新生儿初乳喂养前后离散催产素分泌脑核细胞应激与炎症的评估

摘要

在这里, 我们提出了一个方案, 以分离脑核在新生大鼠大脑与第一初乳喂养。这项技术允许研究由肠细胞信号调节的大脑营养功能不足应激。

摘要

该方案的目标是在首次初乳喂养前后分离新生儿大脑中富含催产素受体的大脑细胞核。已知对代谢应激有反应的蛋白质的表达是在脑核分离株中使用西方印迹进行的。这样做是为了评估代谢应激引起的体内营养功能不全是否引发神经元应激。我们以前已经证明, 新生儿营养不足会引起肠道的代谢压力。此外, 初乳催产素可调节新生大鼠肠道绒毛首次进食前后的细胞应激反应、炎症和自体吞噬标志物。与内质网应力相关的信号蛋白标记 [er 伴侣结合免疫球蛋白蛋白 (bip)、真核翻译起始因子 2a (eif2a) 和 eif2a 激酶蛋白激酶 r (p-pkr)] 以及2炎症信号蛋白 [核因子-b (nf-kb) 和抑制剂 b (ikb)], 在新生脑核 [孤立道 (nts)、旁细胞核 (pvn)、超视核 (son)、皮层 (cx)、纹状体 (str) 和在第一次喂养 (初乳未启动) 之前和护理开始后 (由初乳启动) 之前的内侧视前细胞核 (mpo)。在未启动和下调的 nts 组织中, bip-grp78 和 pe-eif2a 的表达得到了抑制。nf-行在 cx、str 和 mpo 细胞质中保留 (高), 而 nf-kob 在 nts、pvn 和 son 中均较低且不变。集体 bip 和 p-eif2 的发现与应激反应是一致的。eif2a 在 son、cx、str 和 mpo 中由 dsrna 依赖性激酶 (p-pkr) 磷酸化。然而, 在 nts (在较小程度上在 pvn 中), eif2a 被另一种激酶磷酸化, 一般控制非接触-2 激酶 (gcn2)。以前在新生儿肠道细胞中观察到的压力调节机制似乎反映在一些富含 otr 的大脑区域。nts 和 pvn 可利用其他地区不同的磷酸化机制 (营养不足下), 并可耐火性的营养不足的影响。综合来看, 这些数据表明, 大脑对营养功能不全应激的反应被来自牛初启动的肠细胞的信号所抵消。

引言

与我们对产后白天至几周大脑早期发育的理解不同, 对老鼠生命最初几个小时发生的无数动态变化的了解相对较少。一个关键的挑战是新生大鼠大脑体积小, 以及需要高科技工具来分离离散的大脑区域或单个细胞。研究通常评估基因转录, 而不是翻译^1,2, 这不能使一个坚实的理解功能水平的激活信号分子。另一些人使用免疫组织化学来检查表达, 以参考大脑区域, 这不允许量化表达水平³。到目前为止, 还没有研究过与大鼠在离散大脑区域的第一初乳饲料相关的信号通路的激活, 这需要用西方方法快速分离和牺牲和测量蛋白质表达和蛋白质磷酸化杂交。虽然大脑微解剖是在年龄较大的大脑上进行的, 但我们还没有确定在 p0 大脑中进行非单细胞脑拳的参考。本文提出了一种利用相对低技术的打孔技术和西方印迹技术分离新生儿大脑受限区域的方法, 以测量相对较小样本中的蛋白质表达。该协议可能适用于需要评估任何物种小大脑的相对受限区域的蛋白质表达和翻译后修饰 (例如磷酸化) 的研究问题, 前提是用户可以通过地图集和可识别的地标直观地识别感兴趣的大脑区域。

这项技术是为了了解新生大鼠的第一牛初乳饲料所发生的变化而开发的, 这种饲料富含催产素 (ot)。长期以来, ot 一直以其刺激牛奶脱床和子宫收缩的能力而闻名。然而, ot 现在被认为在调节许多身体功能和行为方面发挥着广泛的作用^.例如, ot 反对压力和炎症, 再加上适应性从属行为⁵, 延迟胃排空, 减缓肠道转运。ot 受体 (otr) 已被鉴定在肠内神经元和肠道上皮 6^{, 7,8.}ot 对婴儿产后早期的胃肠道效应尤为重要。例如, 母乳喂养与向新生儿^{肠道9、10 提供}大量 ot 有关, 数据显示, 在牛奶乳汁期间, otr 在十二指肠绒毛中严重过度表达.

利用肠道细胞系进行的体外实验在细胞水平上证明, 催产素调节了压力信号通路^11、12中的重要分子, 并在蛋白质的转化中发挥了调控作用¹². 这些研究表明, 牛奶的成分, 包括来自母亲的外源性催产素, 对新生儿展开的蛋白质反应非常重要, 以减少细胞压力 13.

体内和体外研究表明, 牛初乳 ot 调节新生大鼠肠道绒毛的细胞应激反应、炎症和自体吞噬标志物。当肠道同时暴露在14天初乳^{14、15 和}许多蛋白质中的母亲的微生物群中时, 新生儿肠细胞的腔侧承受着巨大的细胞压力, 其中包括 ot⁹等激素^,10,16岁

ot 对大脑的影响已经研究了¹⁷。然而, 在产后早期肠道中显示的 ot 信号机制还没有在大脑中得到研究。本文采用电泳方法对新生大鼠脑干和下丘脑离散脑核进行了隔离。这种方法的总体目标是捕捉大脑区域的细胞信号状态, 尽可能接近出生, 在第一次牛奶乳汁之前和之后, 在胶质神经元指数最低的脑组织中。开发这项技术的理由是, 它可以快速分离新生幼崽中受限制的、微观的大脑区域, 并使用西方的自动印迹进行更均匀的神经元收集, 用于体外研究方法, 在相对较小的解剖样本上提供高度一致的结果。先前工作的一个缺点包括更多的严重解剖 (大脑切片或整个大脑) 和年龄较大的动物 18,¹⁹。幼崽的大脑是令人难以置信的动态, 具有出生后的胶质分化波。为了研究幼崽首次进食对大脑变化的影响, 有必要研究具有可重复解剖的受限神经元核。

牛奶饲料通常被分析它的免疫学和营养对健康或基因表达的影响 (例如, 在肠细胞^20,21), 而它的影响对大脑区域在脑子发展过程中很少被研究。结合肠道胆囊激素受体对脑干核的迁移, 而不是细胞内信号通路 22, 分析了牛奶在肠道中的转运对大脑功能^的影响。关于发育中的新生儿大脑在^{怀孕 23岁}期间容易营养不良, 母亲营养不良的文献很多, 但压力和炎症信号没有得到解决。重要的是, 目前的方法利用了一种现象, 在一天零大鼠新生儿分离血液出生的牛初乳刺激从迷迷神经中继的内脏刺激。这就是所谓的应力低反应期, 其特征是出生后立即未成熟的孤束核 (nts)-下丘脑电路 24^, 25 限制 nts, 室旁核 (pvn),超视核 (son) 信号到血液出生的刺激。

这种方法对于分析多种信号通路和相对限于神经元细胞是有用的, 前提是在大鼠产后第0天采集脑组织, 以及母亲是否受到任何形式的治疗在怀孕期间。可以分析垃圾对初乳饲料与预喂养信号的影响。当比较大脑区域与蛋白质产量低或丰富的蛋白质产量之间的信号时, 这种方法使毛细血管内确定毛细血管中多肽带的总蛋白与蛋白质抗原的免疫定量平行。该方法可以使用任意单位对没有标准定量曲线的相同抗体获得的结果进行定量比较, 并参照每毛细管的总蛋白。只有使用定量的标准曲线, 才有可能对不同抗体获得的结果进行比较。

这种方法可以评估肠道和大脑之间发生的双向信号, 这可以影响两个器官26的功能.催产素与食物摄入之间的联系,^近年来已被广泛研究 27, 支持增加催产素信号和营养供应之间的联系。这些研究也支持相反的概念, 即能量不足与下丘脑催产素信号的减少相结合。

早期对 ot 对大脑活动的影响的研究表明, 诱导的肠道炎症引起下丘脑 pvn、杏仁核和梨形皮质的 cfos 转录, 可难治性于迷走神经切开术²⁸。然而, 全身输注 ot 与分泌物减少脑 cfos 反应引起的炎症反应在肠道²⁸。这表明外源 ot 的作用是通过迷速继电器以外的途径进行的, 可能是通过 6^,29后携带的血液传播信号分子进行的。

在这项研究中, 对此前在肠道中观察到的细胞应激信号通路进行了大脑评估。假设是, 牛奶成分可以保护或推迟炎症对肠道对微生物和其他代谢物的渗透性的影响, 进而对大脑功能的影响。在¹³例牛初乳启动前后发现的 ikb 与 bi-p 信号的明显拮抗差异表明, 仍在发育过程中的新生儿大脑可能会感觉到这些牛初乳诱导的肠道信号。

测量了以往肠道实验中使用的与内质网应力相关的信号蛋白标记。它们包括 er 伴侣 bip、翻译起始因子 eif2a (用作应激反应积分器³⁰)、eif2a 激酶 p-pkr 和两种炎症信号蛋白 (nf-kb 及其抑制剂 ikb)。

根据成人分泌或反应 ot 的能力, 选择了六个大脑区域。nts 位于上髓质, 是内脏输入的第一个中继, 通过相邻的区域后雷马32接收来自肠道内迷变神经感觉神经元的直接信号, 可能还有血液出生的细胞因子、毒素和激素.pvn、视上核 (son)、纹状体核 (str)、大脑皮层 (cx) 和内侧视前核 (mpo) 通过 nts 接收来自肠道的信号。

结果表明, nts 在初乳启动前和首次喂养后立即发生的产后细胞应激反应与 pvn 和 son 不同。cx、str 和 mpo 中的信令也不同于 pvn 和 son。先前显示的调节肠道细胞压力和炎症的 ot 的独特保护功能很可能是大脑某些区域所能感觉到的。总体而言, 数据表明, 在细胞水平上, 在出生后的最初几个小时内, 大脑会对与营养功能不足相关的代谢压力做出反应。数据还显示, 牛初乳饲料调节效果的范围和方向是区域依赖性的, 在一些地区, 它们反映了以前在肠道中显示的 ot 效应。

研究方案

这项研究得到了哥伦比亚大学动物护理和使用机构委员会和纽约州精神病研究所的批准。

1. 组织制备

1. 从供应商处订购怀孕的老鼠。
2. 跟随定时怀孕的老鼠, 观察它们到达后的几周内生长的腹部, 然后在预期的分娩日期通过每2小时检查一次笼子, 直到分娩开始, 寻找幼崽。
3. 在未引物的幼崽 (在观察腹部时没有明显的白色乳腹) 之前, 或在为前提狗 (此时在它们的腹部可以看到白色的胃) 的第一次喂养之后, 用戴手套的手抓住幼崽的尾巴, 然后将它们的腹部看到(图 s1)。
   注: 第一个初乳饲料被称为启动小狗;因此, 小狗在第一次饲料之前是不准备的, 之后它们被牛初吸。
4. 使用锋利、干净的手术剪刀快速斩首未麻醉的小狗。
5. 通过将头骨中线和顶部表面的皮肤切割到鼻子来切除大脑。然后, 使用钳子轻轻撬开骨头, 露出大脑 (图 1B), 并将其定位, 在取出骨板时用笔将其标记为 "bregma" (图 1 b)。
6. 在室温下快速将整个大脑放置在聚甲基丙烯酸甲酯脑模中, 以便在室温下进行冠状切片 (图 1c)。
7. 使用新鲜的剃须刀片, 立即制作500毫米厚的薄片。将切片在培养皿中与尾端一起放置, 以保持切片的方向 (图 2)。
8. 在不葡萄糖的情况下快速添加人工脑脊液 (acsf; 1.0mm kh po₄, 26 mm nahco 3, 118.6 mm nacl, 3.0 mm kcl, 203.3 mmmmmmmgcl 2-6h2o)_,并在28-30 下孵育切片 60分钟, 在2-30°c 下不断搅拌眼眶振动台对代谢和差异的挑战是未启动的组织与牛耳吸体组织。
9. 识别大脑核, 需要打孔使用大脑地图集³³和解剖地标上的组织部分。将这个切片与感兴趣的细胞核放在培养皿中, 并将其移动到解剖显微镜上。
10. 一旦可视化, 使用取心工具快速打出6个不同原子核中的 4个, 选择大小以最好地打孔有问题的原子核, 并在样品之间保持一致 (图 2)。
    注意: 剩下的大脑切片现在将有一个脑组织被切除的洞。在这项研究中, 我们使用下面的坐标切除了以下原子核。所有前后路 (a) 坐标均来自布雷马 (nts 除外, 它参照了卡拉穆斯·斯伯里图)。所有背腹侧 (d/v) 坐标都来自皮层表面 (nts 除外, nts 是从髓质表面)。以下坐标包括阿普、内侧侧向 (m/l) 和 dm:1) 孤立道核 (nts, a/p, 0.4 至 0.8;l, ±0.2;dv, 0.3 (来自髓质的表面), 2) 副室核 (pvn,-0.8; ±0.2; 0), 3) 超视核 (son,-1.1; ±1.4; 4.3), 4) 皮层 (cx, 部分皮层面积 1,-2.8; ±1.5; 0.6), 5) 纹状体核 (str, 0.0; ±1.6; 1.8) 和 6) 内侧视前核 (mpo,-0.6; ±0.2; 4.2)。
11. 快速将被打孔的细胞核浸泡在 0.06 ml 的冰凉、含有蛋白酶抑制剂的蛋白质提取缓冲液和磷酸酶抑制剂中, 时间为 60分钟 (见步骤 2.3)。

2. 蛋白质提取

1. 在预期的小狗交付前一天, 使用蛋白质裂解试剂盒 (材料表) 准备蛋白质提取溶液。
2. 解冻 (冰上) 裂解蛋白酶和磷酸酶抑制剂的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷冻 (-20°c) 水溶液, 并将蛋白酶磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液和 dmso 溶液放在冰上。
3. 在干净、冰冷的15毫升管中加入1.85 毫升的裂解缓冲液。然后, 加入 0.1 ml 的水溶液的抑制剂和0.05 毫升的 dmso 溶解抑制剂。最后, 盖上盖子, 短暂旋涡管, 并将其保持在-20°c, 直到使用。
4. 标签24清洁微离心管 (每个0.5 毫升) 的裂解过程。为牛初乳未引物组 (u) [6个左 (l) 和6个右 (r) 脑核] 指定每个大脑12个管, 并根据核心首字母缩写词、侧面和条件 (例如, nts-l-u、nts-r-u等) 进行标记。为第二组12管贴上牛初乳底漆样品的标签。
5. 标记两套额外的管, 如步骤2.4 所做的股票蛋白提取物 (使用 1.5 ml eppendorf 风格的管) 和第一套样品制备 (使用 0.5 ml 管)。将这些管子放在两个单独的、有标签的冷冻箱中 (每个都是为100个管设计的)。一个盒子将用于未装药的样品, 另一个盒子将用于底漆的样品。
6. 在小狗交付的当天在冰上解冻裂解溶液, 在 acsf 中孵育脑切片时, 将 aliquot 0.06 ml 裂解溶液放入裂解程序管 (从步骤2.4 开始) 中, 并在冰中添加细胞核和孵育60分钟。
7. 在 14000 rpm (10, 000 x g) 的冷却微型离心机中离心孵育的裂解核 30分钟, 并用适当设置的移液器仔细地抽吸 0.055 ml 的上清液。将上清液转移到预冷 1.5 ml 库存管 (从步骤2.5 开始), 并将其放在冰上。在冷冻 (在-20°c) 之前, 将 0.12 ml 的上清液转移到 0.5 ml 预冷管中, 用于第一次样品制备 (从步骤2.5 开始), 并将其留在冰上。

3. 毛细管内蛋白质测定的样品制备

1. 使用试剂盒, 并根据制造商的指示准备分离试剂。在含有0.012 毫升蛋白质提取物的冰上的 0.5 ml 标记管 (从步骤2.5 中) 中的12个样品中, 分别加入 0.003 ml 的主混合试剂。
2. 将加热块打开至 95°c, 并将步骤3.1 中制备的试剂在具有0.016 毫升去离子水的管内的生物素化分子量 (mL) 阶梯中加入 0.004 ml。为了使梯子和样品变性, 将梯子管和12个未引物蛋白提取物样品放在95°c 的热块中 5分钟, 并将其保存在 4°c, 直到使用。
3. 重复步骤2.0 至 3.2, 从蛋白质提取到样品制备, 从牛初引物大鼠的细胞核。

4. 电泳准备

1. 解冻工作台上的生物素标签试剂 (储存在- ^{80°c 的}深冰柜中), 并按照制造商的指示, 在4°c 的冰上制备蛋白质检测试剂盒。
2. 将0.15 毫升的发光醇与0.15 毫升的过氧化物混合, 并将 0.01 ml 混合成25口井 (e 排, 1-25 口), 用于自动化的西方机器。将链球菌-hrp 从试剂盒装入 d1 至 d25 井中, 重量为0.008 毫升
3. 将抗体稀释液的0.01 毫升加载到 c1 至 c25 和 b1 的井中。
4. 将24个蛋白质样本和梯子管短暂旋转 (2-3秒), 在微型离心机中将蒸发的水从管盖中倒下来。
5. 将12个未底漆样品的0.003 毫升装入 a2 至 a13 井, 将12个牛初修复样品的 0.003 ml 装入 a14 至 a25 井, 将生物素化阶梯的 0.005 ml 装入 a1 井。
6. 将 f 排空载0.45 毫升的洗涤缓冲液放入 f 排以下3行的5个隔间中的每一个. 用塑料盖覆盖板, 以避免在剩余的过程中蒸发。
7. 将解冻后的生物素标记试剂简要旋涡, 并在指定管中加入0.15 毫升的试剂;然后在其中加入0.15 毫升的总蛋白试剂, 并将其混合到均匀性。
8. 从板材上取下盖子, 将剂1和2的 0.01 ml 装入 b2 至 b25 井。将板材盖上, 以 1, 000 x 克的速度将其盖上 10分钟, 以去除各种溶液中的气泡。在离心机中使用一个空盘子来平衡。

5. 电泳

1. 在平板旋转时, 在自动西方机器连接的计算机中打开一个运行文件, 方法是在 "文件" 的下拉页中指示运行总蛋白质检测, 然后单击相应的位置。
2. 在电脑上用注释好样品。然后, 从离心机上取下板, 取下盖子, 小心地从分离溶液隔间上剥落铝盖。
3. 将板材放入自动化的西方仪器中, 从毛细管墨盒盒上剥下盖子, 将墨盒插入指定位置, 然后关上门。
4. 单击 "run" 按钮, 当提示检测的类型 ("总蛋白") 时, 键入样品的名称 (例如, "未启动2-13 和牛初引物 14-25")。单击 "确定", 当运行文件的激活运行日期和 id 号提示时, 记下运行结束的时间。
5. 在运行结束时 (启动后 170分钟), 打开仪表门, 取出毛细管墨盒, 并将其丢弃到锐器处理中。丢弃在生物物质处理中的板材。
6. 单击运行文件的分析页中的分离曲线图标, 并检查所有样本是否都已正常运行, 是否在所有毛细血管中显示了多个蛋白质曲线。

6. 信号蛋白分析

1. 在标记的 1.5 ml 管中, 加入0.003 毫升的兔抗磷-eif2a (p-eif2a) 抗体, 并将其悬浮在抗体稀释剂中的 0.3 ml (1:100 稀释) 中, 从合适的检测试剂盒中提取。然后, 把它放在冰上。
2. 标记发光管, 并在此检测模块套件中添加 0.15 ml 的发光醇和 0.15 ml 过氧化物, 并将 0.01 ml 放入新鲜的自动化西方板的 e1 至 e25 井中。
3. 将二级抗家兔抗体0.01 毫升放入 d2 至 d25 井中, 从试剂盒中加入0.01 毫升的链球菌-hrp。
4. 将原代抗体的0.01 毫升 (从步骤 6.1) 放入 s2 至 c25 井, 并在 c1 和 b1 至 b25 口子中加入0.01 毫升抗体稀释剂2溶液。
5. 将行 f 井留空, 并将0.45 毫升的洗涤缓冲液填充到 f 行下方3行的5个隔间中。
6. 将冷藏样品短暂旋转 3秒, 并按从 a2 到 a25 的总蛋白测定中添加的相同顺序将每个样品添加 0.003 ml 到行 a。加入0.005 毫升的生物素化 mL 梯子, 使 a1 井覆盖板。
7. 按照步骤4.8 中的步骤进行离心。在旋转的时候, 打开 (在与西方相关的自动化软件和计算机中) 一个新的运行文件, 并在 "文件" 的下拉页面中通过单击相应的位置来运行分子大小分析。
8. 在检测页中, 在每个毛细管中键入样本名称, 然后在分配的位置和其下方的二级抗兔抗体中键入原代抗体的名称。
9. 在离心结束时, 重复步骤 5.3-5.5, 但这次给运行文件的名称应该是 "在未启动的2-13 和牛初启动14-25 上的 p-eif2a"。
10. 电泳分离后, 检查 40–43 kda 大小的抗原免疫反应峰的运行文件。如果缺少此大小的峰值的 mw, 请右键单击曲线下方, 并在下拉列表中指示将 mw 添加到峰值, 从而确保记录曲线下方的大小和任意数量。

7. 处理结果

1. 打开电子表格文件, 在自动西方运行文件中运行总蛋白, 并提供 id 号。
2. 在曲线模式的分析页上打开总蛋白检测的运行文件, 并标记单个毛细血管中的所有峰值。然后, 将它们复制并粘贴到电子表格中, 并将整个毛细管中记录的所有峰曲线下的区域求和。
3. 在单独的列中, 用毛细管数、各自大脑核的名称以及运行文件的 id 号排列每个列的蛋白质总量。
4. 打开 p-eif2a 抗原的电子表格, 并在单个列中记录每个毛细管的曲线下的区域及其各自的毛细管数、大脑细胞核名称和运行文件的 id 号。
5. 将总蛋白质列 (与 p-eif2a 曲线量平行) 复制到第三个电子表格中, 并计算第三个电子表格中的 p-eif2a: 总蛋白质比率。
6. 收集每个大脑核的步骤4到6的结果, 将它们排列成原子核组, 并生成条形图。

结果

免疫反应带相对于总蛋白质表明, 有大脑细胞核的收获蛋白很低。这就需要使用西方的自动印迹技术, 与典型的西方印迹相比, 这种技术非常敏感。与西方印迹中的每车道相比, 这种方法可以用每毛细管少四倍的蛋白质运行。

初乳启动对脑核 bip 水平的差异效应

大鼠大脑的冠状部分是?...

讨论

本文介绍了一种在新生大鼠脑内对离散、富 or 脑核进行微解剖的技术。人们公认, 神经元是高度专业化的, 即使在大脑中的良好特征的细胞核内也是如此。这种高重现性的方法可以分离出特定的富含 otr 的原子核, 从而能够进行可靠的假设检验。利用西方的自动印迹, 进一步提高了结果的一致性和重现性。虽然这种技术的局限性仍然是适度的大脑冲床变异性;这项技术代表了比单细胞、整个大脑或大?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bradford solution	Bio Rad
Protein lysis kit	Protein simple	CBS403	Bicine/CHAPS
WES kits	Protein simple	WES-Mouse 12-230 master kit (PS-MK15), WES-Rabbit 12-230 master kit (PS-MK14), WES 12-230 kDa total Protein master kit (PS-TP07)
anti-mouse IgG HRP conjugate	Protein simple
Rabbit anti-phospho-eIF2a	Cell Signaling technology	SER51, 9721
mouse mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	2103
Rabbit anti-phospho-PKR	Millipore	Thr451, 07-886
Rabbit mAb anti-PKR	Cell Signaling technology	12297
rabbit mAb anti-GAPDH	Cell Signaling technology	2118
mouse mAb anti-phospho-IKB	Cell Signaling technology	9246
mouse mAb anti-IKB	Cell Signaling technology	4814
rabbit anti-BiP	Cell Signaling technology	3183
Rabbit anti GCN2	Cell Signaling technology	3302
Rabbit mAb anti-phospho-GCN2	BIORBYT	T899
pregnant Sprague-Dawley rats	Charles River Laboratories
Punch device	WellTech Rapid Core or Harris Uni-Core	0.35, 0.50, 0.75, 1.0, 1.20, 1.50