automatisierten Western blotting Methodik, bietet sehr konsistente Ergebnisse auf relativ kleine seziert Proben. Ein Manko der vorherige Arbeit beinhaltet mehr Brutto Dissektion (Gehirnscheiben oder ganze Gehirn) und ältere Tiere^18,19. Die Gehirne von jungen Welpen sind unglaublich dynamisch, mit Wellen von Gliazellen Differenzierung nach der Geburt. Um Veränderungen im Gehirn beeinflusst durch der Welpen erste Fütterung zu studieren, ist das Studium beschränkt neuronalen Kerne mit reproduzierbaren Dissektion notwendig.

Milch-Feed wird in der Regel für ihre Ernährungs- und immunologische Auswirkungen auf Gesundheit oder gen-Ausdruck (z. B. im Enterozyten^20,21), analysiert, während seine Wirkung auf Hirnareale während der Entwicklung des Gehirns ist kaum untersucht. Die Wirkung der Milch Transit im Darm auf die Gehirnfunktion wurde in Anlehnung an Darm Cholecystokinin Rezeptoren vagalen Relais Hirnstamm Kerne, aber nicht auf intrazelluläre Signal-Wege²²analysiert. Gibt es eine umfangreiche Literatur auf das sich entwickelnde Gehirn Neugeborene Anfälligkeit für Unterernährung der Mütter während der Schwangerschaft²³, aber der Stress und Entzündungen Signale werden nicht angesprochen. Die aktuelle Methode nutzt vor allem ein Phänomen bei Tag Null Ratte Neugeborenen, das Blut geboren Kolostrum Reize von vagalen Relais des viszeralen Reize isoliert. Dies ist die so genannte Hypo-Reaktionsfähigkeit Stressphase geprägt von unreifen Nucleus Gowersbündel Solitarius (NTS)-Hypothalamus Schaltung unmittelbar nach der Geburt^24,25 , die NTS, paraventrikulären Nukleus (PVN), einschränkt und supraoptischen Kern (Sohn) Signale auf Blut geboren Reize.

Diese Methode ist nützlich für die Analyse von mehreren Signalwege und relativ auf neuronalen Zellen beschränkt, sofern Hirngewebe bei postnatalen Tag-0 bei Ratten geerntet wird, neben ob Mütter in Frage gestellt haben, indem Sie jede Art von Behandlung während der Schwangerschaft. Würfe können für die Wirkungen von Kolostrum feed versus Pre füttern Signalisierung analysiert werden. Beim Vergleich von Signalen zwischen den Hirnarealen mit Armen im Vergleich zu reiche Proteinausbeute ermöglicht diese Methode in der Kapillare Bestimmung des Gesamt-Protein der Polypeptid-Bands in Kapillaren, die parallel zur immun-Quantifizierung der Protein-Antigene. Diese Methode ermöglicht den quantitativen Vergleich, mit willkürlichen Maßeinheiten, Ergebnisse, die durch die gleichen Antikörper ohne quantitative Standardkurven und unter Bezugnahme auf Gesamt-Protein pro Kapillare. Vergleich der Ergebnisse von verschiedenen Antikörpern ist möglich nur mit quantitativen standard Kurven.

Diese Methode erlaubt für die Beurteilung der bidirektionalen Signaltechnik zwischen Darm und Gehirn und dass Funktion in beiden Organen²⁶auswirken kann. Die Zuordnung zwischen Oxytocin und Nahrungsaufnahme, die in den letzten Jahren²⁷ausführlich studiert hat, unterstützt einen Zusammenhang zwischen erhöhten Oxytocin Signal- und Nährstoffverfügbarkeit. Diese Studien auch unterstützen das Converse-Konzept diese Energie, die Defizite mit Reduzierung des Hypothalamus Oxytocin Signalisierung gekoppelt sind.

Frühere Studien über die Wirkung von OT auf Aktivität des Gehirns gezeigt, dass induzierte Darm Entzündung cFos Transkription im Hypothalamus PVN, Amygdala und Piriform Rinde löste die refraktär gegenüber Vagotomie²⁸war. Systemische Infusion von OT mit Sekretin sank jedoch die Gehirn cFos Reaktion provoziert entzündliche Reaktion in der Darm-²⁸. Dies suggeriert, dass die Wirkung von exogenen OT durch Strecken außer vagalen Relais, möglicherweise durch Blut übertragbare Signalmoleküle, durchgeführt durch die Area Postrema^6,29durchgeführt wurde.

In dieser Studie wurden die zellulären Stresses Signalwege, die zuvor im Darm beobachtet haben im Gehirn bewertet. Die Hypothese war, dass Milchbestandteile können zu schützen oder die Wirkung von Entzündungen im Darm Durchlässigkeit für mikrobielle und andere Metaboliten zu verschieben, und wiederum, die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion. Die klare antagonistischen Unterschiede in der IkB versus BiP Signalisierung gefunden in Zotten, vor und nach dem Grundieren von Kolostrum¹³, vorgeschlagen, dass die Gehirne von Neugeborenen, noch in der Entwicklung, diese Signale Kolostrum-induzierte Darm spüren können.

Signalisierung Protein-Marker verwendet in früheren Darm-Experimente, die mit endoplasmatische Retikulum Stress verbunden sind, wurden gemessen. Dazu gehören das ER Chaperon BiP, Übersetzung Einleitung Faktor eIF2a (dient als eine Stress-Reaktion Integrator³⁰), eIF2a-Kinase p-PKR, und zwei Entzündung-Signalisierung Proteine (NF-kB und die IkB-Hemmer).

Sechs Regionen des Gehirns aufgrund ihrer Fähigkeit bei Erwachsenen absondern oder reagieren auf OT wurden ausgewählt. NTS, befindet sich in der oberen Medulla, ist das erste Relais der viszeralen Eingabe und erhält direkte Signalisierung von vagalen sensorischen Neuronen im Darm³¹ und möglicherweise Blut geboren Zytokine, Toxine und Hormone über die angrenzenden Bereich Postrema³². Der PVN supraoptischen Kern (Sohn), Striatum Kerne (STR), Großhirnrinde (CX) und mediale präoptischen Kern (MPO) erhalten aus dem Bauch heraus über die NTS-Signalisierung.

Ergebnisse zeigten, dass die zellulären Stress-Reaktion während der unmittelbaren postnatalen vor Kolostrum Grundierung und unmittelbar nach der ersten Fütterung in NTS im Vergleich zum PVN und Sohn unterscheidet. Signalisierung im CX, unterschieden sich STR und MPO PVN und Sohn, sowie. Die unterschiedlichen Schutzfunktionen der zuvor gezeigten Zelle Stress und Entzündungen im Darm zu modulieren OT sind wahrscheinlich durch einige Bereiche des Gehirns spürte. Kollektiv, zeigen die Daten, dass auf zellulärer Ebene, während der ersten Stunden nach der Geburt, das Gehirn zu den metabolischen Stress mit Nährstoff-Insuffizienz reagiert. Die Daten zeigen auch, dass das Ausmaß und die Richtung der modulierenden Wirkungen der feed Kolostrum Region-abhängig sind und in einigen Regionen sie OT Effekte im Darm zuvor gezeigten spiegeln.

Protokoll

Diese Studie wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschüsse an der Columbia University und der New York State Psychiatric Institute genehmigt.

(1) Gewebe-Vorbereitung

1. Bestellen Sie zeitgesteuerte trächtigen Ratten vom Hersteller.
2. Folgen Sie zeitgesteuerten trächtigen Ratten durch die Beobachtung ihrer wachsenden Bäuche in den Wochen nach ihrer Ankunft und anschließend auf der Suche nach Welpen auf den voraussichtlichen Liefertermin durch die Überprüfung des Käfigs alle 2 h bis Lieferung beginnt.
3. Welpen mit einer behandschuhten Hand ihren Schwanz vor ihr erstes Futter für ungestrichenen Welpen (keine weiße Milch Bauch ergibt sich beim Bauch anzeigen) oder nach der ersten Fütterung für grundierte Welpen (an welcher Stelle ein weißen Bauch auf ihren Bauch sichtbar ist) zu entfernen, wie in der Timeli beschrieben Ne (Abbildung S1).
   Hinweis: Der erste Kolostrum-Feed wird als Grundierung der Welpe bezeichnet; Somit ist ein Welpe ungestrichenen bis das erste Futter, woraufhin Kolostrum grundiert sind.
4. Enthaupten Sie schnell den unanesthetized Welpen mit scharfen, sauberen chirurgische Schere.
5. Entfernen Sie das Gehirn durch Schneiden der Haut nach unten die Mittellinie und die Oberseite des Schädels an der Nase. Dann mit Pinzette, vorsichtig Hebeln Sie entfernt des Knochens um das Gehirn (Abbildung 1A) aufzudecken und zu lokalisieren Bregma, mit einem Stift markieren, da die Knochenplatten entfernt werden (Abbildung 1 b).
6. Legen Sie das ganze Gehirn schnell in eine Polymethyl Methacrylat Gehirn Form bei Raumtemperatur für koronal schneiden bei Raumtemperatur (Abbildung 1).
7. Ohne Verzögerung machen Sie 500 mm dicke Scheiben mit einer frischen Rasierklinge. Legen Sie die Scheiben rostral zur kaudalen in einer Petrischale weiterhin Orientierung der Abschnitte (Abbildung 2).
8. Schnell hinzufügen künstlicher Liquor cerebrospinalis (ACFS; 1,0 mM KH₂PO₄, 26 mM Nahco3₃, 118,6 mM NaCl, 3,0 mM KCl, 203,3 mM MgCl₂-6 H₂O) ohne Glukose und inkubieren Sie die Scheiben für 60 min bei 28-30 ° C, ständig rühren, auf ein Orbitalschüttler metabolisch und differentiell versus Kolostrum-vorbereitete Gewebe die ungestrichenen herauszufordern.
9. Die Gehirn-Kerne, die erforderlich sind, um Punsch mit einem Gehirn Atlas³³ und anatomischen Landmarken auf Abschnitt Gewebe zu identifizieren. Legen Sie diese Scheibe mit den Kernen von Interesse in einer Petrischale und verschieben Sie ihn auf dem sezierenden Mikroskop.
10. Sobald visualisiert, Stanzen Sie schnell 4 von 6 verschiedenen Kernen mit einem erbohrte Tool, Auswahl der Größe den Kern in Frage am besten Punsch und konsequent zwischen Proben (Abbildung 2 aus).
    Hinweis: Die übrigen Gehirn-Scheibe ein Loch haben nun dem Gehirngewebe entfernt wurde. In dieser Studie herausgeschnitten wir die folgenden Kerne mit den folgenden Koordinaten. Alle anterior/Posterior (A / P) Koordinaten sind von Bregma (mit Ausnahme von NTS, die unter Bezugnahme auf die Calamus Scriptorius ist). Alle dorsal/Ventral (D/V) Koordinaten sind von der Oberfläche des Kortex (mit Ausnahme von NTS, die von der Oberfläche der Medulla ist). Die folgenden Koordinaten enthalten A / P, Medial/Lateral (M/L) und D/V in mm: 1) einsame Trakt Kern (NTS, A / P, 0,4 bis 0,8; L, ± 0,2; D/V, 0.3 (von der Oberfläche der Medulla), 2) paraventrikulären Nukleus (PVN, -0,8; ± 0,2; 0), 3) supra-Optik Kern (Sohn, -1,1; ± 1,4; 4,3), 4) Kortex (CX, teilweise Kortex Bereich 1,-2.8; ± 1,5; 0,6), 5) Striatum Kerne (STR,-0.0; ± 1,6; 1,8), und 6) mediale Preoptic Kern (MPO, -0.6; ± 0,2; 4,2).
11. Tauchen Sie schnell die gestanzten Kerne in 0,06 mL eiskaltes, Protein Extraktionspuffer mit Protease-Inhibitoren und Phosphatase-Inhibitoren für 60 Minuten (siehe Punkt 2.3).

(2) Proteingewinnung

1. Bereiten Sie die Proteinlösung Extraktion mit dem Protein-Lyse-Kit (Table of Materials) am Tag vor der erwarteten Welpen Lieferung.
2. Tauen Sie die gefrorenen (-20 ° C) wässrige Lösung der Protease und Phosphatase-Inhibitoren die Lyse-Puffer-Kit (auf Eis) und die Lyse Puffer und DMSO-Lösung der Proteasen/Phosphatasen Inhibitoren auf Eis.
3. Fügen Sie 1,85 mL Lyse-Puffer in einer sauberen, eiskalte 15 mL-Tube. Fügen Sie 0,1 mL wässrige Lösung von Inhibitoren und 0,05 mL DMSO aufgelöst-Inhibitoren. Zu guter Letzt Kappe und kurz Vortex Rohr und halten Sie sie bei-20 ° C bis zur Verwendung.
4. Beschriften Sie 24 sauber Mikrozentrifugenröhrchen (0,5 mL) für die Lyse-Verfahren. Designierte 12 Tuben pro Gehirn für die Kolostrum entschärften Gruppe (U) [6 links (L) und 6 rechts (R) Gehirn Kerne] und Etikett nach Kernen Akronym, Seite und Zustand (z. B.., NTS-L-U, NTS-R-U, etc.). Beschriften Sie die zweite Gruppe von 12 Rohre für das Kolostrum-vorbereitete Proben.
5. Beschriften Sie zwei zusätzliche Sets von Rohren, wie in Schritt 2.4 für die Lager Protein-Extrakte (mit 1,5 mL Eppendorf-Stil Rohre) und der erste Satz der Probenvorbereitung (mit 0,5 mL Röhrchen) getan. Halten Sie diese Rohre in zwei separate, beschriftete Einfrieren Boxen (jeweils für 100 Rohre ausgelegt). Ein Feld wird für die ungestrichenen Proben, die andere für die präparierten Proben verwendet werden.
6. Tauen Sie die Lyse-Lösung auf dem Eis auf, auf den Tag, an dem die Welpen geliefert werden, und während der Inkubation Gehirnscheiben in ACFS, aliquoten 0,06 mL Lyse-Lösung in die Lyse Verfahren Röhren (von Schritt 2.4) und fügen Sie Kerne Schläge und im Eis 60 min inkubieren.
7. Zentrifugieren Sie der inkubierten lysierten Kerne für 30 min in einer gekühlten Mini-Zentrifuge bei 14000 u/min (10.000 x g) und abzusaugen Sie sorgfältig 0,055 mL überstand mit einer richtig eingestellten Pipette. Den Überstand in die vorgekühlte 1,5 mL Lager Röhren (von Schritt 2.5) übertragen und auf Eis gelegt. Vor dem Einfrieren (bei-20 ° C) die Protein Lager Rohre übertragen Sie 0,012 mL Überstand in 0,5 mL vorgekühlte Rohre für die erste Probenvorbereitung (aus Schritt 2.5) und lassen sie auf dem Eis.

(3) Probenvorbereitung für die Messung In der Kapillare Protein

1. Verwenden Sie eine Kit und bereiten Sie die Reagenzien für die Trennung nach Anweisungen des Herstellers. Fügen Sie 0,003 mL Reagenz Master-Mix hinzu, jeder der 12 Proben in der 0,5 mL beschriftet Röhren (von Schritt 2.5) auf dem Eis, die 0,012 mL der Protein-Extrakte enthalten.
2. Schalten Sie den Heizblock bis 95 ° C und 0,004 mL Reagenz in Schritt 3.1 an eine biotinylierte Molekulargewicht (MW) Leiter in einem Rohr mit 0,016 mL entionisiertem Wasser zubereitet. Um die Leiter und Proben zu denaturieren, legen Sie die Leiter-Röhre und 12 Proben von ungestrichenen Protein-Extrakten in Heizblock bei 95 ° C für 5 min und bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
3. Wiederholen Sie die Schritte 2.0 bis 3.2 Proteingewinnung zur Probenvorbereitung für die Kerne von Kolostrum grundiert Ratten gestanzt.

4. Elektrophorese-Vorbereitung

1. Tauen Sie das Biotin labeling Reagenz (gespeichert in der Tiefkühltruhe bei-80 ^oC) auf der Bank und bereiten Sie das Protein Detection Kit auf Eis bei 4 ° C nach den Anweisungen des Herstellers.
2. Mischen Sie 0,15 mL von Luminol mit 0,15 mL Peroxid und laden Sie 0,01 mL in 25 Brunnen (Zeile E, Brunnen 1-25) der Platte für die automatische westlichen Maschine. Laden Sie 0,008 mL Streptavidin-HRP aus dem Kit in Brunnen D1, D25
3. Laden Sie 0,01 mL diluent Antikörperlösung in Brunnen C1 C25 und B1.
4. Spin die 24 Proteinproben und Leiter Rohre kurz (2-3 Sekunden) in einem Minicentrifuge zum Pool hinunter verdampfte Wasser von Rohr Kappen.
5. Wells A2, A13, 0,003 mL 12 Kolostrum-vorbereitete Proben in Vertiefungen A14, A25 und 0,005 mL der biotinylierte Leiter in gut A1 bestücken Sie 0,003 mL 12 ungestrichenen Proben.
6. Lassen Sie Reihe F leer und laden Sie 0,45 mL Waschpuffer in jeder der 5 Fächer in jeder der 3 Zeilen unter Zeile F. Cover der Platte mit Kunststoff Deckel um Verdunstung während der verbleibenden Verfahren zu vermeiden.
7. Kurz die aufgetauten Biotin Wirbel Kennzeichnung Reagenz und 0,15 mL das Reagenz mit seiner ausgewiesenen Rohr; dann fügen Sie 0,15 mL Gesamtprotein Rekonstitution Agent hinzu und mischen sie zur Homogenität.
8. Entfernen Sie die Abdeckung von der Platte und laden Sie 0,01 mL Agenten 1 und 2 in Vertiefungen B2 B25. Die Platte abdecken und für 10 min bei 1000 X g, Luftblasen aus den verschiedenen Lösungen zu entfernen zentrifugieren. Verwenden Sie einen leeren Teller in der Zentrifuge für Gleichgewicht.

(5) Elektrophorese

1. Während sich die Platte dreht, öffnen Sie eine geführte Datei in der automatisierten westlichen Maschine angeschlossen Computer indem angibt, in der Dropdown-Liste-Seite von "Datei" zu einen Gesamt-Protein Assay laufen und auf den jeweiligen Ort.
2. Beschriften Sie die Proben von Brunnen in den Computer. Dann entfernen Sie die Platte aus der Zentrifuge entfernen Sie die Abdeckung und ziehen Sie vorsichtig den Aluminium-Deckel aus die Trennung Lösung Fächer.
3. Legen Sie die Platte in die automatisierte westlichen Instrument, ziehen Sie die Abdeckung von der Kapillare Patrone angezeigt, setzen Sie die Patrone in ihren vorgesehenen Platz und schließen Sie die Tür.
4. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen", und wenn Sie mit der Art des Tests ("Gesamt-Protein") aufgefordert werden, geben Sie den Namen der Proben (z. B. "entschärften 2-13 und Kolostrum grundiert 14-25"). Klicken Sie auf "OK", und wenn von aktivierten Laufdatum und ID-Nummer der Laufzeit-Datei aufgefordert werden, notieren Sie die Uhrzeit, zu der Flucht endet.
5. Am Ende des Laufs (170 min nach dem Start) öffnen Sie die Tür des Instruments, entfernen Sie die Kapillare Patrone und entsorgen Sie es in der Kleie zur Verfügung. Entsorgen Sie die Platte in die biologische Materie zur Verfügung.
6. Klicken Sie auf Trennung Kurven in der Seite "Analyse" der Laufzeit-Datei, und überprüfen Sie, dass alle Proben korrekt ausgeführt haben und verschiedene Protein-Kurven in alle Kapillaren zeigen.

6. Analyse von Signalproteinen

1. Fügen Sie in einer beschrifteten 1,5 mL Tube 0,003 mL Kaninchen anti-Antikörper Phospho-eIF2a (p-eIF2a hinzu) und hängen Sie es in 0,3 mL (1: 100 Verdünnung) in Antikörper aus dem geeigneten Detection Kit Verdünnungsmittel. Dann halten Sie es auf dem Eis.
2. Beschriften Sie ein Luminol-Rohr und fügen Sie 0,15 mL Luminol und 0,15 mL Wasserstoffperoxid aus dieser Erkennung Modul Kit und verzichten Sie 0,01 mL in Vertiefungen E1, E25 aus einer frischen, automatisierte westlichen Platte zu.
3. Verzichten Sie 0,01 mL des sekundären anti-Kaninchen-Antikörper in Vertiefungen D2, D25 zu, und 0,01 mL Streptavidin-HRP aus dem Kit auf gut D1.
4. 0,01 mL des primären Antikörpers (aus Schritt 6.1) in Vertiefungen C2, C25 zu verzichten, und Wells C1 und B1 bis B25 0,01 mL diluent 2 Antikörperlösung hinzufügen.
5. Lassen Sie die Zeile F Brunnen leer und füllen Sie 0,45 mL Waschpuffer in die 5 Fächer 3 Reihen unterhalb der F-Reihe.
6. Kurz drehen die gekühlten Proben für 3 s, und 0,003 mL jede Probe, Reihe A in der gleichen Reihenfolge, die sie für die Gesamt-Protein Assay, ab A2 bis A25 hinzugefügt wurden. Hinzugeben Sie 0,005 mL die biotinylierte MW Leiter auch A1 und die Abdeckplatte.
7. Zentrifugieren Sie die Platte, wie in Schritt 4.8 getan. Während sich die Platte dreht, (in der automatisierten Western-assoziierte Software- und Computer) öffnen Sie eine neue run-Datei und geben Sie in der Drop-down-Seite von "Datei", um eine Molekülgröße Assay ausführen indem Sie auf den jeweiligen Ort.
8. Geben Sie in der Test-Seite die Probennamen in jede Kapillare, dann geben Sie den Namen des primären Antikörpers in der zugewiesenen Stelle und der sekundären Anti-Kaninchen-Antikörper darunter.
9. Am Ende der Zentrifugation wiederholen Sie Schritte 5,3-5,5, außer die Bezeichnung für die geführte Datei diesmal "p-eIF2a auf ungestrichenen 2 – 13 und 14 – 25 Kolostrum grundiert" sein sollte.
10. Überprüfen Sie nach der Elektrophorese Trennung die geführte Datei für Immune Reaktivität Gipfeln der Antigene in Größen von 40 – 43 kDa. Wo MW der Gipfel dieser Größe fehlen, mit der rechten Maustaste unterhalb der Kurve und geben Sie in der Dropdown-Liste hinzufügen MW bis zum Gipfel, die sicherstellt, dass die Größe und beliebiger Anzahl unterhalb der Kurve aufgezeichnet werden.

7. Verarbeitung der Ergebnisse

1. Eine Tabellenkalkulationsdatei für Gesamt-Protein führen in die automatisierte Western Open Datei ausführen und bieten eine ID-Nummer.
2. Öffnen Sie die geführte Datei den Gesamt-Protein Assay auf der Seite "Analyse" auf die Kurve-Modus und markieren Sie alle Berge im einzelnen Kapillaren. Dann kopieren Sie und fügen Sie sie in der Kalkulationstabelle und Summe der Flächen unter der Kurve aller Peaks, die in der gesamten Kapillare aufgenommen.
3. Ordnen Sie in einer separaten Spalte die Gesamtmenge an Protein für jede Spalte mit Kapillar-Nummern, Namen von den jeweiligen Gehirn Kernen und die ID-Nummern der geführten Dateien.
4. Öffnen Sie eine Tabelle für das p-eIF2a-Antigen und in einer einzigen Spalte, nehmen Sie die Fläche unter der Kurve aus jede Kapillare Side-by-Side mit seinen jeweiligen Kapillare und Name des Gehirn Zellkern und ID-Nummer der Laufzeit-Datei auf.
5. Die Gesamt-Protein-Spalte (Parallel zu den p-eIF2a-Kurve-Mengen) in eine dritte Tabelle kopieren und compute-p-eIF2a:total-Protein-Verhältnis in einer dritten Spalte.
6. Erfassen Sie Ergebnisse aus Schritte 4 bis 6 für jedes Gehirn Kern, ordnen Sie sie in Gruppen von Kernen und generieren Sie ein Balkendiagramm zu.

Ergebnisse

Die repräsentative Bands Immunoreactivity bezogen auf Gesamt-Protein zeigen, dass es Gehirn Kerne mit sehr niedrigen geschlagenem Eiweiß. Dies erfordert die Verwendung der automatisierten Western-Blot-Technik, die sehr empfindlich im Vergleich zu den kanonischen Western-Blot ist. Dieser Ansatz kann mit fortyfold weniger Protein pro Kapillare im Vergleich zu der pro-Spur in Western Blots ausgeführt werden.

Differentielle Effekte ...

Diskussion

Eine Technik zur Mikrodissektion von diskreten, OTR-reiche Gehirn Kerne im neonatalen Rattengehirn wird in diesem Papier präsentiert. Es ist bekannt, dass Neuronen hoch, sogar innerhalb von gut charakterisierten Kerne im Gehirn spezialisiert sind. Diese hoch reproduzierbare Herangehensweise an bestimmte OTR-reiche Kerne isolieren kann robuste Hypothesentests. Verwendung von automatisierten Western blotting, waren die Konsistenz und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse weiter verbessert. Während eine Einschränkung dieser ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50